CN108884488A - 基因检测方法及基因检测试剂盒 - Google Patents

基因检测方法及基因检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供：在基因检测方法中能够在保持灵敏度的同时防止假阳性和堵塞、对被检测物进行高精度的检测或定量的方法；以及在这样的方法中使用的试剂盒。即，本发明提供一种基因检测方法，其特征在于，利用过滤用过滤器对包含被检测物的试样进行过滤，然后对前述试样中的被检测物的存在进行检测或定量。在特定的实施方式中，本发明的基因检测方法及试剂盒使用烧结过滤器作为过滤用过滤器。

Description

基因检测方法及基因检测试剂盒
技术领域
本发明涉及基因检测方法及基因检测试剂盒。
背景技术
已知各种基因检测方法(例如，非专利文献1及专利文献1)。基因检测所使用的试样中会混入各种物质。这些混入物可能会影响检测方法而使灵敏度降低，或者可能导致假阳性等的结果，甚至可能成为用于检测的设备的故障(例如流路系统堵塞)原因。以往，为了去除该混入物而使用离心分离法等，但需要专用设备，操作烦杂且需要时间。
专利文献2公开了一种检测方法，对于使用意在利用具有特异性结合能力的捕捉试剂(例如针对特定抗原的抗体等)进行检测的膜层析法的检测方法，能够在保持灵敏度的同时防止假阳性、堵塞，对被检测物进行高精度的检测或定量。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2009-148245
专利文献2：日本特开2008-122372
非专利文献
非专利文献1：刊登于日本专利局主页、标准技术集“核酸的扩增和检测”(刊登日：2001年8月28日)
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供：在基因检测方法中能够在保持灵敏度的同时防止假阳性和堵塞、对被检测物进行高精度的检测或定量的方法；以及在这样的方法中使用的试剂盒。
用于解决问题的方案
本发明人发现，在基因检测方法中，利用过滤用过滤器对包含被检测物的试样进行过滤，然后对前述试样中的被测定物的存在进行检测或定量，从而能够解决上述技术问题，完成了本发明。
即，本发明的概要如下。
[项1]一种基因检测方法，其特征在于，利用过滤用过滤器对包含被检测对象的试样进行过滤，然后对前述试样中的被检测对象的存在进行检测或定量。
[项2]根据项1所述的基因检测方法，其中，过滤用过滤器为烧结过滤器。
[项3]根据项2所述的基因检测方法，其中，烧结过滤器的原材料选自由聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯及聚甲基丙烯酸甲酯组成的组。
[项4]根据项2所述的基因检测方法，其中，烧结过滤器的孔径为10～100μm。
[项5]根据项1所述的基因检测方法，其中，不需要进行基于离心分离的前处理。
[项6]根据项1所述的基因检测方法，其中，使用棉棒或拭子作为检体收集器具收集包含被检测对象的检体，将其作为试样用于测试中。
[项7]根据项6所述的基因检测方法，其中，检体为生物试样。
[项8]根据项7所述的基因检测方法，其中，检体为选自由人或其它动物的口腔内擦拭物、咽擦拭液、鼻腔擦拭液、鼻腔吸取液、鼻腔清洗液、肺泡清洗液、粪便悬浮液、直肠擦拭液、阴道分泌物、宫颈管粘液、及尿道擦拭物组成的组中的检体。
[项9]根据项8所述的基因检测方法，其中，能够通过对被检测对象的存在进行检测或定量来检验的事项为呼吸系统感染症的病原微生物或来自所述微生物的物质。
[项10]根据项9所述的基因检测方法，其中，能够通过对被检测对象的存在进行检测或定量来检验的事项为选自由流感病毒、RS病毒、腺病毒、A族链球菌、肺炎支原体、百日咳杆菌、及肺炎衣原体组成的组中的病原微生物或来自所述微生物的物质。
[项11]根据项8所述的基因检测方法，其中，能够通过对被检测对象的存在进行检测或定量来检验的事项为腹泻的病原微生物或来自所述微生物的物质。
[项12]根据项11所述的基因检测方法，其中，能够通过对被检测对象的存在进行检测或定量来检验的事项为选自由诺如病毒、轮状病毒、札幌病毒及腹泻腺病毒组成的组中的病原微生物或来自所述微生物的物质。
[项13]根据项8所述的基因检测方法，其中，能够通过对被检测对象的存在进行检测或定量来检验的事项为性传播疾病的病原微生物或来自所述微生物的物质。
[项14]根据项13所述的基因检测方法，其中，能够通过对被检测对象的存在进行检测或定量来检验的事项为选自由淋球菌、衣原体、支原体、脲原体、HIV及HPV组成的组中的病原微生物或来自所述微生物的物质。
[项15]根据项8所述的基因检测方法，其中，能够通过对被检测对象的存在进行检测或定量来检验的事项为人基因多态性的检测。
[项16]根据项15所述的基因检测方法，其中，能够通过对被检测对象的存在进行检测或定量来检验的事项为选自由药物代谢酶基因的基因多态性、醇脱氢酶基因的基因多态性、乙醛脱氢酶基因的基因多态性、及亚甲基四氢叶酸还原酶基因的基因多态性组成的组中的人基因多态性。
[项17]根据项1～16中任一项所述的基因检测方法，其中，过滤用过滤器由孔径不同的多个过滤器重叠构成。
[项18]根据项17所述的基因检测方法，其中，使包含被检测对象的检体试样首先通过具有最大孔径的过滤器，然后通过具有相对小孔径的过滤器。
[项19]一种基因检测试剂盒，其用于检测检体试样中的被检测对象的存在，所述基因检测试剂盒包含：
(1)检体试样用过滤管，所述检体试样用过滤管具备由包含烧结过滤器的过滤器构成的过滤用过滤器。
[项20]根据项19所述的基因检测试剂盒，其中，还包含棉棒或拭子作为检体收集器具。
[项21]根据项19所述的基因检测试剂盒，其中，还包含填充有基因检测试剂的容器，所述基因检测试剂能够对被检测对象的存在进行检测或定量。
发明的效果
在使用本发明的方法或装置对检体试样中的被检测对象进行检测/定量时，即使检体为口腔内擦拭物、咽擦拭液、鼻腔擦拭液、鼻腔吸取液、肺泡清洗液、阴道分泌物、宫颈管粘液、尿道擦拭物等的含有较多杂质的检体，也能够通过检体收集器具和/或过滤用过滤器在不减少检体量的情况下去除杂质。其结果是，能够不受杂质影响地得到正确的结果。另外，根据本发明，由于无需进行基于离心分离法的前处理，因此不再需要进行离心分离时所必需的专用设备、操作步骤，能够更简便地在短时间内得到正确的结果。
附图说明
图1是示出实施例1的淋病奈瑟菌的基因检测结果的图。
图2是示出实施例2的百日咳杆菌检测中的内部对照的检测结果的图。
图3是示出实施例3中的肺炎支原体的基因检测结果(使用孔径各异的烧结过滤器及膜滤器时的对比)的图。
图4是示出实施例3的肺炎支原体检测中的内部对照的基因检测结果(使用孔径各异的烧结过滤器及膜滤器时的对比)的图。
图5是示出实施例4中的肺炎支原体的基因检测结果(烧结过滤器与离心分离法的对比)的图。
图6是示出实施例5中甲型流感基因的实时RT-PCR分析结果的图。
图7是示出实施例6中粪便试样中所含的诺如病毒RNA的检测结果的图。
图8是示出本发明的一个实施方式的基因检测试剂盒的构成的图。
具体实施方式
本发明的实施方式之一是一种基因检测方法，其特征在于，利用过滤用过滤器对包含被检测对象的试样进行过滤，然后对前述试样中的被检测对象的存在进行检测或定量。另外，具体而言是一种基因检测方法，其特征在于，使用收集器具收集被检对象，然后将包含该被检对象的收集器具放入容器中而悬浮于容器内的液体，然后从容器取出收集器具，将本发明的过滤器安装在容器上，使容器内部的液体通过过滤器并向容器外溶出，对该溶出液中的被检测对象的存在进行检测或定量。
本发明中，对基因检测方法不作特别限定，例如只要是能够以基因的序列信息为依据检测疾病、感染等的方法即可。具体而言，可列举例如以下方式：从试样检测出的特定感染源或疾病所特有的碱基(例如DNA、RNA等)的部分序列、或者检测出多态性(例如单核苷酸多态性(SNP))。
对前述基因检测方法中使用的检测原理不作特别限定，可以使用各种公知的方法，例如利用等位基因特异性引物的PCR法、变性梯度凝胶电泳法、SSCP法、RFLP法、TaqManPCR法、侵染法、使适当的探针(例如Q探针)与用PCR等方法扩增后的试样杂交并进行解链曲线分析的方法等。
本发明中，对被检测对象不作特别限定。可列举例如：基因组、结构基因、调控基因、基因转录产物(mRNA或其前体等)或存在于它们的片段等的一部分中的特定的核酸、特定的寡核苷酸部分、特定的多聚核苷酸部分等。它们可以是DNA、RNA中的任一种，也可以是两者的嵌合体。
包含前述被检测对象的试样既可以是从生物体等收集的(例如包含被检测对象的检体本身)，也可以是通过某种手段而使前述检体中所含的DNA、RNA等进行了复制或扩增等的试样。对复制或扩增中所使用的方法不作特别限定，可以使用PCR法、SDA法、ICAN法、LAMP法等各种公知的方法。
另外，包含前述被检测对象的试样还可以是通过某种物理化学手段对前述检体中所含的DNA、RNA等进行了修饰或经分解等而成的试样。
在前述中，在用PCR法进行DNA的复制或扩增时，虽然不作特别限定，但优选使用α型的DNA聚合酶(或属于B家族的DNA聚合酶)，进一步优选使用KOD DNA聚合酶。如果使用这些DNA聚合酶，则不需要从试样中提取或纯化DNA、仅通过简便的过滤操作就能够对被检测对象的存在进行检测或定量。
此外，在前述中，在通过RT-PCR法进行RNA的检测时，虽然不作特别限定，但优选使用PolI型的DNA聚合酶(或属于A家族的DNA聚合酶)，进一步优选使用具有逆转录活性的Tth聚合酶。如果使用这些DNA聚合酶，则不需要从试样中提取或纯化RNA、仅通过简便的过滤操作就能够对被检测对象的存在进行检测或定量。
本发明中，使用过滤用过滤器对包含被检测对象的试样进行过滤。就过滤用过滤器而言，为了防止基因检测装置中的硅胶单块等的孔堵塞、假阳性及过滤用过滤器本身的孔堵塞，不仅可以使用1种，而且还可以将若干个材质各异、孔径或截留粒径各异的过滤用过滤器组合，但本发明中必须包含至少1种过滤用过滤器。
作为前述过滤用过滤器，不作特别限定，优选使用烧结过滤器。对烧结过滤器的原材料不作特别限定，优选选自由聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯及聚甲基丙烯酸甲酯组成的组。
前述过滤用过滤器优选为相对于来自外部的力不易变形的过滤器(强刚性过滤器)。
例如，在过滤管中加入悬浮于检体悬浮液的检体试样，使其通过安装在前端的包含强刚性过滤器的过滤用过滤器而进行过滤，将滤液滴加到添加有基因检测试剂的容器(例如管等)等中时，过滤器会承受过滤管内的检体试样等液体、空气的压力。或者，如果管为有弹力的原材料，则由于人直接用手挤压容器而承受压力。此时过滤器有可能在厚度方向被压扁、发生弯曲等的变形，这些现象成为堵塞过滤器内部的滤液流路、过滤器本身发生孔堵塞的原因。本发明中使用的过滤用过滤器优选为有刚性的过滤器，所述刚性是指：向过滤管中加入悬浮于检体悬浮液的检体试样，使其通过安装在前端的包含强刚性过滤器的过滤用过滤器而进行过滤，将滤液滴加到添加有基因检测试剂的容器(例如管等)等中时，过滤器的厚度方向不易被压扁或不易发生弯曲等变形。换言之，优选为具有如下刚性的过滤器，所述刚性为：在滤液的压力下不易堵塞过滤器内部的滤液流路。
前述过滤用过滤器由于不易变形而不易发生孔堵塞。另外，能够进行层叠或将厚度较厚地加工为数mm～数cm程度，由此能够增大有效过滤面积，因此不易发生孔堵塞。
过滤器具备厚度方向不易被压扁的刚性是指：例如，即使在通过对检体试样进行过滤时的液体、空气施加于过滤器的压力超过0.2[MPa]，相对于过滤之前，过滤时的厚度变化量也达不到5％以上，优选达不到2％以上；另外，具备不易发生弯曲等变形的刚性是指：即使施加与上述同样的压力，过滤时的过滤器的曲率半径也达不到2cm以下。
作为前述过滤用过滤器，可列举出：卷绕各种金属纤维而成的过滤器；使用金属纤维无纺布的过滤器；使塑料发泡而成的过滤器；将金属网重叠为层状而成的过滤器；将金属、塑料、陶瓷等的粉末或者金属纤维通过热、压力进行粘接而成的烧结过滤器，任一种均可用于本发明。
前述烧结过滤器例如可以通过利用热及压力将金属、陶瓷、塑料等的粉末颗粒、金属纤维直接粘接(烧结)来制造。本发明中使用的烧结过滤器例如可以通过过滤器原料的熔点×0.3～0.7℃左右的加热处理对成为过滤器原料的纤维等原材料进行烧结而得到，优选可以通过过滤器原料的熔点×0.5℃左右的加热处理进行烧结来得到。在强刚性过滤器中，烧结过滤器具有如下特征：1)廉价、2)能够通过颗粒大小来控制孔径、3)适合于大量制造、4)与生物体物质的亲和性低而不会与包含被检测对象的试样发生特异性结合、5)几乎不吸收液体中的水分、6)可以通过颗粒的大小制作各种孔径的过滤器，因此在包含生物体物质的检体试样的过滤中是优选的。
作为前述烧结过滤器的原材料，可列举出：聚丙烯、聚乙烯(低密度聚乙烯、高密度聚乙烯、超高分子量聚乙烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等的树脂；氧化铝；氧化锆；硅；四氟乙烯硅聚合物；不锈钢等，从加工性方面，优选使用了聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等的树脂的过滤器，其中优选聚丙烯、聚乙烯。
前述过滤用过滤器可以将2种以上的强刚性过滤器组合来制作。另外，也可以将强刚性过滤器和强刚性过滤器以外的过滤器组合。
前述过滤用过滤器可以用于精密过滤用途，还可以用于粗过滤用途，优选至少1种过滤用过滤器的孔径或截留粒径为200μm以下。
本发明的基因检测方法中，例如，过滤用过滤器由孔径不同的多个过滤器重叠构成，使用具有最小孔径的过滤器的孔径为1μm以上且具有最大孔径的过滤器的孔径为200μm以下的过滤用过滤器即可。优选具有最小孔径的过滤器的孔径为5μm以上且具有最大孔径的过滤器的孔径为150μm以下，更优选具有最小孔径的过滤器的孔径为10μm以上且具有最大孔径的过滤器的孔径为100μm。另外，还可以使包含被检测对象的检体试样首先通过具有最大孔径的过滤器，然后通过具有相对小孔径的过滤器。
例如，聚丙烯制强刚性过滤器的孔径为5～200μm，低密度聚乙烯制强刚性过滤器的孔径为10～70μm，高密度聚乙烯制强刚性过滤器的孔径为10～50μm，超高分子量聚乙烯制强刚性过滤器的孔径为10～20μm，聚苯乙烯制强刚性过滤器的孔径为100～200μm，四氟乙烯聚合物制强刚性过滤器的孔径为30～100μm。还可以将原材料和/孔径各异的多个强刚性过滤器组合使用。另外，在使用烧结过滤器作为过滤用过滤器时，未必需要将多个强刚性过滤器组合使用，还可以使用1种原材料的强刚性过滤器作为烧结过滤器。
在使用1种原材料的强刚性过滤器作为烧结过滤器时，对孔径不作特别限定，可以设为例如1μm～200μm，优选为5μm～150μm，更优选为10μm～100μm。
例如，可以使用膜状的过滤器作为精密过滤用过滤器，其材质可以从纤维素、玻璃纤维、二氧化硅纤维、硝酸纤维素、纤维素酯、硝酸纤维素与纤维素酯的混合物、聚醚砜、聚砜、四氟乙烯树脂、偏氟乙烯树脂、聚碳酸酯、聚丙烯、聚酰胺、尼龙6,6、聚酯、棉、不锈钢纤维等中适宜选择合适的材质，但需要为不与包含被检测对象的试样结合、检体悬浮液的吸收量不大的材质。
在构成前述过滤用过滤器的过滤器中，具有最小孔径或截留粒径的过滤器的最小孔径或截留粒径优选为孔径10μm左右。
就前述强刚性过滤器与强刚性过滤器以外的其它种类的过滤器(以下有时称为非强刚性过滤器)的组合方式而言，例如在使用2个过滤器且从后述过滤管的过滤用喷嘴的底面起将过滤器设为第1级过滤器、第2级过滤器时(这种情况下，首先与检体试样接触的是第1级过滤器，检体试样从第1级过滤器通过而添加到测试装置)、作为第1级过滤器和第2级过滤器的组合，有强刚性过滤器与强刚性过滤器的组合、强刚性过滤器与非强刚性过滤器的组合。需要说明的是，有时将靠近喷嘴前端部的过滤器称为下游侧过滤器，将更早接触检体试样的过滤器称为上游侧过滤器。在将过滤器组合的情况下，优选将孔径各异的过滤器组合。任一强刚性过滤器不仅用过滤器的表面、也用其内部捕获混入物，因此需要具有某种程度的厚度。所需的厚度当然会根据混入物的量、过滤器的孔径、大小而不同，但通常在用直径为5～20mm左右的试样过滤用过滤器对基因检测法的检测所需要的检体试样100～2000μl进行过滤时，对强刚性过滤器或非强刚性过滤器的厚度不作限定，优选为0.5mm～7mm，进一步优选为1mm～5mm。另外，试样过滤用过滤器的总厚度优选为2mm～10mm左右。
当前述过滤用过滤器中组合有几个孔径或截留粒径各异的过滤器时，从避免过滤时检体试样堵塞孔方面出发，优选：按照孔径或截留粒径大的过滤器位于上游侧、孔径或截留粒径小的过滤器位于下游侧的方式将两过滤器重叠配置。例如，在将2个过滤器组合时，优选第1级过滤器使用孔径或截留粒径大的过滤器、第2级过滤器使用孔径小的过滤器。
所使用的过滤器的尺寸取决于测试中使用的检体悬浮液管的尺寸，例如，在为圆形时直径为0.5～1.5cm。
作为上述叙述的过滤器，还可以使用专利文献2中记载的过滤器。
本发明中，可以使用棉棒、铂环、滴管或匙形状的用具等作为用于收集检体的器具来收集包含被检测对象的检体，并用于测试。其中，优选使用棉棒或拭子收集检体并用于测试。特别是以人体为受试体并且以鼻腔擦拭液、鼻腔吸取液、咽擦拭液、口腔内擦拭物、肺泡清洗液、粪便悬浮液或直肠擦拭液作为检体时，优选主要使用棉棒或拭子作为检体收集器具。
对前述棉棒不作特别限定。可列举例如：由位于在轴部的一个前端处的头部缠绕棉絮而成的棉球形成的方式。在该方式中，棉球部分相当于检体收集部分。或者，有市售被称为刷状棉棒的、由天然物或人工物形成的纤维配置成刷状的利用毛细管现象收集液体的方式的棉棒，也可以使用该棉棒。前述刷状棉棒由于以下的理由而可以特别优选用于本发明。刷状棉棒例如可以通过被称为絮状物加工的、使切短的纤维(絮状物)在静电作用下附着于涂布有粘接剂的棉棒的柄上的方法来制作。另外，该方式的棉棒还能收集液体中的作为溶解物、混合物的固体、粘性物质，此时不是利用毛细管现象，而是利用固体、粘性物质通过吸附等结合于本发明的器具的被分析试样收集部位这一点来进行收集。与以往的棉棒相比表面积大幅增加，因此检体的收集量相应增大，能够更多地吸附检体中的包含被检测对象的试样。另外，在悬浮于悬浮液时也与以往的棉棒不同，悬浮液能够容易地进入纤维间，因此前述试样容易释放，能够有效地将前述试样回收到悬浮液中。从以上这样的观点出发，本发明的基因检测方法中，为了收集检体，优选使用刷状棉棒(也称为刷状拭子)，特别优选使用附着有短纤维的絮状物拭子。
作为上述叙述的检体收集器具，可以使用专利文献2中记载的检体收集器具。
本发明中，对能够通过对被检测对象的存在进行检测或定量来检验的事项(matter)不作特别限定。可列举例如：呼吸系统感染症的病原微生物或来自该微生物的物质，更具体而言，可列举选自由流感病毒(例如甲型流感病毒、乙型流感病毒等)、RS病毒、腺病毒、A族链球菌及肺炎支原体、百日咳杆菌、肺炎衣原体组成的组中的病原微生物或来自该微生物的物质。另外，可列举腹泻的病原微生物或来自该微生物的物质，更具体而言，可列举出：选自由诺如病毒、轮状病毒、札幌病毒及腹泻腺病毒组成的组中的病原微生物或来自该微生物的物质。另外，可列举出性传播疾病的病原微生物或来自该微生物的物质，更具体而言，可列举出：选自由淋球菌、衣原体、支原体、脲原体、HIV及HPV组成的组中的病原微生物或来自该微生物的物质。另外，本发明的基因检测方法还能够检测人基因多态性，更具体而言，能够用于检测抗药性基因多态性(例如药物代谢酶细胞色素P450基因(CYP基因)的基因多态性)、乙醇脱氢酶基因(ADH基因)的基因多态性、乙醛脱氢酶基因(ALDH基因)的基因多态性、亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR基因)的基因多态性等。
对利用本发明的检测方法进行分析的检体不作特别限定。可列举例如由人或其它动物等得到的生物试样。具体而言，例如可以从由口腔内擦拭物、咽擦拭液、鼻腔擦拭液、鼻腔吸取液、鼻腔清洗液、肺泡清洗液、粪便悬浮液及直肠擦拭液、阴道分泌物、宫颈管粘液、尿道擦拭物组成的组中选择。
在特定的实施方式中，本发明的基因检测方法无需进行基于离心分离法的前处理，该基于离心分离法的前处理在以往的基因检测方法中通常被认为是必需的。在进行离心分离法作为前处理时，除了需要专用设备以外，还存在离心分离的操作烦杂且需要工夫和时间的问题。但是，根据本发明的基因检测方法，不需要准备这种用于离心分离法的专用设备，能够省掉烦杂的操作。进而还能够减少离心分离法所花费的时间，因此能够缩短从由受试体收集检体至得到基因检测结果为止的时间，例如从收集检体至得到基因检测结果为止的时间能够为1天以内，优选为半天以内，更优选为6小时以内，进一步优选为3小时以内，其中优选为2小时以内(例如1.5个小时以内)。
本发明的另一实施方式为一种基因检测试剂盒，其用于检测检体试样中的被检测对象的存在，其包含检体试样用过滤管，所述检体试样用过滤管具备由包含强刚性过滤器的过滤器构成的过滤用过滤器。本发明的试剂盒还可以进一步包含棉棒或拭子作为检体收集器具。另外，本发明的试剂盒当然包含能够对被检测对象的存在进行检测或定量的基因检测试剂等。该基因检测试剂以填充在管、瓶等的试剂容器中并能够在使用时开启的方式包含在本发明的试剂盒中。
图8中示出本实施方式的基因检测试剂盒的构成图的例子。检体试样用过滤管2在内部包含烧结过滤器(21-a、21-b)，使包含检体的试样从本过滤管2中通过，从而能够进行烧结过滤器(21-a、21-b)的过滤处理。需要说明的是，烧结过滤器21-a、21-b的孔径既可以相同也可以不同。另外，在该附图中例示了将2枚烧结过滤器重叠而成的过滤管，但烧结过滤器的枚数不限于此，还可以重叠3枚以上或还可以仅为1枚。另外，包含烧结过滤器的前端部与管主体部也可以按照可拆装的方式分别构成，在过滤操作时进行安装。另外，为了加速溶出，还可以使用具有弹力的材料的管，所述弹力使得人直接用手挤压容器而能够施加压力。拭子(附着有短纤维的絮状物拭子)3在设置于拭子轴部32的前端的检体收集部分31附着有短纤维。基因检测试剂4填充于容器主体41，保管时用盖部42等进行密闭。需要说明的是，在该图中仅例示了1个填充有基因检测试剂的容器，但填充有用于基因检测的试剂的容器可以为2个以上。本发明的基因检测试剂盒还可以收纳在包装箱1中来提供，但还可以是以独立包装供给、而使用时成套使用的试剂盒。需要说明的是，本发明的基因检测试剂盒的构成不限于图8所示的例子，还可以任选包含上述例示的构件以外的构件(例如操作说明书)等。
实施例
以下基于本发明的实施例进行具体说明。本发明不受下述实施例限定。
〔实施例1：淋病奈瑟菌(淋球菌)的检测〕
(1)试样的制备
用10mM的Tris-HCl(pH7.5)将由淋病奈瑟菌提取的DNA试样制备为100(拷贝/μL)，与宫颈管粘液混合来作为试样。使该试样通过包含烧结过滤器(聚丙烯制、孔径100μm)的过滤用过滤器而制备了试样。另外，使用水作为阴性对照(NC)。
(2)核酸扩增及解链曲线分析
分别将上述试样及阴性对照添加到下述试剂中，按照下述条件检测淋病奈瑟菌。在核酸扩增及解链曲线分析中，使用东洋纺制GENECUBE(注册商标)。
试剂
制备包含以下试剂的溶液。
10μM正向引物(序列号1)0.4μL
100μM反向引物(序列号2)0.2μL
10μM探针(序列号3、5’末端被BODIPY-FL标记)0.3μL
KOD Mix(GENECUBE(R)TEST BASIC、东洋纺制)3μL
PPD Mix(GENECUBE(R)TEST BASIC、东洋纺制)3μL
试样3μL
核酸扩增及解链曲线分析
94℃·2分钟
(以上循环1次)
97℃·1秒
58℃·3秒
63℃·6秒
(以上循环60次)
94℃·30秒
39℃·30秒
39℃～75℃(以0.09℃/秒升温)
结果
图1是对于按照上述条件进行核酸扩增后伴随着温度上升的荧光强度变化、将图表的横轴设为温度且将纵轴设为荧光信号的微分值来示出分析结果的图。在图表中，NGDNA表示淋病奈瑟菌DNA试样的分析结果，Water表示作为NC的水的分析结果。由图1可明确：检测到淋病奈瑟菌。需要说明的是，在上述实施例中，利用使用头部由尼龙纤维构成的刷状棉棒(COPAN公司制、絮状物拭子TR100)收集检体而得的试样也得到了同样的结果。
明确了：通过在基因检测方法中用过滤用过滤器对由宫颈管粘液制备的检体试样进行过滤，从而防止了由孔堵塞导致的无效、假阳性，进而通过与刷状棉棒的组合还能进行灵敏度/特异性均高的测定。
〔实施例2：百日咳杆菌的检测〕
(1)试样的制备
用10mM的Tris-HCl(pH7.5)将由百日咳杆菌提取的DNA试样制备为5(拷贝/μL)，与用生理盐水悬浮的咽擦拭液混合，制成模拟生物体试样。使该试样通过包含烧结过滤器(聚丙烯制、孔径20μm)的过滤用过滤器来制备试样。另外，将未用烧结过滤器过滤的液体也作为试样使用。
(2)核酸扩增及解链曲线分析
分别将上述试样添加到下述试剂中，按照下述条件检测百日咳杆菌。在核酸扩增及解链曲线分析中，使用了东洋纺制GENECUBE(注册商标)。
试剂
制备包含以下试剂的溶液。
10μM正向引物(序列号4)0.4μL
100μM反向引物(序列号5)0.3μL
10μM探针(序列号6、5’末端被BODIPY-FL标记)0.3μL
KOD Mix(GENECUBE(R)TEST BASIC、东洋纺制)3μL
PPD Mix(GENECUBE(R)TEST BASIC、东洋纺制)3μL
IC(Internal control)Mix(GENECUBE(R)TEST BASIC、东洋纺制)1μL
试样3μL
核酸扩增及解链曲线分析
94℃·2分钟
(以上循环1次)
97℃·1秒
58℃·3秒
63℃·6秒
(以上循环60次)
94℃·30秒
39℃·30秒
39℃～75℃(以0.09℃/秒升温)
百日咳杆菌的截断值：10
内部对照的截断值：1.5
结果
图2是对于按照上述条件进行核酸扩增后伴随着温度上升的内部对照的荧光强度变化、将图表的横轴设为温度且将纵轴设为荧光信号的微分值来示出分析结果的图。图表示出内部对照的结果，有过滤器表示用烧结过滤器对试样进行了过滤的分析结果，无过滤器表示未用烧结过滤器对试样进行过滤的分析结果。由图2可明确：有过滤器时检测到了内部对照。但是，无过滤器时，由于试样中所含的物质抑制PCR而没有检测到内部对照。由该结果可明确：在百日咳杆菌的基因检测中，仅通过用烧结过滤器进行前处理就可以得到高灵敏度的检测结果。
〔实施例3：肺炎支原体的检测〕
(1)试样的制备
用10mM的Tris-HCl(pH7.5)将由肺炎支原体提取的DNA试样制备为5(拷贝/μL)，与粘蛋白液混合并使最终浓度成为0.2％，作为模拟咽擦拭液生物试样。使该试样通过包含孔径300μm、100μm、20μm的烧结过滤器(聚丙烯制)、烧结过滤器以外的过滤器(用于在提取核酸之前去除杂质的市售的过滤器：网过滤器(核酸提取用过滤器)孔径0.45μm、膜滤器孔径0.8μm以下等)的过滤用过滤器而制备试样。另外，未用烧结过滤器过滤的液体也作为试样使用。
(2)核酸扩增及解链曲线分析
分别将上述试样添加到下述试剂中，按照下述条件检测肺炎支原体。在核酸扩增及解链曲线分析中，使用东洋纺制GENECUBE(注册商标)。
试剂
KOD Mix(GENECUBE(R)TEST BASIC、东洋纺制)4μL
10μM正向引物(序列号7)0.2μL
100μM反向引物(序列号8)0.3μL
10μM探针(序列号9、5’末端被BODIPY-FL标记)0.4μL
PPD Mix(GENECUBE(R)TEST BASIC、东洋纺制)3μL
IC Mix(GENECUBE(R)TEST BASIC、东洋纺制)1.3μL
试样4μL
核酸扩增及解链曲线分析
94℃·2分钟
(以上循环1次)
97℃·1秒
58℃·3秒
63℃·6秒
(以上循环60次)
94℃·30秒
39℃·30秒
39℃～75℃(以0.09℃/秒升温)
肺炎支原体的截断值：7.5
内部对照的截断值：1.5
结果
图3、4是对于按照上述条件进行核酸扩增后伴随着温度上升的荧光强度的变化、将各种过滤器的结果设为横轴且将图表的纵轴设为荧光信号的微分值来示出分析结果的图。图3示出肺炎支原体的结果，图4示出内部对照的结果。由图3可明确：有过滤器时检测到了肺炎支原体。但是，无过滤器时，由于试样中所含的物质抑制PCR而没有检测到肺炎支原体。另外，根据图4，除了20、100μm的烧结过滤器以外均没有检测到内部对照。由该结果明确：在肺炎支原体的基因检测中，使用孔径为特定大小的烧结过滤器对得到高灵敏度的检测结果是重要的。
〔实施例4：肺炎支原体的检测〕
(1)试样的制备
用10mM的Tris-HCl(pH7.5)将由肺炎支原体提取的DNA试样制备成10(拷贝/μL)，与用生理盐水悬浮的咽擦拭液混合，作为模拟生物试样。使该试样通过烧结过滤器(聚乙烯制、孔径20μm)来制备试样。另外，将未用过滤器过滤而是按照现有方法进行离心分离(13,000rpm，3分钟)的上清作为比较例的试样使用。
(2)核酸扩增及解链曲线分析
将上述试样添加到下述试剂中，按照下述条件检测肺炎支原体。在核酸扩增及解链曲线分析中，使用东洋纺制GENECUBE(注册商标)。
试剂
KOD Mix(GENECUBE(R)TEST BASIC、东洋纺制)4μL
10μM正向引物(序列号7)0.2μL
100μM反向引物(序列号8)0.3μL
10μM探针(序列号9、5’末端被BODIPY-FL标记)0.4μL
PPD Mix(GENECUBE(R)TEST BASIC、东洋纺制)3μL
IC Mix(GENECUBE(R)TEST BASIC、东洋纺制)1.3μL
试样4μL
核酸扩增及解链曲线分析
94℃·2分钟
(以上循环1次)
97℃·1秒
58℃·3秒
63℃·6秒
(以上循环60次)
94℃·30秒
39℃·30秒
39℃～75℃(以0.09℃/秒升温)
肺炎支原体的截断值(cutoff值)：7.5
内部对照的截断值：1.5
结果
图5是对于按照上述条件进行核酸扩增后伴随着温度上升的荧光强度变化、将图表的横轴设为温度且将纵轴设为荧光信号的微分值来示出分析结果的图。图表示出肺炎支原体的结果，过滤器过滤表示用烧结过滤器对试样进行过滤的分析结果，离心分离表示用离心机将试样以13,000rpm离心3分钟并将其上清作为试样的分析结果。由图5可明确：用烧结过滤器过滤而处理的肺炎支原体的荧光值高于用离心分离而处理时的荧光值。由此明确：本发明的基因检测方法与现有的离心分离法相比，是简便的方法且能够以更高灵敏度进行检测。
〔实施例5：流感的检测〕
(1)试样的制备
用以灭菌水悬浮的鼻腔擦拭液将流感纯化RNA稀释1000倍、2000倍，作为模拟生物试样。使该试样通过烧结过滤器(聚丙烯制、孔径20μm)来制备试样。另外，作为比较还还使用未用烧结过滤器过滤的试样。
(2)核酸扩增及解链曲线分析
将上述试样添加到下述试剂中，按照下述条件检测甲型流感。作为核酸扩增，在使用了TaqMan probe的实时RT-PCR中，使用Rotor-Gene Q(注册商标)。
试剂
制备含有以下试剂的溶液。
10μM正向引物(序列号10)1μL
10μM反向引物(序列号11)1μL
10μM探针(序列号12、5’末端被FAM标记、3’末端被BHQ1标记)0.4μL、QRZ-101(THUNDERBIRD(R)Probe One-step qRT-PCR Kit、东洋纺制)
试样4μL
RT-PCR条件
50℃·10分钟
95℃·1分钟
(以上循环1次)
95℃·15秒
60℃·45秒
(以上50个循环)
结果
图6是表示按照上述条件进行实时RT-PCR的分析结果的表。有过滤器表示用烧结过滤器对试样进行过滤时的分析结果，无过滤器表示未用烧结过滤器过滤试样时的分析结果。由图6可明确：与未用过滤器过滤时相比，用烧结过滤器过滤而处理时，流感试样的截断值(Ct值)上升更早。由该结果明确：仅用烧结过滤器进行前处理就可以得到高灵敏度的检测结果。
〔实施例6：诺如病毒RNA的检测〕
(1)试样的制备
将用絮状物拭子收集的包含诺如病毒G2型的粪便试样悬浮于纯化水中，使所得试样通过包含烧结过滤器(聚乙烯制、孔径100μm)的过滤用过滤器来制备试样。另外，作为比较还使用未用烧结过滤器过滤的试样。
(2)核酸扩增及解链曲线分析
将上述试样添加到下述试剂中，按照下述条件检测诺如病毒G2型。在核酸扩增及解链曲线分析中，使用东洋纺制GENECUBE(注册商标)。
试剂
使用GENECUBE(注册商标)TEST BASIC(东洋纺公司)制备包含以下所示的成分的反应液。反应液的制备等按照GENECUBE(注册商标)TESTBASIC的操作说明书进行。
0.5μM COG2F引物(序列号13)
1.5μM COG2R引物(序列号14)
0.3μM杂交探针(序列号15、3’末端被BODIPY-FL标记)
0.05unit/μL Revertra Ace(东洋纺公司)
试样3μL
逆转录反应、核酸扩增及解链曲线分析
42℃180秒(逆转录反应)
94℃·30秒
(以上循环1次)
98℃·1秒
60℃·10秒
63℃·10秒
(以上循环60次)
94℃·30秒
39℃·30秒
39℃～75℃(以0.09℃/秒升温)
G2的截断值：7
内部对照的截断值：1.5
结果
图7是对于按照上述条件进行RT-PCR后伴随着温度上升的荧光强度变化、将图表的横轴设为温度且将纵轴设为荧光信号的微分值来示出分析结果的图。由图7可明确：有过滤器时检测到诺如病毒G2。但是，无过滤器时，荧光值低，为截断值以下，呈弱阳性。由该结果明确：在诺如病毒G2基因检测中，使用烧结过滤器对得到高灵敏度的检测结果而言是重要的。
产业上的可利用性
本发明的方法及试剂盒可以用于疾病的检测/诊断等。
附图标记说明
1：基因检测试剂盒主体(包装箱)
2：检体试样用过滤管
21-a、21-b：烧结过滤器
3：拭子(附着有短纤维的絮状物拭子)
31：附着有短纤维的检体收集部分
32：拭子轴部
4：基因检测试剂
41：基因检测试剂的容器主体
42：基因检测试剂的盖部
序列表
<110> 东洋纺株式会社（TOYOBO CO., LTD.）
<120> 基因检查方法及基因检查试剂盒
<130> 180054PC1
<150> JP2017-049528
<151> 2017-03-15
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 1
cgaaaaaagc aaccgggtgc tgaaaaaact 30
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 2
tcatcgcgcc aatgccttca aacattc 27
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 3
cacatagacg gcgcattgc 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 4
cggcaccatc ccgcatacgt 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 5
gcgactttgc gccgaagg 18
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 6
cccgctactg caatccaaca c 21
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 7
actgtctcgg ctatagactc ggtgaaatcc 30
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 8
gctcctacct attctctaca tgataatgtc c 31
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 9
caacgggacg gaaagac 17
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 10
cttctaaccg aggtcgaaac gta 23
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 11
ggtgacagga ttggtcttgt gttta 25
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 12
tcaggccccc tcaaagccga g 21
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的多聚核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 13
cargarbcna tgttyagrtg gatgag 26
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的多聚核苷酸
<400> 14
tcgacgccat cttcattcac a 21
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 15
cgatcgcaat ctggctccc 19

Claims (21)

1.一种基因检测方法，其特征在于，利用过滤用过滤器对包含被检测对象的试样进行过滤，然后对所述试样中的被检测对象的存在进行检测或定量。
2.根据权利要求1所述的基因检测方法，其中，过滤用过滤器为烧结过滤器。
3.根据权利要求2所述的基因检测方法，其中，烧结过滤器的原材料选自由聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯及聚甲基丙烯酸甲酯组成的组。
4.根据权利要求2所述的基因检测方法，其中，烧结过滤器的孔径为10～100μm。
5.根据权利要求1所述的基因检测方法，其中，不需要进行基于离心分离的前处理。
6.根据权利要求1所述的基因检测方法，其中，使用棉棒或拭子作为检体收集器具收集包含被检测对象的检体，将其作为试样用于测试中。
7.根据权利要求6所述的基因检测方法，其中，检体为生物试样。
8.根据权利要求7所述的基因检测方法，其中，检体为选自由人或其它动物的口腔内擦拭物、咽擦拭液、鼻腔擦拭液、鼻腔吸取液、鼻腔清洗液、肺泡清洗液、粪便悬浮液、直肠擦拭液、阴道分泌物、宫颈管粘液、及尿道擦拭物组成的组中的检体。
9.根据权利要求8所述的基因检测方法，其中，能够通过对被检测对象的存在进行检测或定量来检验的事项为呼吸系统感染症的病原微生物或来自所述微生物的物质。
10.根据权利要求9所述的基因检测方法，其中，能够通过对被检测对象的存在进行检测或定量来检验的事项为选自由流感病毒、RS病毒、腺病毒、A族链球菌、肺炎支原体、百日咳杆菌、及肺炎衣原体组成的组中的病原微生物或来自所述微生物的物质。
11.根据权利要求8所述的基因检测方法，其中，能够通过对被检测对象的存在进行检测或定量来检验的事项为腹泻的病原微生物或来自所述微生物的物质。
12.根据权利要求11所述的基因检测方法，其中，能够通过对被检测对象的存在进行检测或定量来检验的事项为选自由诺如病毒、轮状病毒、札幌病毒及腹泻腺病毒组成的组中的病原微生物或来自所述微生物的物质。
13.根据权利要求8所述的基因检测方法，其中，能够通过对被检测对象的存在进行检测或定量来检验的事项为性传播疾病的病原微生物或来自所述微生物的物质。
14.根据权利要求13所述的基因检测方法，其中，能够通过对被检测对象的存在进行检测或定量来检验的事项为选自由淋球菌、衣原体、支原体、脲原体、HIV及HPV组成的组中的病原微生物或来自所述微生物的物质。
15.根据权利要求8所述的基因检测方法，其中，能够通过对被检测对象的存在进行检测或定量来检验的事项为人基因多态性的检测。
16.根据权利要求15所述的基因检测方法，其中，能够通过对被检测对象的存在进行检测或定量来检验的事项为选自由药物代谢酶基因的基因多态性、醇脱氢酶基因的基因多态性、乙醛脱氢酶基因的基因多态性、及亚甲基四氢叶酸还原酶基因的基因多态性组成的组中的人基因多态性。
17.根据权利要求1～16中任一项所述的基因检测方法，其中，过滤用过滤器由孔径不同的多个过滤器重叠构成。
18.根据权利要求17所述的基因检测方法，其中，使包含被检测对象的检体试样首先通过具有最大孔径的过滤器，然后通过具有相对小孔径的过滤器。
19.一种基因检测试剂盒，其用于检测检体试样中的被检测对象的存在，所述基因检测试剂盒包含：
(1)检体试样用过滤管，所述检体试样用过滤管具备由包含烧结过滤器的过滤器构成的过滤用过滤器。
20.根据权利要求19所述的基因检测试剂盒，其中，还包含棉棒或拭子作为检体收集器具。
21.根据权利要求19所述的基因检测试剂盒，其中，还包含填充有基因检测试剂的容器，所述基因检测试剂能够对被检测对象的存在进行检测或定量。
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