CN108866042A - 一种微量rna的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微量RNA的提取方法。步骤:样本裂解：使血小板完全裂解并释放出RNA；RNA分离：采用核酸辅助沉淀剂结合磁珠法实现从样本中分离RNA；其中核酸辅助沉淀剂为糖原；RNA纯化：去除非特异性结合于磁珠的DNA和蛋白质杂质。本发明提供了一种适用于血小板的微量RNA提取方法，目的在于从低至1×105个血小板或10个细胞中分离到高质量且足量的RNA，以供下游实验和分析。

Description

一种微量RNA的提取方法
技术领域
本发明涉及生物领域，尤其涉及一种微量RNA的提取方法。
背景技术
RNA提取是进行以RNA研究为主的分子生物学研究的基础，是研究基因表达的关键步骤。血小板RNA检测作为一种新型液体活检技术，在癌症筛查与心血管疾病的研究和监控中有着极为重要的应用前景。1×105个血小板中总RNA含量约为100pg，其质量仅相当于10个白细胞的RNA。如何从起始量极少的样本中提取高质量的RNA应用于下游实验，是亟待解决的课题。
传统的酚氯仿法和CTAB法等RNA提取方法，所需样本的初始量大，需要大于1×105个细胞或5mg组织，无法进行微量样本RNA的提取。现有的吸附柱法采用硅胶膜技术，对样本的起始量亦有较严格的要求，且在洗脱过程中无法完全释放RNA，对RNA造成较大的损耗，使得得率降低。
传统方法采用醇沉方式沉淀RNA，然而在较大的体积中，微量RNA样本难以沉淀；并且已沉淀的微量样本由于肉眼不可见，很容易在后续的洗涤过程中损失。并且在采取去污剂裂解细胞的RNA提取方法中，去污剂(如CTAB、SDS等)的残留将极大影响后续反应。现有的柱提法与磁珠法大多数也只适用于大量RNA的提取，对于极微量RNA的提取也有洗脱体积的限制。
发明内容
本发明针对现有RNA提取技术的不足之处，提供一种适用于血小板的低起始量、高得率、高质量且安全的RNA提取方案，同时也适用于从痕量细胞中提取RNA。分离纯化后的RNA可直接用于后续实验，如实时荧光定量PCR和RNA测序等。目的在于从低至1×105个血小板或10个细胞中分离到高质量且足量的RNA，以供下游实验和分析。本发明主要针对传统RNA提取方法存在的起始量大、RNA得率低、杂质多、无法提取微量样本RNA等问题做出了改进，从痕量样本中所分离的RNA得率高、完整性好，符合下游实验的需求。洗脱体积小，也可在不经分离磁珠与核酸的条件下进行逆转录等下游实验。
为实现上述目的，本发明提供一种微量RNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤:
样本裂解：使血小板完全裂解并释放出RNA；
RNA分离：采用核酸辅助沉淀剂结合磁珠法实现从样本中分离RNA；其中核酸辅助沉淀剂为糖原；
RNA纯化：去除非特异性结合于磁珠的DNA和蛋白质杂质。
进一步，所述RNA纯化步骤后，还包括RNA洗脱步骤；优选的，所述RNA洗脱步骤为采用含核酸保护剂的洗脱液进行洗脱获得稳定的RNA溶液。
进一步，所述样本裂解为，取样本，加入裂解液，涡旋混匀，室温静置。
进一步，所述样本的体积量可低至10个细胞，或1×105个血小板。
进一步，所述裂解液含异硫氰酸胍和糖原；优选的，裂解液配方为：5M异硫氰酸胍，20mM EDTA，10mM Tris-HCl pH6.4，0.1％20mg/mL糖原；
任选的，当样本为一定体积的样本时，所述样本与裂解液L的体积比例为1:(3～5)；优选的，样本与裂解液L的体积比例为1:4。
进一步，所述RNA分离为，用缓冲液沉淀RNA，并使其吸附于磁珠B，其中缓冲液含有异丙醇和LiCl；优选的，缓冲液的配方为2M LiCl，80W/V％异丙醇。
进一步，所述RNA分离为，加入等体积缓冲液，颠倒混匀后短暂离心将液体甩下；再加入1/10体积磁珠B悬浮液涡旋混匀，室温静置；再将其置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附于管底和管壁，移去离心管中液体。
进一步，所述RNA纯化为，加入80v/v％乙醇，涡旋混匀；将其置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附于管底和管壁，移去离心管中液体，再重复此步骤；短暂离心，将磁珠收集于管底，将管置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附于管底，移去离心管中液体，开盖静置使残留的酒精完全挥发即可。
进一步，所述RNA纯化为，加入80％乙醇，涡旋混匀，将其置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附于管底和管壁，移去管中液体，重复洗涤1次，移去离心管中液体后，开盖使酒精完全挥发；将管从磁力架上取下，加入洗涤液D，涡旋混匀，室温放置，期间间隔轻弹混匀；再加入同样体积的洗涤液W，涡旋混匀，室温静置；将管置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附于管底和管壁，移去离心管中液体；再加入80％乙醇，涡旋混匀；将其置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附于管底和管壁，移去离心管中液体，再重复此步骤；短暂离心，将磁珠收集于管底，将管置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附于管底，移去离心管中液体，开盖静置使残留的酒精完全挥发即可。
进一步，所述RNA洗脱为，将管从磁力架上取下，加入洗脱液，轻弹混匀，短暂离心甩下；将管置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附于管底，转移洗脱液至干净的离心管中即可。
本发明采用含有高浓度异硫氰酸胍(GuSCN)的裂解液裂解细胞，除去样本中的细胞碎片及释放样本RNA。高浓度异硫氰酸胍能有效变性蛋白质、裂解细胞膜，释放细胞中的物质，抑制RNA酶活性，保证了RNA的完整性。其中的0.1％糖原(Glycogen)起到稳定RNA，并有助于下一步有效沉淀RNA的作用。
可选地，采用核酸辅助沉淀剂结合磁珠法从样本中高效分离RNA，其特征在于，溶液中的核酸可在高浓度异丙醇和LiCl的存在下产生疏水作用而被沉淀，同时溶液中的糖原使得RNA的沉淀更加完全。在异硫氰酸胍溶液中，磁珠表面的硅烷醇基团通过疏水作用、氢键作用和静电作用与核酸发生特异性结合。缓冲液的主要成分为异丙醇和LiCl，LiCl是一种可使RNA溶解度降低的强脱水剂，能沉淀RNA和蛋白质；糖原、异丙醇、LiCl能最大限度沉淀RNA。在异硫氰酸胍溶液中，磁珠表面的硅烷醇基团通过疏水作用、氢键作用和静电作用与核酸发生特异性结合，而不与其他杂质结合。
可选地，经过洗涤去除大部分的蛋白质等杂质后，采用DNAse I处理结合核酸的磁珠，可特异性地除去DNA杂质。
可选地，采用含核酸保护剂(糖原)的洗脱液获得稳定的RNA溶液，在低盐条件下，RNA从磁珠洗脱下来，且洗脱液中的糖原起到稳定RNA的作用。
80％乙醇洗涤除去部分残留的蛋白质。
如果为无白细胞污染的血小板，则不需除DNA；但80％乙醇洗涤不可省。
如果为白细胞污染的血小板，则除蛋白后，待酒精完全挥发后，使用含Dnase I的洗涤液D特异性地消化DNA，然后用80％乙醇除去Dnase I等杂质。
在去除其他杂质的同时，洗涤液W中异硫氰酸胍和糖原使RNA稳定结合于磁珠。
洗脱液中，Tris-HCl维持溶液pH，糖原辅助稳定RNA。低盐条件下，RNA从磁珠洗脱下来。
与现有技术相比，本发明提供了一种适用于血小板的微量RNA提取方法，目的在于从低至1×105个血小板或10个细胞中分离到高质量且足量的RNA，以供下游实验和分析。本发明主要针对传统RNA提取方法存在的起始量大、RNA得率低、杂质多等问题做出了改进，从痕量样本中所分离的RNA得率高、完整性好，符合下游实验的需求。本发明所述方法的洗脱体积小，且可控。
附图说明
图1是经本发明方法所得RNA的质量检测结果图。
图2是本发明方法所提的RNA进行逆转录并扩增再进行毛细管电泳的结果图。
图3是柱提法所提的RNA进行逆转录并扩增再进行毛细管电泳的结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下实施例中的试剂配方：
裂解液L：5M异硫氰酸胍，20mM EDTA，10mM Tris-HCl pH6.4，0.1W/V％糖原(20mg/mL)；
缓冲液A：2M LiCl，80W/V％异丙醇；
磁珠B：1000nm羟基修饰氧化硅纳米微球；
洗涤液D：10mM Tris-HCl pH7.5，2.5mM MgCl2，0.1mM CaCl2，0.2U/μL DNAse I(使用前加入)；
洗涤液W：0.3M异硫氰酸胍，0.1W/V％糖原(20mg/mL)，80W/V％异丙醇；
洗脱液E：10mM Tris-HCl pH 8.0，0.05W/V％糖原(20mg/mL)。
实施例1：微量RNA的提取
1、样本裂解：取1×105个血小板样本(例：体积为3μL)于1.5mL离心管，向离心管中加入4倍体积裂解液L(12μL)，涡旋混匀，室温静置5min，使得血小板完全裂解并释放RNA；
2、RNA分离：
(2)向离心管中加入等体积(15μL)缓冲液A，颠倒混匀后短暂离心将液体甩下；
(3)向离心管中加入1/10体积(3μL)磁珠B悬浮液(使用前摇匀)，涡旋混匀，室温静置3min；
(4)将离心管置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附于管底和管壁，移去离心管中液体；
3、RNA纯化：
(注：血小板无白细胞污染时，可跳过步骤5-9)
(5)将离心管从磁力架上取下，加入50μL 80％乙醇，涡旋混匀，将离心管置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附于管底和管壁，移去离心管中液体；
(6)重复洗涤1次，移去离心管中液体后，开盖1min使酒精完全挥发；
(7)将离心管从磁力架上取下，加入50μL洗涤液D，涡旋混匀，室温放置10min，期间每隔3分钟轻弹混匀1次；
(8)加入50μL洗涤液W，涡旋混匀，室温静置5min；
(9)将离心管置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附于管底和管壁，移去离心管中液体；
(10)将离心管从磁力架上取下，加入50μL 80％乙醇，涡旋混匀2min；
(11)将离心管置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附于管底和管壁，移去离心管中液体；
(12)重复步骤10；
(13)短暂离心，将磁珠收集于管底，将离心管置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附于管底，移去离心管中液体，开盖静置2min使残留的酒精完全挥发；
4、RNA洗脱
(14)将离心管从磁力架上取下，加入5-20μL洗脱液E(可根据样品量及后续实验需求对洗脱液的体积进行调整)，轻弹混匀2min，短暂离心甩下；
(注：可不经过下述步骤分离核酸与磁珠，直接用于逆转录等下游实验。)
(15)将离心管置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附于管底，转移洗脱液至干净的离心管中。
所得结果见图1，从图中的毛细吸管电泳可以看出，经本发明所分离的RNA完整性很高，符合下游实验的需求。用Promega QuantusTM Fluorometer荧光检测仪进行RNA定量，检测所得RNA总量为30-80pg。
分离所得RNA可直接用于下游实验，或于-80℃中保存1年。
以本方法所提RNA为模板，利用逆转录酶合成互补cDNA链，经过多轮扩增获得血小板全长cDNA的扩增产物并纯化，进行毛细管电泳，结果如图2所示，主峰在1976bp。采用柱提法提取相同细胞量的RNA，并经相同方法逆转录与扩增后进行毛细管电泳，结果如图3所示，cDNA主峰在200bp以下。合格的cDNA条带范围在300-7000bp，主峰为1500-2500bp。如果RNA存在降解或杂质多，将导致扩增失败或效率低，最终cDNA小片段多，主峰偏小(如图3所示)。对比本法(图2)与柱提法(图3)，本法所提RNA纯度高，完整性好，适于下游实验。
实施例2：微量RNA的提取
1、样本裂解：
(1)吸去96孔板中的培养基，向96孔板中加入30μL裂解液L，使其覆盖培养板中的贴壁细胞(细胞数<100个)，室温静置5min，使得细胞完全裂解并释放RNA；
(2)吹吸混匀(尽量不要产生气泡)，小心将所有液体转移至1.5mL离心管；
2、RNA分离：
(3)向离心管中加入等体积(30μL)缓冲液A，颠倒混匀后短暂离心将液体甩下；
(4)向离心管中加入1/10体积(6μL)磁珠B悬浮液(使用前摇匀)，涡旋混匀，室温静置3min；
(5)将离心管置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附于管底和管壁，移去离心管中液体；
3、RNA纯化：
(6)将离心管从磁力架上取下，加入50μL 80％乙醇，涡旋混匀，将离心管置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附于管底和管壁，移去离心管中液体；
(7)重复洗涤1次，移去离心管中液体后，开盖1min使酒精完全挥发；
(8)将离心管从磁力架上取下，加入50μL洗涤液D，涡旋混匀，室温放置10min，期间每隔3分钟轻弹混匀1次；
(9)加入50μL洗涤液W，涡旋混匀，室温静置5min；
(10)将离心管置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附于管底和管壁，移去离心管中液体；
(11)将离心管从磁力架上取下，加入50μL 80％乙醇，涡旋混匀2min；
(12)将离心管置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附于管底和管壁，移去离心管中液体；
(13)重复步骤10；
(14)短暂离心，将磁珠收集于管底，将离心管置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附于管底，移去离心管中液体，开盖静置2min使残留的酒精完全挥发；
4、RNA洗脱
(15)将离心管从磁力架上取下，加入5-20μL洗脱液E(可根据样品量及后续实验需求对洗脱液的体积进行调整)，轻弹混匀2min，短暂离心甩下；
(注：可不经过下述步骤分离核酸与磁珠，直接用于逆转录等下游实验。)
(16)将离心管置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附于管底，转移洗脱液至干净的离心管中。用Promega QuantusTM Fluorometer荧光检测仪进行RNA定量，检测所得RNA总量为820-1200pg。
分离所得RNA可直接用于下游实验，或于-80℃中保存1年。
采用TRIzol法提相同细胞的RNA，检测所得RNA总量为520-750pg。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种微量RNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤:
样本裂解：使血小板完全裂解并释放出RNA；
RNA分离：采用核酸辅助沉淀剂结合磁珠法实现从样本中分离RNA；其中核酸辅助沉淀剂为糖原；
RNA纯化：去除非特异性结合于磁珠的DNA和蛋白质杂质。
2.根据权利要求1所述微量RNA的提取方法，其特征在于，所述RNA纯化步骤后，还包括RNA洗脱步骤；优选的，所述RNA洗脱步骤为采用含核酸保护剂的洗脱液进行洗脱获得稳定的RNA溶液。
3.根据权利要求1或2所述微量RNA的提取方法，其特征在于，所述样本裂解为，取样本，加入裂解液，涡旋混匀，室温静置。
4.根据权利要求3所述微量RNA的提取方法，其特征在于，所述样本的体积量可低至10个细胞，或1×105个血小板。
5.根据权利要求3所述微量RNA的提取方法，其特征在于，所述裂解液含异硫氰酸胍和糖原；优选的，裂解液配方为：5M异硫氰酸胍，20mM EDTA，10mM Tris-HCl pH6.4，0.1％20mg/mL糖原。
6.根据权利要求1或2所述微量RNA的提取方法，其特征在于，所述RNA分离为，用缓冲液沉淀RNA，并使其吸附于磁珠B，其中缓冲液含有异丙醇和LiCl；优选的，缓冲液的配方为2MLiCl，80W/V％异丙醇。
7.根据权利要求6所述微量RNA的提取方法，其特征在于，所述RNA分离为，加入等体积缓冲液，颠倒混匀后短暂离心将液体甩下；再加入1/10体积磁珠B悬浮液涡旋混匀，室温静置；再将其置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附于管底和管壁，移去离心管中液体。
8.根据权利要求1或2所述微量RNA的提取方法，其特征在于，所述RNA纯化为，加入80v/v％乙醇，涡旋混匀；将其置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附于管底和管壁，移去离心管中液体，再重复此步骤；短暂离心，将磁珠收集于管底，将管置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附于管底，移去离心管中液体，开盖静置使残留的酒精完全挥发即可。
9.根据权利要求8所述微量RNA的提取方法，其特征在于，所述RNA纯化为，加入80％乙醇，涡旋混匀，将其置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附于管底和管壁，移去管中液体，重复洗涤1次，移去离心管中液体后，开盖使酒精完全挥发；将管从磁力架上取下，加入洗涤液D，涡旋混匀，室温放置，期间间隔轻弹混匀；再加入同样体积的洗涤液W，涡旋混匀，室温静置；将管置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附于管底和管壁，移去离心管中液体；再加入80％乙醇，涡旋混匀；将其置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附于管底和管壁，移去离心管中液体，再重复此步骤；短暂离心，将磁珠收集于管底，将管置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附于管底，移去离心管中液体，开盖静置使残留的酒精完全挥发即可。
10.根据权利要求2所述微量RNA的提取方法，其特征在于，所述RNA洗脱为，将管从磁力架上取下，加入洗脱液，轻弹混匀，短暂离心甩下；将管置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附于管底，转移洗脱液至干净的离心管中即可。
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