JP7264046B2 - 遺伝子検査方法及び遺伝子検査キット - Google Patents
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Description
本発明は、遺伝子検査方法及び遺伝子検査キットに関する。
種々の遺伝子検査方法が知られている（たとえば、非特許文献１および特許文献１）。遺伝子検査に用いる試料の中には種々の物質が混入している。これらの混入物は、検査方法に影響を与えて感度を低下させたり、偽陽性等の結果をもたらしたり、さらには、検査に用いる機器のトラブル（たとえば、流路系の詰まり）の原因となったりする可能性がある。従来、この混入物を除去するために遠心分離法などを用いていたが、専用機器が必要であり、操作が煩雑で時間を要する。
特許文献２には、特異的結合能を有する捕捉試薬（例えば、特定の抗原に対する抗体等）による検出を意図したメンブレンアッセイ法を用いた検査方法において、感度を保ちながら偽陽性や詰まりを防止し、被検出物の精度の高い検出又は定量を可能にする方法が開示されている。
日本国特許庁ホームページ掲載、標準技術集「核酸の増幅及び検出」（掲載日：２００１年８月２８日）
本発明の目的は、遺伝子検査方法において、感度を保ちながら偽陽性や詰まりを防止し、被検出物の精度の高い検出又は定量を可能にする方法を提供すること、及び、そのような方法において使用されるキットを提供することである。
本発明者は、遺伝子検査方法において、被検出物を含む試料をろ過フィルターによってろ過した後に、前記試料中の被測定物の存在を検出又は定量することにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明の概要は以下のとおりである。
［項１］ 被検出対象を含む試料をろ過フィルターによってろ過した後に、前記試料中の被検出対象の存在を検出又は定量することを特徴とする遺伝子検査方法。
［項２］ ろ過フィルターが焼結フィルターである項１に記載の遺伝子検査方法。
［項３］ 焼結フィルターの素材がポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン及びポリメチルメタクリレートからなる群から選択される項２に記載の遺伝子検査方法。
［項４］ 焼結フィルターの孔径が１０～１００μｍである項２に記載の遺伝子検査方法。
［項５］ 遠心分離による前処理を必要としない項１に記載の遺伝子検査方法。
［項６］ 検体採取器具として綿棒またはスワブを用いて被検出対象を含む検体を採取して試料とし、アッセイに用いる、項１に記載の遺伝子検査方法。
［項７］ 検体が生体試料である項６に記載の遺伝子検査方法。
［項８］ 検体がヒト又は他の動物の口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、肺胞洗浄液、便懸濁液、直腸拭い液、膣分泌物、子宮頸管粘液、及び尿道擦過物からなる群から選択される検体である項７に記載の遺伝子検査方法。
［項９］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が呼吸器感染症の原因微生物若しくは該微生物由来の物質である項８に記載の遺伝子検査方法。
［項１０］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項がインフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、アデノウイルス、Ａ群溶連菌、肺炎マイコプラズマ、百日咳菌、及び肺炎クラミジアからなる群から選択される病原微生物若しくは該微生物由来の物質である項９に記載の遺伝子検査方法。
［項１１］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が下痢症の原因微生物若しくは該微生物由来の物質である項８に記載の遺伝子検査方法。
［項１２］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項がノロウイルス、ロタウイルス、サポウイルス及び下痢症アデノウイルスからなる群から選択される病原微生物若しくは該微生物由来の物質である項１１に記載の遺伝子検査方法。
［項１３］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が性感染症の原因微生物若しくは該微生物由来の物質である項８に記載の遺伝子検査方法。
［項１４］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が淋菌、クラミジア、マイコプラズマ、ウレアプラズマ、ＨＩＶ及びＨＰＶからなる群から選択される病原微生物若しくは該微生物由来の物質である項１３に記載の遺伝子検査方法。
［項１５］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項がヒト遺伝子多型の検出である項８に記載の遺伝子検査方法。
［項１６］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が薬剤代謝酵素遺伝子の遺伝子多型、アルコール脱水素酵素遺伝子の遺伝子多型、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子の遺伝子多型、及びメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の遺伝子多型からなる群から選択されるヒト遺伝子多型である項１５に記載の遺伝子検査方法。
［項１７］ ろ過フィルターが孔径の異なる複数のフィルターを重ねて構成されている、項１～１６のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
［項１８］ 被検出対象を含む検体試料を最初に最大孔径を有するフィルターを通過させ、次いでより小さい孔径を有するフィルターを通過させる項１７記載の遺伝子検査方法。
［項１９］ 以下を含む、検体試料中の被検出対象の存在を検査するための遺伝子検査キット。
（１）焼結フィルターを含むフィルターにより構成されたろ過フィルターを備えた検体試料用ろ過チューブ。
［項２０］ さらに、検体採取器具として綿棒またはスワブを含む項１９記載の遺伝子検査キット。
［項２１］ さらに、被検出対象の存在を検出又は定量することができる遺伝子検査試薬が充填されている容器を含む項１９記載の遺伝子検査キット。
［項１］ 被検出対象を含む試料をろ過フィルターによってろ過した後に、前記試料中の被検出対象の存在を検出又は定量することを特徴とする遺伝子検査方法。
［項２］ ろ過フィルターが焼結フィルターである項１に記載の遺伝子検査方法。
［項３］ 焼結フィルターの素材がポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン及びポリメチルメタクリレートからなる群から選択される項２に記載の遺伝子検査方法。
［項４］ 焼結フィルターの孔径が１０～１００μｍである項２に記載の遺伝子検査方法。
［項５］ 遠心分離による前処理を必要としない項１に記載の遺伝子検査方法。
［項６］ 検体採取器具として綿棒またはスワブを用いて被検出対象を含む検体を採取して試料とし、アッセイに用いる、項１に記載の遺伝子検査方法。
［項７］ 検体が生体試料である項６に記載の遺伝子検査方法。
［項８］ 検体がヒト又は他の動物の口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、肺胞洗浄液、便懸濁液、直腸拭い液、膣分泌物、子宮頸管粘液、及び尿道擦過物からなる群から選択される検体である項７に記載の遺伝子検査方法。
［項９］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が呼吸器感染症の原因微生物若しくは該微生物由来の物質である項８に記載の遺伝子検査方法。
［項１０］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項がインフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、アデノウイルス、Ａ群溶連菌、肺炎マイコプラズマ、百日咳菌、及び肺炎クラミジアからなる群から選択される病原微生物若しくは該微生物由来の物質である項９に記載の遺伝子検査方法。
［項１１］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が下痢症の原因微生物若しくは該微生物由来の物質である項８に記載の遺伝子検査方法。
［項１２］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項がノロウイルス、ロタウイルス、サポウイルス及び下痢症アデノウイルスからなる群から選択される病原微生物若しくは該微生物由来の物質である項１１に記載の遺伝子検査方法。
［項１３］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が性感染症の原因微生物若しくは該微生物由来の物質である項８に記載の遺伝子検査方法。
［項１４］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が淋菌、クラミジア、マイコプラズマ、ウレアプラズマ、ＨＩＶ及びＨＰＶからなる群から選択される病原微生物若しくは該微生物由来の物質である項１３に記載の遺伝子検査方法。
［項１５］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項がヒト遺伝子多型の検出である項８に記載の遺伝子検査方法。
［項１６］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が薬剤代謝酵素遺伝子の遺伝子多型、アルコール脱水素酵素遺伝子の遺伝子多型、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子の遺伝子多型、及びメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の遺伝子多型からなる群から選択されるヒト遺伝子多型である項１５に記載の遺伝子検査方法。
［項１７］ ろ過フィルターが孔径の異なる複数のフィルターを重ねて構成されている、項１～１６のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
［項１８］ 被検出対象を含む検体試料を最初に最大孔径を有するフィルターを通過させ、次いでより小さい孔径を有するフィルターを通過させる項１７記載の遺伝子検査方法。
［項１９］ 以下を含む、検体試料中の被検出対象の存在を検査するための遺伝子検査キット。
（１）焼結フィルターを含むフィルターにより構成されたろ過フィルターを備えた検体試料用ろ過チューブ。
［項２０］ さらに、検体採取器具として綿棒またはスワブを含む項１９記載の遺伝子検査キット。
［項２１］ さらに、被検出対象の存在を検出又は定量することができる遺伝子検査試薬が充填されている容器を含む項１９記載の遺伝子検査キット。
本発明の方法又は装置を用いて検体試料中の被検出対象を検出・定量する場合、検体が口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、肺胞洗浄液、膣分泌物、子宮頸管粘液、尿道擦過物等の不純物を多く含む検体であっても、検体採取器具及び／又はろ過フィルターにより検体量を減らすことなく、不純物を除去することができる。その結果、不純物に影響されることなく、正確な結果を得ることができる。また、本発明によれば、遠心分離法による前処理を行う必要がないので、遠心分離を行う場合に必要となる専用機器や操作の手間が不要となり、より簡便に、短時間に、正確な結果を得ることが可能となる。
本発明の実施態様のひとつは、被検出対象を含む試料をろ過フィルターによってろ過した後に、前記試料中の被検出対象の存在を検出又は定量することを特徴とする遺伝子検査方法である。また、具体的には、採取器具を用いて被検対象を採取した後、当該被検対象を含む採取器具を容器に入れ、容器内の液に懸濁したのち、採取器具を容器から取り出し、容器に本発明のフィルターを取り付け、容器内部の液をフィルターに通過させて容器外へと溶出させ、当該溶出液中の被検出対象の存在を検出又は定量することを特徴とする遺伝子検査方法である。
本発明において遺伝子検査方法は特に限定されず、たとえば、遺伝子の配列情報を根拠に病気や感染などを検査できる方法であればよい。具体的には、たとえば、試料から特定の感染源や病気に特有の塩基（たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）の部分配列を検出したり、多型（たとえば、一塩基多型（ＳＮＰ））を検出する態様が挙げられる。
前記の遺伝子検査方法に用いる検出原理は特に限定されず、たとえば、対立遺伝子特異的プライマーによるＰＣＲ法、変性勾配ゲル電気泳動法、ＳＳＣＰ法、ＲＦＬＰ法、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、インベーダー法、ＰＣＲなどの方法で増幅させた試料に適当なプローブ（たとえば、Ｑプローブ）をハイブリダイズさせて融解曲線分析を行う方法など種々の公知の方法を用いることができる。
前記の遺伝子検査方法に用いる検出原理は特に限定されず、たとえば、対立遺伝子特異的プライマーによるＰＣＲ法、変性勾配ゲル電気泳動法、ＳＳＣＰ法、ＲＦＬＰ法、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、インベーダー法、ＰＣＲなどの方法で増幅させた試料に適当なプローブ（たとえば、Ｑプローブ）をハイブリダイズさせて融解曲線分析を行う方法など種々の公知の方法を用いることができる。
本発明において被検出対象は特に限定されない。たとえば、ゲノム、構造遺伝子、調節遺伝子、遺伝子転写産物（ｍＲＮＡまたはその前駆体など）、あるいはそれらの断片などの一部に存在する特定の核酸、特定のオリゴヌクレオチド部分、特定のポリヌクレオチド部分などが挙げられる。それらはＤＮＡ、ＲＮＡのいずれであっても良いし、両者のキメラであっても良い。
前記被検出対象を含む試料は、生体などから採取されたもの（たとえば、被検出対象を含む検体そのもの）であっても良いし、何らかの手段で前記検体に含まれるＤＮＡ、ＲＮＡ等が複製または増幅などされたものであっても良い。複製または増幅に用いる方法は特に限定されず、ＰＣＲ法、ＳＤＡ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法など種々の公知の方法を用いることができる。
また、前記被検出対象を含む試料は、何らかの物理化学的手段により前記検体に含まれるＤＮＡ、ＲＮＡ等が修飾または分解などされたものであっても良い。
前記被検出対象を含む試料は、生体などから採取されたもの（たとえば、被検出対象を含む検体そのもの）であっても良いし、何らかの手段で前記検体に含まれるＤＮＡ、ＲＮＡ等が複製または増幅などされたものであっても良い。複製または増幅に用いる方法は特に限定されず、ＰＣＲ法、ＳＤＡ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法など種々の公知の方法を用いることができる。
また、前記被検出対象を含む試料は、何らかの物理化学的手段により前記検体に含まれるＤＮＡ、ＲＮＡ等が修飾または分解などされたものであっても良い。
前記において、ＤＮＡの複製または増幅をＰＣＲ法で行う場合は、特に限定はされないが、α型のＤＮＡポリメラーゼ（または、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ）を用いることが好ましく、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いることがさらに好ましい。これらのＤＮＡポリメラーゼを用いれば、試料からのＤＮＡの抽出または精製を行うことなく、簡便なろ過操作のみで、被検出対象の存在を検出又は定量することができる。
また前記において、ＲＮＡの検出をＲＴ－ＰＣＲ法で行う場合は、特に限定はされないが、ＰｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼ（または、ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼ）を用いることが好ましく、逆転写活性を有するＴｔｈポリメラーゼを用いることがさらに好ましい。これらのＤＮＡポリメラーゼを用いれば、試料からのＲＮＡの抽出または精製を行うことなく、簡便なろ過操作のみで、被検出対象の存在を検出又は定量することができる。
また前記において、ＲＮＡの検出をＲＴ－ＰＣＲ法で行う場合は、特に限定はされないが、ＰｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼ（または、ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼ）を用いることが好ましく、逆転写活性を有するＴｔｈポリメラーゼを用いることがさらに好ましい。これらのＤＮＡポリメラーゼを用いれば、試料からのＲＮＡの抽出または精製を行うことなく、簡便なろ過操作のみで、被検出対象の存在を検出又は定量することができる。
本発明において、被検出対象を含む試料は、ろ過フィルターを用いてろ過される。ろ過フィルターは遺伝子検査装置のシリカモノリス等の目詰まりや偽陽性及びろ過フィルター自身の目詰まりを防ぐため、１種類だけではなく、材質の異なるもの、孔径又は保留粒子径の異なるものをいくつか組み合わせても良いが、本発明においては、少なくとも１種のろ過フィルターを含むことが必要である。
前記ろ過フィルターとしては、特に限定されないが、焼結フィルターを用いることが好ましい。焼結フィルターの素材は特に限定されないが、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン及びポリメチルメタクリレートからなる群から選択されることが好ましい。
前記ろ過フィルターは、外部からの力に対して変形しにくいフィルター（強剛性フィルター）であることが好ましい。
たとえば、ろ過チューブ中に検体浮遊液に浮遊させた検体試料を入れて、先端に取り付けた強剛性フィルターを含むろ過フィルターを通してろ過し、ろ液を遺伝子検査試薬を添加した容器（例えば、チューブ等）等に滴下する際に、フィルターはろ過チューブ内の検体試料等の液体や空気の圧力を受ける。または、チューブが弾力のある素材のものであれば人が直接手で容器を押えることにより圧力を受ける。このとき、フィルターの厚さ方向の潰れや湾曲等の変形が発生する可能性があるが、これらの現象はフィルター内部のろ液の流路を塞ぎ、フィルター自身が目詰まりする原因となる。本発明に用いるろ過フィルターは、ろ過チューブ中に検体浮遊液に浮遊させた検体試料を入れて、先端に取り付けた強剛性フィルターを含むろ過フィルターを通してろ過し、ろ液を遺伝子検査試薬を添加した容器（例えば、チューブ等）等に滴下する際に、フィルターの厚さ方向に潰れにくく、または、湾曲等の変形をしにくい剛性を備えているフィルターであることが好ましい。別の言い方では、ろ液の圧力によってもフィルター内部のろ液の流路を塞ぎ難い剛性を備えたフィルターであることが好ましい。
たとえば、ろ過チューブ中に検体浮遊液に浮遊させた検体試料を入れて、先端に取り付けた強剛性フィルターを含むろ過フィルターを通してろ過し、ろ液を遺伝子検査試薬を添加した容器（例えば、チューブ等）等に滴下する際に、フィルターはろ過チューブ内の検体試料等の液体や空気の圧力を受ける。または、チューブが弾力のある素材のものであれば人が直接手で容器を押えることにより圧力を受ける。このとき、フィルターの厚さ方向の潰れや湾曲等の変形が発生する可能性があるが、これらの現象はフィルター内部のろ液の流路を塞ぎ、フィルター自身が目詰まりする原因となる。本発明に用いるろ過フィルターは、ろ過チューブ中に検体浮遊液に浮遊させた検体試料を入れて、先端に取り付けた強剛性フィルターを含むろ過フィルターを通してろ過し、ろ液を遺伝子検査試薬を添加した容器（例えば、チューブ等）等に滴下する際に、フィルターの厚さ方向に潰れにくく、または、湾曲等の変形をしにくい剛性を備えているフィルターであることが好ましい。別の言い方では、ろ液の圧力によってもフィルター内部のろ液の流路を塞ぎ難い剛性を備えたフィルターであることが好ましい。
前記ろ過フィルターは変形しにくいため、目詰まりが起こりにくい。また、積層したり、あるいは厚さを数ｍｍ～数ｃｍ程度に厚く加工することができるため、それにより有効ろ過面積が大きくできるため、目詰まりが起こりにくい。
フィルターの厚さ方向に潰れにくい剛性を備えているとは、例えば、検体試料をろ過する時の液体や空気によるフィルターにかかる圧力が０．２［ＭＰａ］を超えても、ろ過前対ろ過時の厚さの変化量が５％以上とならず、好ましくは２％以上とならず、また、湾曲等の変形をしにくい剛性を備えているとは、上記同様の圧力がかかってもろ過時のフィルターの曲率半径が２ｃｍ以下とならないことをいう。
フィルターの厚さ方向に潰れにくい剛性を備えているとは、例えば、検体試料をろ過する時の液体や空気によるフィルターにかかる圧力が０．２［ＭＰａ］を超えても、ろ過前対ろ過時の厚さの変化量が５％以上とならず、好ましくは２％以上とならず、また、湾曲等の変形をしにくい剛性を備えているとは、上記同様の圧力がかかってもろ過時のフィルターの曲率半径が２ｃｍ以下とならないことをいう。
前記ろ過フィルターとしては各種の金属繊維をワインドしたもの、金属繊維の不織布を用いたもの、プラスチックスを発泡させたもの、金属メッシュを層状に重ね合わせたもの、金属、プラスチックス、セラミック等の粉末や金属繊維を熱や圧力で接着した焼結フィルターが挙げられ、いずれも本発明において使用可能である。
前記焼結フィルターは、たとえば、金属、セラミック、プラスチック等の粉末粒子や金属繊維を熱及び圧力により直接接着（焼結）することにより製造できる。本発明に用いられる焼結フィルターは、例えば、フィルターの原料となる繊維等の素材をフィルター原料の融点×０．３～０．７℃程度の加熱処理により焼結することで得ることができ、好ましくはフィルター原料の融点×０．５℃程度の加熱処理により焼結することにより得ることができる。強剛性フィルターの中でも焼結フィルターは、１）安価である、２）粒子の大きさにより孔径を制御することが可能である、３）大量製造に向く、４）生体物質との親和性が低いため被検出対象を含む試料と特異的に結合しない、５）液体中の水分の吸収がほとんどない、６）粒子の大きさにより様々な孔径のものを作製できる、という特徴を有するので、生体物質を含む検体試料のろ過に好ましい。
前記焼結フィルターの素材としては、ポリプロピレン、ポリエチレン（低密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、超高分子量ポリエチレン）、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の樹脂、アルミナ、ジルコニア、ケイ素、ケイ素四フッ化エチレン重合体、ステンレス鋼等を挙げることができるが、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の樹脂を用いたものが加工性の面から好ましく、なかでもポリプロピレン、ポリエチレンが好ましい。
前記ろ過フィルターは、２種類以上の強剛性フィルターを組み合わせて作製してもよい。また、強剛性フィルターと強剛性フィルター以外のフィルターと組み合わせてもよい。
前記ろ過フィルターは精密ろ過用としても、粗ろ過用としても用いることができるが、少なくとも１種類のろ過フィルターの孔径又は保留粒子径は２００μｍ以下が好ましい。
本発明の遺伝子検査方法においては、たとえば、ろ過フィルターが孔径の異なる複数のフィルターを重ねて構成されており、最小孔径を有するフィルターの孔径が、１μｍ以上であり、最大孔径を有するフィルターの孔径が２００μｍ以下である、ろ過フィルターを用いればよい。好ましくは、最小孔径を有するフィルターの孔径が５μｍ以上であり、最大孔径を有するフィルターの孔径が１５０μｍ以下であり、より好ましくは最小孔径を有するフィルターの孔径が１０μｍ以上であり、最大孔径を有するフィルターの孔径が１００μｍである。また、被検出対象を含む検体試料を最初に最大孔径を有するフィルターを通過させ、次いでより小さい孔径を有するフィルターを通過させても良い。
例えば、ポリプロピレン製強剛性フィルターの孔径は５～２００μｍ、低密度ポリエチレン製強剛性フィルターの孔径は１０～７０μｍ、高密度ポリエチレン製強剛性フィルターの孔径は１０～５０μｍ、超高分子量ポリエチレン製強剛性フィルターの孔径は１０～２０μｍ、ポリスチレン製強剛性フィルターの孔径は１００～２００μｍ、四フッ化エチレン重合体製強剛性フィルターの孔径は３０～１００μｍである。素材及び／孔径の異なる複数の強剛性フィルターを組合せて用いてもよい。また、ろ過フィルターとして焼結フィルターを用いる場合には、必ずしも複数の強剛性フィルターを組み合わせて用いる必要はなく、１種類の素材の強剛性フィルターを焼結フィルターとして用いても良い。
１種類の素材の強剛性フィルターを焼結フィルターとして用いる場合、孔径は特に限定されないが、例えば、１μｍ～２００μｍとすることができ、５μｍ～１５０μｍであることが好ましく、１０μｍ～１００μｍであることがより好ましい。
１種類の素材の強剛性フィルターを焼結フィルターとして用いる場合、孔径は特に限定されないが、例えば、１μｍ～２００μｍとすることができ、５μｍ～１５０μｍであることが好ましく、１０μｍ～１００μｍであることがより好ましい。
精密ろ過用フィルターとして例えば膜状のフィルターを用いることができ、その材質はセルロース、ガラス繊維、シリカ繊維、ニトロセルロース、セルロースエステル、ニトロセルロースとセルロースエステルの混合物、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、四フッ化エチレン樹脂、フッ化ビニリデン樹脂、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアミド、ナイロン６，６、ポリエステル、コットン、ステンレススチール繊維等の中から好適なものを適宜選択することができるが、被検出対象を含む試料を結合させず、検体浮遊液の吸収量が多くないものにすることが必要である。
前記ろ過フィルターを構成するフィルターの中で最小の孔径又は保留粒子径を有するフィルターの最小の孔径又は保留粒子径は、孔径１０μｍ程度であることが好ましい。
前記強剛性フィルター及び強剛性フィルター以外の別の種類のフィルター（以下、非強剛性フィルターということがある）の組合せ方は、例えば、フィルターを２つ用いる場合、フィルターを後記のろ過チューブのろ過用ノズルの底面から１段目フィルター、２段目フィルターとすると（この場合、最初に検体試料と接触するのは、１段目フィルターであり、検体試料は１段目フィルターを通過して、アッセイ装置に添加される）、１段目フィルターと２段目フィルターの組合せとして、強剛性フィルターと強剛性フィルター、強剛性フィルターと非強剛性フィルターの組合せがある。なお、ノズル先端部に近いフィルターを下流側フィルターと呼び、より早く検体試料に接触するフィルターを上流側フィルターと呼ぶことがある。フィルターを組合せる場合、孔径が異なるフィルターを組合せることが好ましい。強剛性フィルターはいずれもフィルターの表面だけでなく、その内部でも混入物をトラップするため、ある程度の厚さが必要である。必要な厚みは混入物の量やフィルターの孔径や大きさにより当然異なるが、一般に遺伝子検査法での検査に必要な検体試料１００～２０００μｌを直径が５～２０ｍｍ程度の試料ろ過フィルターでろ過する場合、強剛性フィルター又は非強剛性フィルターの厚さは、限定されないが、好ましくは、０．５ｍｍ～７ｍｍ、さらに好ましくは１ｍｍ～５ｍｍである。また、試料ろ過フィルターの厚さの合計は２ｍｍ～１０ｍｍ程度が好ましい。
前記ろ過フィルターに孔径又は保留粒子径の異なるものをいくつか組み合わせる場合は、孔径又は保留粒子径の大きなフィルターを上流側に、小さなフィルターを下流側に、両フィルターが重なるように配置することが、ろ過時における検体試料の目詰まりを回避する上で好ましい。例えば、２つのフィルターを組合わせる場合、１段目のフィルターに孔径又は保留粒子径が大きいフィルターを用い、２段目のフィルターに孔径が小さいフィルターを用いることが好ましい。
用いるフィルターのサイズは、アッセイに用いる検体浮遊液チューブのサイズによるが、例えば、円形で直径０．５～１．５ｃｍである。
上記で述べたようなフィルターとして、特許文献２に記載されているものを使用してもよい。
本発明においては、検体採取するための器具として綿棒、白金耳、スポイト又はさじ形状の用具等を用いて被検出対象を含む検体を採取し、アッセイに用いることができる。中でも、綿棒またはスワブを用い、検体を採取しアッセイに用いることが好ましい。特に人体を被験体とし、鼻腔ぬぐい液、鼻腔吸引液、咽頭ぬぐい液、口腔内擦過物、肺胞洗浄液、便懸濁液又は直腸拭い液、を検体とする場合は、検体採取器具として主として綿棒またはスワブを用いることが好ましい。
前記綿棒は特に限定されない。たとえば、軸部の片方の先端にある頭部に綿を巻き付けた綿球から形成される態様が挙げられる。この態様において綿球部分が検体採取部分に該当する。あるいは、ブラシ状綿棒と呼ばれる、天然物又は人工物でできた繊維がブラシ状に配置され、毛細管現象を利用し液体を採取する方式の綿棒が市販されており、これを用いても良い。前記ブラシ状綿棒は、以下の理由により本発明に特に好適に使用することができる。ブラシ状綿棒は、例えばフロック加工と呼ばれる、短く切った繊維（フロック）を、静電気により接着剤を塗布した綿棒の柄に付着させる方法により作製することができる。また、この方式の綿棒では、液体中の溶解物や混合物である固体や粘性物質も採取可能であり、この場合毛細管現象だけではなく、固体や粘性物質が本発明に器具の被分析試料採取部位に吸着等により結合することを利用して採取する。従来の綿棒と比較して表面積が大幅に増えるので、それだけ検体の採取量が大きく、検体中の被検出対象を含む試料をより多く吸着することが可能である。また浮遊液に浮遊させる際にも従来の綿棒とは異なり、浮遊液は容易に繊維間に入り込むことができるため、前記試料が放出されやすく、効率的に前記試料を浮遊液中に回収することができる。以上のような観点から、本発明の遺伝子検査方法では検体採取のために、ブラシ状綿棒（ブラシ状スワブともいう）を用いることが好ましく、短繊維を付着したフロックスワブを用いることが特に好ましい。
上記で述べたような検体採取器具として、特許文献２に記載されているものを使用してもよい。
本発明において、被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項（ｍａｔｔｅｒ）は特に限定されない。たとえば、呼吸器感染症の原因微生物若しくは該微生物由来の物質が挙げられ、さらに具体的には、インフルエンザウイルス（例えば、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス等）、ＲＳウイルス、アデノウイルス、Ａ群溶連菌及び肺炎マイコプラズマ、百日咳菌、肺炎クラミジアからなる群から選択される病原微生物若しくは該微生物由来の物質が挙げられる。また、下痢症の原因微生物若しくは該微生物由来の物質が挙げられ、さらに具体的には、ノロウイルス、ロタウイルス、サポウイルス及び下痢症アデノウイルスからなる群から選択される病原微生物若しくは該微生物由来の物質が挙げられる。また、性感染症の原因微生物若しくは該微生物由来の物質が挙げられ、さらに具体的には、淋菌、クラミジア、マイコプラズマ、ウレアプラズマ、ＨＩＶ及びＨＰＶからなる群から選択される病原微生物若しくは該微生物由来の物質が挙げられる。また、本発明の遺伝子検査方法はヒト遺伝子多型を検査することもでき、さらに具体的には、薬剤耐性遺伝子多型（例えば、薬剤代謝酵素シトクロムＰ４５０遺伝子（ＣＹＰ遺伝子）の遺伝子多型）、アルコール脱水素酵素遺伝子（ＡＤＨ遺伝子）の遺伝子多型、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ遺伝子）の遺伝子多型、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ＭＴＨＦＲ遺伝子）の遺伝子多型等を検査するために使用することが可能である。
本発明の検査方法により分析するための検体は、特に限定されない。たとえばヒト又は他の動物などから得られる生体試料が挙げられる。具体的には、たとえば、口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、肺胞洗浄液、便懸濁液及び直腸拭い液、膣分泌物、子宮頸管粘液、尿道擦過物からなる群から選択すればよい。
特定の実施態様において、本発明の遺伝子検査方法は、従来の遺伝子検査方法において通常は必須と考えられていた遠心分離法による前処理を行う必要が無い。遠心分離法を前処理として行う場合、専用機器が必要であることに加えて、遠心分離の操作が煩雑で手間と時間がかかるという問題がある。しかし、本発明の遺伝子検査方法によれば、そのような遠心分離法を行うための専用機器を準備する必要がなく、煩雑な操作を省くことが可能である。更に、遠心分離法にかかる時間も短縮することができるので、被験体からの検体採取から遺伝子検査結果を得るまでの時間を短縮することができ、例えば、検体採取から遺伝子検査結果が得られるまでの時間を１日以内、好ましくは半日以内、より好ましくは６時間以内、更に好ましくは３時間以内、なかでも好ましくは２時間以内（例えば、１時間半以内）とすることが可能となり得る。
本発明の別の実施態様は、強剛性フィルターを含むフィルターにより構成されたろ過フィルターを備えた検体試料用ろ過チューブを含む、検体試料中の被検出対象の存在を検査するための遺伝子検査キットである。本発明のキットは、さらに、検体採取器具として綿棒またはスワブを含んでも良い。また、本発明のキットは、被検出対象の存在を検出又は定量することができる遺伝子検査試薬等を当然含む。この遺伝子検査試薬は、チューブや瓶等の試薬容器に充填され、使用時に開封可能な形態として本発明のキットに含まれる。
本実施態様の遺伝子検査キットの構成図の例を、図８に示す。検体試料用ろ過チューブ２は内部に焼結フィルター（２１－ａ、２１－ｂ）を含み、検体を含む試料を本ろ過チューブ２に通すことで焼結フィルター（２１－ａ、２１－ｂ）のろ過処理を行うことができる。なお、焼結フィルター２１－ａ、２１－ｂの孔径は、同じであってもよいし異なっても良い。また、本図面では、焼結フィルターを２枚重ねているろ過チューブを例示しているが、焼結フィルターの枚数はこれに限定されず、３枚以上重ねてもよいし、又は１枚だけでもよい。また、焼結フィルターを含む先端部とチューブ本体部は脱着可能に別々に構成し、ろ過操作時に取り付けるようにしてもよい。また、溶出を速やかにするために、人が直接手で容器を押えて圧力がかけられるよう弾力がある素材のチューブを用いることができる。スワブ（短繊維を付着したフロックスワブ）３は、スワブ軸部３２の先端に設けた検体採取部分３１に短繊維が付着されている。遺伝子検査試薬４は、容器本体４１に充填されており、保管時は蓋部４２等で密閉されている。なお、本図面では、遺伝子検査試薬を充填した容器を１つだけ例示しているが、遺伝子検査に用いる試薬を充填した容器は２つ以上であり得る。本発明の遺伝子検査キットは、包装箱１に収納されて提供することもできるが、別々の包装で供給されて使用時にセットで用いるキットであってもよい。なお、本発明の遺伝子検査キットの構成は、図８で示す例に限定されず、上記で例示したもの以外のもの（例えば、取扱説明書）等も任意に含むことができる。
以下、本発明の実施例に基づき具体的に説明する。本発明は下記実施例に限定されるものではない。
〔実施例１：ナイセリアゴノレア（淋菌）の検出〕
（１）試料の調製
ナイセリアゴノレアから抽出したＤＮＡ試料を１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１００（コピー／μＬ）となるように調製し、子宮頸管粘液と混合して試料とした。この試料を焼結フィルター（ポリプロピレン製、孔径１００μｍ）を含むろ過フィルターを通過させて試料を調製した。また、陰性コントロール（ＮＣ）として水を使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料および陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりナイセリアゴノレアを検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
（１）試料の調製
ナイセリアゴノレアから抽出したＤＮＡ試料を１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１００（コピー／μＬ）となるように調製し、子宮頸管粘液と混合して試料とした。この試料を焼結フィルター（ポリプロピレン製、孔径１００μｍ）を含むろ過フィルターを通過させて試料を調製した。また、陰性コントロール（ＮＣ）として水を使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料および陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりナイセリアゴノレアを検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
試薬
以下の試薬を含む溶液を調製した。
１０μＭ フォワードプライマー（配列番号１）０．４μＬ
１００μＭ リバースプライマー（配列番号２）０．２μＬ
１０μＭ プローブ（配列番号３、５’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ標識）０．３μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
試料３μＬ
以下の試薬を含む溶液を調製した。
１０μＭ フォワードプライマー（配列番号１）０．４μＬ
１００μＭ リバースプライマー（配列番号２）０．２μＬ
１０μＭ プローブ（配列番号３、５’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ標識）０．３μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
試料３μＬ
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・６秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・６秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
結果
図１は、上記の条件で核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。グラフのうちＮＧ ＤＮＡはナイセリアゴノレアＤＮＡ試料の解析結果を、ＷａｔｅｒはＮＣである水の解析結果を示している。図１より明らかなように、ナイセリアゴノレアが検出されている。なお、上記実施例で、頭部がナイロン繊維からなるブラシ状綿棒（ＣＯＰＡＮ社製、フロックスワブＴＲ１００）を用いて検体を採取した試料を用いても、同様の結果を得た。
図１は、上記の条件で核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。グラフのうちＮＧ ＤＮＡはナイセリアゴノレアＤＮＡ試料の解析結果を、ＷａｔｅｒはＮＣである水の解析結果を示している。図１より明らかなように、ナイセリアゴノレアが検出されている。なお、上記実施例で、頭部がナイロン繊維からなるブラシ状綿棒（ＣＯＰＡＮ社製、フロックスワブＴＲ１００）を用いて検体を採取した試料を用いても、同様の結果を得た。
遺伝子検査方法においてろ過フィルターで子宮頸管粘液から調製した検体試料をろ過することにより目詰まりによる無効や偽陽性を防ぎ、さらにブラシ状綿棒との組み合わせによっても感度・特異性が共に高い測定が可能となることが判明した。
〔実施例２：百日咳菌の検出〕
（１）試料の調製
百日咳菌から抽出したＤＮＡ試料を１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で５（コピー／μＬ）となるように調製し、生理食塩水で懸濁した咽頭拭い液と混合して疑似生体試料とした。この試料を焼結フィルター（ポリプロピレン製、孔径２０μｍ）を含むろ過フィルターを通過させて試料を調製した。また、焼結フィルターでろ過しない液も試料として使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料をそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
（１）試料の調製
百日咳菌から抽出したＤＮＡ試料を１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で５（コピー／μＬ）となるように調製し、生理食塩水で懸濁した咽頭拭い液と混合して疑似生体試料とした。この試料を焼結フィルター（ポリプロピレン製、孔径２０μｍ）を含むろ過フィルターを通過させて試料を調製した。また、焼結フィルターでろ過しない液も試料として使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料をそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
試薬
以下の試薬を含む溶液を調製した。
１０μＭ フォワードプライマー（配列番号４）０．４μＬ
１００μＭ リバースプライマー（配列番号５）０．３μＬ
１０μＭ プローブ（配列番号６、５’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ標識）０．３μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
試料３μＬ
以下の試薬を含む溶液を調製した。
１０μＭ フォワードプライマー（配列番号４）０．４μＬ
１００μＭ リバースプライマー（配列番号５）０．３μＬ
１０μＭ プローブ（配列番号６、５’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ標識）０．３μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
試料３μＬ
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・６秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
百日咳菌のカットオフ値：１０
内部コントロールのカットオフ値：１．５
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・６秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
百日咳菌のカットオフ値：１０
内部コントロールのカットオフ値：１．５
結果
図２は、上記の条件で核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう内部コントロールの蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。グラフは内部コントロールの結果を示しており、フィルターありは焼結フィルターで試料をろ過した解析結果を、フィルターなしは試料を焼結フィルターでろ過していない解析結果を示している。図２より明らかなように、フィルターありの場合で内部コントロールが検出されている。しかし、フィルターなしの場合、試料に含まれる物質のＰＣＲ阻害により内部コンロトールが検出されていない。この結果から、百日咳菌の遺伝子検査では、焼結フィルターで前処理するだけで高感度な検査結果が得られることが明らかとなった。
図２は、上記の条件で核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう内部コントロールの蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。グラフは内部コントロールの結果を示しており、フィルターありは焼結フィルターで試料をろ過した解析結果を、フィルターなしは試料を焼結フィルターでろ過していない解析結果を示している。図２より明らかなように、フィルターありの場合で内部コントロールが検出されている。しかし、フィルターなしの場合、試料に含まれる物質のＰＣＲ阻害により内部コンロトールが検出されていない。この結果から、百日咳菌の遺伝子検査では、焼結フィルターで前処理するだけで高感度な検査結果が得られることが明らかとなった。
〔実施例３：肺炎マイコプラズマの検出〕
（１）試料の調製
マイコプラズマ・ニューモニエから抽出したＤＮＡ試料を１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で５（コピー／μＬ）となるように調製し、終濃度０．２％となるようにムチン液と混合して疑似咽頭拭い液生体試料とした。この試料を孔径３００μｍ、１００μｍ、２０μｍの焼結フィルター（ポリプロピレン製）や焼結フィルター以外のフィルター（核酸抽出前ゴミ取り用として市販のフィルター：メッシュフィルター（核酸抽出用フィルター）孔径０．４５μｍ、メンブレンフィルター孔径０．８μｍ以下など）を含むろ過フィルターを通過させて試料を調製した。また、焼結フィルターでろ過しない液も試料として使用した。
（１）試料の調製
マイコプラズマ・ニューモニエから抽出したＤＮＡ試料を１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で５（コピー／μＬ）となるように調製し、終濃度０．２％となるようにムチン液と混合して疑似咽頭拭い液生体試料とした。この試料を孔径３００μｍ、１００μｍ、２０μｍの焼結フィルター（ポリプロピレン製）や焼結フィルター以外のフィルター（核酸抽出前ゴミ取り用として市販のフィルター：メッシュフィルター（核酸抽出用フィルター）孔径０．４５μｍ、メンブレンフィルター孔径０．８μｍ以下など）を含むろ過フィルターを通過させて試料を調製した。また、焼結フィルターでろ過しない液も試料として使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料をそれぞれ下記試薬に添加して、下記条件によりマイコプラズマ・ニューモニエを検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
上記試料をそれぞれ下記試薬に添加して、下記条件によりマイコプラズマ・ニューモニエを検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
試薬
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）４μＬ
１０μＭ フォワードプライマー（配列番号７）０．２μＬ
１００μＭ リバースプライマー（配列番号８）０．３μＬ
１０μＭ プローブ（配列番号９、５’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ標識）０．４μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１．３μＬ
試料４μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）４μＬ
１０μＭ フォワードプライマー（配列番号７）０．２μＬ
１００μＭ リバースプライマー（配列番号８）０．３μＬ
１０μＭ プローブ（配列番号９、５’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ標識）０．４μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１．３μＬ
試料４μＬ
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・６秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
マイコプラズマ・ニューモニエのカットオフ値：７．５
内部コントロールのカットオフ値：１．５
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・６秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
マイコプラズマ・ニューモニエのカットオフ値：７．５
内部コントロールのカットオフ値：１．５
結果
図３、４は、上記の条件で核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化について種々のフィルターの結果を横軸に、グラフの縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図３はマイコプラズマ・ニューモニエの結果を示しており、図４は内部コントロールの結果を示している。図３より明らかなように、フィルターありの場合でマイコプラズマ・ニューモニエが検出されている。しかし、フィルターなしの場合は、試料に含まれる物質のＰＣＲ阻害によりマイコプラズマ・ニューモニエが検出されていない。また、図４より、２０、１００μｍの焼結フィルター以外で内部コントロールが検出されていない。この結果から、マイコプラズマ・ニューモニエの遺伝子検査において、高感度な検査結果を得るには、特定の大きさの孔径の焼結フィルターを用いることが重要であることが明らかとなった。
図３、４は、上記の条件で核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化について種々のフィルターの結果を横軸に、グラフの縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図３はマイコプラズマ・ニューモニエの結果を示しており、図４は内部コントロールの結果を示している。図３より明らかなように、フィルターありの場合でマイコプラズマ・ニューモニエが検出されている。しかし、フィルターなしの場合は、試料に含まれる物質のＰＣＲ阻害によりマイコプラズマ・ニューモニエが検出されていない。また、図４より、２０、１００μｍの焼結フィルター以外で内部コントロールが検出されていない。この結果から、マイコプラズマ・ニューモニエの遺伝子検査において、高感度な検査結果を得るには、特定の大きさの孔径の焼結フィルターを用いることが重要であることが明らかとなった。
〔実施例４：肺炎マイコプラズマの検出〕
（１）試料の調製
マイコプラズマ・ニューモニエから抽出したＤＮＡ試料を１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１０（コピー／μＬ）となるように調製し、生理食塩水で懸濁した咽頭拭い液と混合して疑似生体試料とした。この試料を焼結フィルター（ポリエチレン製、孔径２０μｍ）で通過させて試料を調製した。また、フィルターろ過せず、従来法に従い遠心分離（１３，０００ｒｐｍで３分）した上清を、比較例の試料として使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料を下記試薬に添加して、下記条件によりマイコプラズマ・ニューモニエを検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
（１）試料の調製
マイコプラズマ・ニューモニエから抽出したＤＮＡ試料を１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１０（コピー／μＬ）となるように調製し、生理食塩水で懸濁した咽頭拭い液と混合して疑似生体試料とした。この試料を焼結フィルター（ポリエチレン製、孔径２０μｍ）で通過させて試料を調製した。また、フィルターろ過せず、従来法に従い遠心分離（１３，０００ｒｐｍで３分）した上清を、比較例の試料として使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料を下記試薬に添加して、下記条件によりマイコプラズマ・ニューモニエを検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
試薬
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）４μＬ
１０μＭ フォワードプライマー（配列番号７）０．２μＬ
１００μＭ リバースプライマー（配列番号８）０．３μＬ
１０μＭ プローブ（配列番号９、５’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ標識）０．４μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１．３μＬ
試料４μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）４μＬ
１０μＭ フォワードプライマー（配列番号７）０．２μＬ
１００μＭ リバースプライマー（配列番号８）０．３μＬ
１０μＭ プローブ（配列番号９、５’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ標識）０．４μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１．３μＬ
試料４μＬ
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・６秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
マイコプラズマ・ニューモニエのカットオフ値：７．５
内部コントロールのカットオフ値：１．５
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・６秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
マイコプラズマ・ニューモニエのカットオフ値：７．５
内部コントロールのカットオフ値：１．５
結果
図５は、上記の条件で核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。グラフはマイコプラズマ・ニューモニエの結果を示しており、フィルターろ過は焼結フィルターで試料をろ過した解析結果を、遠心分離は試料を遠心機で１３，０００ｒｐｍで３分間遠心し、その上清を試料とした解析結果を示している。図５より明らかなように、焼結フィルターろ過で処理したマイコプラズマ・ニューモニエの蛍光値が、遠心分離で処理した場合より蛍光値が高い。従って、本発明の遺伝子検査方法は、従来の遠心分離法よりも、簡便な方法でありながら、より高感度に検出できることが明らかとなった。
図５は、上記の条件で核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。グラフはマイコプラズマ・ニューモニエの結果を示しており、フィルターろ過は焼結フィルターで試料をろ過した解析結果を、遠心分離は試料を遠心機で１３，０００ｒｐｍで３分間遠心し、その上清を試料とした解析結果を示している。図５より明らかなように、焼結フィルターろ過で処理したマイコプラズマ・ニューモニエの蛍光値が、遠心分離で処理した場合より蛍光値が高い。従って、本発明の遺伝子検査方法は、従来の遠心分離法よりも、簡便な方法でありながら、より高感度に検出できることが明らかとなった。
〔実施例５：インフルエンザの検出〕
（１）試料の調製
インフルエンザ精製ＲＮＡを滅菌水で懸濁した鼻腔拭い液で１０００倍、２０００倍希釈し疑似生体試料とした。この試料を焼結フィルター（ポリプロピレン製、孔径２０μｍ）で通過させて試料を調製した。また、焼結フィルターでろ過しない試料も比較として使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料を下記試薬に添加して、下記条件によりインフルエンザＡ型を検出した。核酸増幅として、ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅを用いたリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにはＲｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑ（登録商標）を使用した。
（１）試料の調製
インフルエンザ精製ＲＮＡを滅菌水で懸濁した鼻腔拭い液で１０００倍、２０００倍希釈し疑似生体試料とした。この試料を焼結フィルター（ポリプロピレン製、孔径２０μｍ）で通過させて試料を調製した。また、焼結フィルターでろ過しない試料も比較として使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料を下記試薬に添加して、下記条件によりインフルエンザＡ型を検出した。核酸増幅として、ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅを用いたリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにはＲｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑ（登録商標）を使用した。
試薬
以下の試薬を含む溶液を調製した。
１０μＭ フォワードプライマー（配列番号１０）１μＬ
１０μＭ リバースプライマー（配列番号１１）１μＬ
１０μＭ プローブ（配列番号１２、５’末端をＦＡＭ、３’末端をＢＨＱ１）０．４μＬ、
ＱＲＺ－１０１（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（Ｒ）Ｐｒｏｂｅ Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｑＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ、東洋紡製）
試料４μＬ
以下の試薬を含む溶液を調製した。
１０μＭ フォワードプライマー（配列番号１０）１μＬ
１０μＭ リバースプライマー（配列番号１１）１μＬ
１０μＭ プローブ（配列番号１２、５’末端をＦＡＭ、３’末端をＢＨＱ１）０．４μＬ、
ＱＲＺ－１０１（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（Ｒ）Ｐｒｏｂｅ Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｑＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ、東洋紡製）
試料４μＬ
ＲＴ－ＰＣＲ条件
５０℃・１０分
９５℃・１分
（以上１サイクル）
９５℃・１５秒
６０℃・４５秒
（以上５０サイクル）
５０℃・１０分
９５℃・１分
（以上１サイクル）
９５℃・１５秒
６０℃・４５秒
（以上５０サイクル）
結果
図６は、上記の条件でリアルタイムＲＴ－ＰＣＲを行った解析結果を表した表である。フィルター有りは焼結フィルターで試料をろ過した場合の解析結果を、フィルターなしは試料を焼結フィルターでろ過しない場合の解析結果を示している。図６より明らかなように、焼結フィルターろ過で処理した場合のインフルエンザ試料のカットオフ値（Ｃｔ値）が、フィルターろ過しない場合より立ち上がりが早い。この結果より、焼結フィルターで前処理するだけで高感度な検査結果が得られることが明らかとなった。
図６は、上記の条件でリアルタイムＲＴ－ＰＣＲを行った解析結果を表した表である。フィルター有りは焼結フィルターで試料をろ過した場合の解析結果を、フィルターなしは試料を焼結フィルターでろ過しない場合の解析結果を示している。図６より明らかなように、焼結フィルターろ過で処理した場合のインフルエンザ試料のカットオフ値（Ｃｔ値）が、フィルターろ過しない場合より立ち上がりが早い。この結果より、焼結フィルターで前処理するだけで高感度な検査結果が得られることが明らかとなった。
〔実施例６：ノロウイルスＲＮＡの検出〕
（１）試料の調製
フロックスワブで採取したノロウイルスＧ２型を含む糞便試料を精製水に懸濁した試料を、焼結フィルター（ポリエチレン製、孔径１００μｍ）を含むろ過フィルターに通過させて試料を調製した。また、焼結フィルターでろ過しない試料も比較として使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料を下記試薬に添加して、下記条件によりノロウイルスＧ２型を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
（１）試料の調製
フロックスワブで採取したノロウイルスＧ２型を含む糞便試料を精製水に懸濁した試料を、焼結フィルター（ポリエチレン製、孔径１００μｍ）を含むろ過フィルターに通過させて試料を調製した。また、焼結フィルターでろ過しない試料も比較として使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料を下記試薬に添加して、下記条件によりノロウイルスＧ２型を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
試薬
ジーンキューブ（登録商標）テストベーシック（東洋紡社）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。反応液の調製等はジーンキューブ（登録商標）テストベーシックの取扱説明書に従った。
０．５μＭ ＣＯＧ２Ｆプライマー（配列番号１３）
１．５μＭ ＣＯＧ２Ｒプライマー（配列番号１４）
０．３μＭ ハイブリダイゼーションプローブ（配列番号１５、３’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ標識）
０．０５ｕｎｉｔ／μＬ Ｒｅｖｅｒｔｒａ Ａｃｅ（東洋紡社）
試料３μＬ
ジーンキューブ（登録商標）テストベーシック（東洋紡社）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。反応液の調製等はジーンキューブ（登録商標）テストベーシックの取扱説明書に従った。
０．５μＭ ＣＯＧ２Ｆプライマー（配列番号１３）
１．５μＭ ＣＯＧ２Ｒプライマー（配列番号１４）
０．３μＭ ハイブリダイゼーションプローブ（配列番号１５、３’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ標識）
０．０５ｕｎｉｔ／μＬ Ｒｅｖｅｒｔｒａ Ａｃｅ（東洋紡社）
試料３μＬ
逆転写反応、核酸増幅および融解曲線解析
４２℃ １８０秒（逆転写反応）
９４℃・３０秒
（以上１サイクル）
９８℃・１秒
６０℃・１０秒
６３℃・１０秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
Ｇ２のカットオフ値：７
内部コントロールのカットオフ値：１．５
４２℃ １８０秒（逆転写反応）
９４℃・３０秒
（以上１サイクル）
９８℃・１秒
６０℃・１０秒
６３℃・１０秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
Ｇ２のカットオフ値：７
内部コントロールのカットオフ値：１．５
結果
図７は、上記の条件でＲＴ－ＰＣＲを行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図７より明らかなように、フィルターありの場合でノロウイルスＧ２が検出されている。しかし、フィルターなしの場合は、蛍光値が低くカットオフ値以下となり、弱陽性となっている。この結果から、ノロウイルスＧ２遺伝子検査において、高感度な検査結果を得るには、焼結フィルターを用いることが重要であることが明らかとなった。
図７は、上記の条件でＲＴ－ＰＣＲを行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図７より明らかなように、フィルターありの場合でノロウイルスＧ２が検出されている。しかし、フィルターなしの場合は、蛍光値が低くカットオフ値以下となり、弱陽性となっている。この結果から、ノロウイルスＧ２遺伝子検査において、高感度な検査結果を得るには、焼結フィルターを用いることが重要であることが明らかとなった。
本発明の方法及びキットは、疾患の検出・診断等に利用することができる。
１：遺伝子検査キット本体（包装箱）
２：検体試料用ろ過チューブ
２１－ａ、２１－ｂ：焼結フィルター
３：スワブ（短繊維を付着したフロックスワブ）
３１：短繊維を付着した検体採取部分
３２：スワブ軸部
４：遺伝子検査試薬
４１：遺伝子検査試薬の容器本体
４２：遺伝子検査試薬の蓋部
２：検体試料用ろ過チューブ
２１－ａ、２１－ｂ：焼結フィルター
３：スワブ（短繊維を付着したフロックスワブ）
３１：短繊維を付着した検体採取部分
３２：スワブ軸部
４：遺伝子検査試薬
４１：遺伝子検査試薬の容器本体
４２：遺伝子検査試薬の蓋部
Claims (18)
- 綿棒またはスワブで採取されたヒト又は他の動物の口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、肺胞洗浄液、便懸濁液、直腸拭い液、膣分泌物、子宮頸管粘液、及び尿道擦過物からなる群から選択される検体試料を孔径１０～１００μｍの焼結フィルターによってろ過した後に、ろ過後の前記試料溶液中において核酸増幅を行いプローブをハイブリダイズさせて融解曲線分析を行うことにより、被検出対象の存在を検出又は定量することを特徴とする遺伝子検査方法。
- 焼結フィルターの素材がポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン及びポリメチルメタクリレートからなる群から選択される請求項１に記載の遺伝子検査方法。
- 遠心分離による前処理を必要としない請求項１又は２に記載の遺伝子検査方法。
- 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が呼吸器感染症の原因微生物若しくは該微生物由来の物質である請求項１～３のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
- 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項がインフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、アデノウイルス、Ａ群溶連菌、肺炎マイコプラズマ、百日咳菌、及び肺炎クラミジアからなる群から選択される病原微生物若しくは該微生物由来の物質である請求項４に記載の遺伝子検査方法。
- 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が下痢症の原因微生物若しくは該微生物由来の物質である請求項１～３のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
- 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項がノロウイルス、ロタウイルス、サポウイルス及び下痢症アデノウイルスからなる群から選択される病原微生物若しくは該微生物由来の物質である請求項６に記載の遺伝子検査方法。
- 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が性感染症の原因微生物若しくは該微生物由来の物質である請求項１～３のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
- 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が淋菌、クラミジア、マイコプラズマ、ウレアプラズマ、ＨＩＶ及びＨＰＶからなる群から選択される病原微生物若しくは該微生物由来の物質である請求項８に記載の遺伝子検査方法。
- 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項がヒト遺伝子多型の検出である請求項１～３のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
- 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が薬剤代謝酵素遺伝子の遺伝子多型、アルコール脱水素酵素遺伝子の遺伝子多型、アセトアルデヒド脱水素酵素
遺伝子の遺伝子多型、及びメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の遺伝子多型からなる群から選択されるヒト遺伝子多型である請求項１０に記載の遺伝子検査方法。 - ろ過フィルターが孔径の異なる複数のフィルターを重ねて構成されている、請求項１～１１のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
- 被検出対象を含む検体試料を最初に最大孔径を有するフィルターを通過させ、次いでより小さい孔径を有するフィルターを通過させる請求項１２記載の遺伝子検査方法。
- 前記プローブがＱプローブである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
- 更に、内部コントロールの検出を行う、請求項１～１４のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
- 以下を含む、検体試料中の被検出対象の存在を検査するための遺伝子検査キットであって、下記（１）の検体試料用ろ過チューブを使用して、綿棒またはスワブで採取されたヒト又は他の動物の口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、肺胞洗浄液、便懸濁液、直腸拭い液、膣分泌物、子宮頸管粘液、及び尿道擦過物からなる群から選択される検体試料を孔径１０～１００μｍの焼結フィルターによってろ過した後に、ろ過後の前記試料溶液中において核酸増幅を行いプローブをハイブリダイズさせて融解曲線分析を行うようにして用いられる、遺伝子検査キット：
（１）孔径１０～１００μｍの焼結フィルターを含むフィルターにより構成されたろ過フィルターを備えた検体試料用ろ過チューブ。 - さらに、検体採取器具として綿棒またはスワブを含む請求項１６記載の遺伝子検査キット。
- さらに、被検出対象の存在を検出又は定量することができる遺伝子検査試薬が充填されている容器を含む請求項１６又は１７に記載の遺伝子検査キット。
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|---|---|
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| JP2008122372A (ja) | 2006-10-19 | 2008-05-29 | Denka Seiken Co Ltd | 試料ろ過フィルターを用いる簡易メンブレンアッセイ方法及びキット |
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| CN104312913B (zh) * | 2014-10-17 | 2016-05-11 | 复旦大学附属华山医院 | 整合全血核酸提取、扩增即可视化检测肿瘤基因突变的微流控芯片及其应用 |
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2018
- 2018-03-15 JP JP2019506251A patent/JP7264046B2/ja active Active
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| 宇治家武史，簡便な遺伝子検査のツール「核酸クロマト法」，臨床化学，2007年，Vol. 36，pp. 19-24 |
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