CN102533724B - 一种用于生物样品中核酸提取纯化的细胞裂解试剂 - Google Patents

Abstract

本发明为一种用于生物样品中核酸提取纯化的细胞裂解试剂，该试剂溶液呈碱性并含有胍盐、铵根离子及表面活性剂成分，在碱性液相环境下能更充分裂解生物样品中的细胞，并能促进释放到细胞外的核酸(DNA/RNA)与固相材料的结合吸附，最后通过洗脱步骤将核酸从固相材料上分离下来。本发明的细胞裂解试剂具有操作简便、核酸提取得率高的优点，可用于全血、血清、血浆、唾液、尿液、脑脊液、细胞和组织培养液或者人鼻咽、泌尿生殖道拭子等各种类型生物样品中核酸的提取纯化。

Description

一种用于生物样品中核酸提取纯化的细胞裂解试剂

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及生物样品中的细胞裂解与核酸提取纯化。

背景技术

核酸(包括DNA和RNA)提取纯化是分子生物学中的一项基本操作。在细胞中核酸总是与各种蛋白质结合在一起的，核酸提取分离主要是指将核酸从生物样品细胞中释放到胞外，并与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子分开，提取的核酸应保证其分子一级结构的完整性，并排除其它杂质分子污染，才能更好满足下游核酸杂交、扩增、测序等分子生物学基因操作或临床基因检测对核酸模板质量的要求。

目前在分子生物学或临床基因诊断中常见的核酸提取纯化方法有：经典的酚氯仿提取法、表面活性剂加热碱裂解提取法、基于二氧化硅吸附的硅胶膜(或玻璃纤维膜，下同)离心柱法核酸提取，以及基于二氧化硅表面修饰磁性颗粒(磁珠)吸附的核酸提取等。目前经典方法由于操作复杂，提取结果不稳定在临床基因检测中已较少使用；表面活性剂加热碱裂解法提取虽然操作简便，但由于提取的核酸含有大量杂质，容易影响了下游检测导致结果假阴性；离心柱法和磁珠法提取的核酸纯度较高，且能实现操作自动化，具有提取高效、便捷、大通量的优点，代表了未来临床诊断中核酸提取技术的发展方向。

目前，市场上已经有许多硅胶膜离心柱法或磁珠法核酸提取试剂用于生物样品处理与核酸提取，其中的细胞裂解液通常含有高离盐和表面活性剂等成分，高离盐主要是胍盐，包括异硫氰酸胍、盐酸胍等，表面活性剂主要有十二烷基磺酸钠(SDS)、Tween20、TritonX-100、NP-40、十二烷基肌氨酸钠、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)等，它们能使蛋白质变性进而细胞膜破裂，释放的核酸在高离环境中与硅胶膜或磁珠吸附结合，进一步通过洗涤步骤除去硅胶膜或磁珠表面的杂质，最后经过洗脱步骤可以获得纯化的核酸(专利200710009524.7；200810200588.X；201010135963.4)。在实际操作中，由于胍盐具有降低溶液pH值的作用，这些细胞裂解液中的胍盐在pH值近中性或偏酸性的条件容易产生沉淀，不仅带来试剂需要加热溶解和吸取操作不方便的不足，而且影响样品中细胞裂解效果、降低了核酸提取的得率。

发明内容

本发明的目的是提供一种改进的细胞裂解试剂，它呈碱性并含有胍盐、铵根离子和表面活性剂成分，能在碱性液相环境下裂解生物样品中的细胞，并促进释放的核酸与基于二氧化硅材质的固相材料吸附结合，最后通过对固相材料的洗脱步骤，获得纯净的核酸，改进的细胞裂解试剂提取生物样品核酸具有细胞裂解充分、操作简便、核酸提取得率高的优点，适合于分子生物学基因操作或临床基因诊断领域中各种类型生物样品的核酸提取纯化。

技术方案

本发明提供一种用于生物样品中核酸提取纯化的细胞裂解试剂，试剂呈碱性且主要成分为胍盐、铵根离子和表面活性剂，具体组成说明如下：

(1)胍盐：可以是但不限于异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍、碳酸胍、磷酸胍、硝酸胍等，在试剂中的浓度为2-8M，优选的胍盐为异硫氰酸胍和盐酸胍，浓度为6M。

(2)铵根离子：由加入氨水或通入氨气提供铵根离子并保持试剂呈碱性，铵根离子浓度为0.1-1M、试剂pH值8-13，优选的铵根离子浓度为0.5M、试剂最终pH值约9.0。

(3)表面活性剂：可以是但不限于SDS、Tween20、TritonX-100、NP-40、十二烷基肌氨酸钠、CTAB等或其中1-3种的组合，浓度为1-20％，优选的表面活性剂为SDS和TritonX-100，优选的浓度各为1％和10％。

此外，细胞裂解试剂中还可以有pH缓冲介质(50mMTris-HCl)和金属螯合剂(25mMEDTA)，用于稳定体系pH值，并除去作为核酸酶活性辅因子的金属离子。

配制的细胞裂解试剂适合置于室温保存。

使用方法

本发明还提供了细胞裂解试剂的使用方法之一如下：

(1)细胞裂解与核酸释放：细胞裂解试剂与全血、血清、血浆、唾液、尿液、脑脊液、细胞和组织培养液等生物样品等体积均匀混合，室温放置10min；泌尿生殖道或咽拭子样品需先用生理盐水振荡清洗，然后吸取漂洗液加入细胞裂解试剂提取核酸。

(2)生物样品裂解混合液与固相材料结合：如固相材料为硅胶柱，则将混合液上柱离心弃滤液，柱子硅胶膜上结合吸附有核酸；如固相材料为磁性颗粒，则在第一步样品裂解时就将磁性颗粒加入混合液一起放置，每2min将液体中的磁珠混匀悬浮一次，10min后加磁吸弃液体，磁性颗粒上结合吸附有核酸。

(3)结合有核酸的固相材料的洗涤：分别采用洗涤液(20mMTris-HCl[pH8.0]、0.5MNaCl、1mMEDTA、30％乙醇)和80％乙醇各500μl洗涤固相材料各一次，离心(对硅胶膜柱)或加磁(对磁性颗粒)吸弃洗涤废液。

(4)固相材料上的核酸洗脱：在硅胶柱膜上或磁性颗粒中加入50-100μlTE(pH8.0)，离心或混匀加磁后获得的洗脱液即为从生物样品中提取纯化的总核酸(DNA和RNA)。

上述操作步骤所需时间在30min以内。

有益效果

本发明根据上述设计的技术方案，通过筛选细胞裂解试剂中的关键组分，并优化组分浓度与使用方法，研制成适用于各种类型生物样品核酸提取纯化的细胞裂解试剂，其主要特点如下：

(1)细胞裂解试剂呈碱性(pH约9.0)，使得胍盐组分即使在较低室温下也不会形成沉淀，不仅方便使用，还有利于生物材料中细胞的充分裂解和获得高得率的纯化核酸；

(2)试剂在室温条件下使用，无需加热或蛋白酶处理等额外步骤，操作简便，成本低廉，对全血样本可直接裂解无需前处理分离红细胞，快速提取30min内完成操作；

(3)试剂适用于生物样品中总核酸(DNA/RNA)的提取，方便下游基因操作检测。

(4)试剂不使用苯酚氯仿毒性有机溶剂，对操作人员无毒害作用；

试剂盒的上述特点，均为采用筛选的关键组分与浓度优化后获得的较佳细胞裂解试剂直接引起。从原理上说，本发明细胞裂解试剂利用化学作用在室温条件下裂解各种类型生物样品中的细胞，试剂中的胍盐是蛋白质与核酸的强变性剂、核酸与二氧化硅材质固相材料结合吸附的促进剂，特别是由于筛选到的关键组分铵根离子与优选的表面活性剂的协同作用，不仅能使细胞充分裂解、使失去次级结构的变性核酸分子与变性蛋白分子之间相互分离、还能保持核酸在裂解混合液中的稳定性；细胞裂解试剂结合固相材料的使用，从生物样品中提取的核酸产量大大提高。本发明的技术方案设计合理，可以广泛应用于全血、血清、血浆、唾液、尿液、脑脊液、细胞和组织培养液，或者是从鼻咽部、泌尿生殖道等部位采集的拭子等不同类型生物样品核酸的提取纯化。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以通过技术常识对本发明作各种技术性改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明中所涉及的主要试剂说明：

异硫氰酸胍和盐酸胍等胍盐、氨水为分析纯，SDS、TritonX-100和Tween20等表面活性剂为生物级纯度，上述化学试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。HighpureTotalNucleicAcidKit(硅胶膜法)购自罗氏诊断产品(上海)有限公司；台塑DNA/RNA萃取试剂(磁珠法)购自台塑生医科技股份有限公司；乙型肝炎病毒(HBV)核酸荧光定量PCR检测试剂盒与甲型H1N1病毒核酸荧光PCR检测试剂盒为上海克隆生物高技术有限公司产品。

实施例1：细胞裂解试剂的配制

按照发明内容，首先配制基础试剂100mMTris-HCl(pH7.0)和50mMEDTA，加入其它组分后获得以下五种细胞裂解试剂：

(1)细胞裂解试剂A

50mMTris-HCl，25mMEDTA，盐酸胍6M，SDS1％(w/v)，TritonX-10010％(v/v)，加入氨水使NH₄ ⁺浓度为0.5M，试剂pH值约9.0。

(2)细胞裂解试剂B

50mMTris-HCl，25mMEDTA，盐酸胍6M，SDS1％(w/v)，TritonX-10010％(v/v)，用10％NaOH调节试剂pH值约9.0。

(3)细胞裂解试剂C

50mMTris-HCl，25mMEDTA，异硫氰酸胍2M，TritonX-10020％(v/v)，加入氨水使NH₄ ⁺浓度为1M，试剂pH值约13.0。

(4)细胞裂解试剂D

50mMTris-HCl，25mMEDTA，盐酸胍8M，TritonX-1001％(v/v)，加入氨水使NH₄ ⁺浓度为0.5M，试剂pH值约9.0。

(5)细胞裂解试剂E

50mMTris-HCl，25mMEDTA，异硫氰酸胍6M，SDS10％(w/v)，加入氨水使NH₄ ⁺浓度为0.1M，试剂pH值约8.0。

同时还配制洗涤液(20mMTris-HCl[pH8.0]、0.5MNaCl、1mMEDTA、30％乙醇)、80％乙醇以及TE溶液(pH8.0)。

上述配制的细胞裂解试剂适合置于室温保存。

实施例2：细胞裂解试剂在血清乙肝病毒DNA提取中的应用

(1)血清样本HBVDNA提取

以中国药品生物制品检定所乙肝病毒(HBV)核酸定量标准品标定的3种浓度的HBVDNA阳性血清为待测定样本(浓度各为5.0×10²IU/ml、5.0×10⁴IU/ml、5.0×10⁶IU/ml)，测定实施例1中的五种细胞裂解试剂提取血清HBVDNA的效果。

实验中以罗氏HighpureTotalNucleicAcidKit(硅胶膜法)为核酸提取对照试剂，配制的细胞裂解试剂使用的固相材料为罗氏对照试剂中的硅胶膜柱。对照核酸提取试剂操作按照罗氏公司提供的试剂盒说明书进行，每组高中低三种浓度样本体积各为200μl，最后核酸用50μl洗脱缓冲液中硅胶膜柱上分离下来。自配的细胞裂解试剂使用操作步骤如下：

①5种细胞裂解试剂分别提取高中低三种浓度血清样本，裂解试剂和样本体积各为200μl，置于1.5ml离心管均匀混合，室温放置10min。

②将上述混合液分别转移到罗氏硅胶柱/套管中，8000rpm离心30sec，取出硅胶柱/套管，弃滤液。

③在硅胶柱/套管中加入500μl洗涤液，10000rpm离心30sec，取出硅胶柱/套管，弃滤液。

④在硅胶柱/套管中加入500μl80％乙醇，10000rpm离心30sec，取出硅胶柱/套管，弃滤液；将硅胶柱/套管13000rpm离心1min，去除硅胶柱中的残液。

⑤将硅胶柱放入一新的套管，在柱中加入50μlTE，室温放置1min，8000rpm离心1min，滤液即为洗脱提取到的核酸，含有从血清中提取的HBVDNA。

上述细胞裂解试剂提取核酸全部操作步骤所需时间约20min。

另外，还采用HBV荧光定量PCR试剂盒自带的核酸提取试剂(表面活性剂加热碱裂解法)提取上述高中低浓度血清样本核酸，并与罗氏对照提取试剂、自配的细胞裂解试剂提取的核酸一起，准备用于荧光PCR扩增检测。

(2)荧光PCR检测

根据上海克隆生物高技术有限公司HBV荧光定量PCR试剂盒说明书配制检测试剂，取HBVPCR缓冲液30×30μl、MgCl₂30×5μl、荧光探针30×5μl、Taq酶30×3μl混于一离心管中，旋涡振荡器上振荡混匀10秒，按每个反应管43μl分装。分别加入试剂盒阴性对照和定量校准品、以及上述不同试剂提取的21个血清样品模板各7μl。每个反应管体积为50μl，将上述反应管放到ABI7500荧光PCR仪上，反应管先在50℃反应2分钟，然后94℃保温5分钟，再按93℃30秒→60℃90秒循环40次。60℃采集FAM荧光通道的信号。扩增结束后按照试剂盒说明书分析判断实验结果。

(3)结果分析

罗氏对照核酸提取试剂、配制的5种细胞裂解试剂结合硅胶膜柱分别提取高中低浓度HBV血清样本检测结果如表1所示。从试剂盒检测Ct值和HBVDNA定量值可知，本发明配制的5种细胞裂解试剂结合硅胶膜柱能用于提取血清中的HBVDNA，特别是按照优选配方配制的细胞裂解试剂A，较其它4组试剂以及两种对照提取试剂效果更好；HBV荧光定量PCR试剂盒中自带核酸提取试剂基于传统的表面活性剂加热碱裂解法，由于提取的核酸中含有较多杂质，样本荧光PCR检测结果显示Ct值较其它各组滞后、HBVDNA定量值偏低。

表1细胞裂解试剂对血清HBVDNA的提取检测

注：对照提取试剂1为罗氏Highpuretotalnucleicacidkit(硅胶膜法)，对照提取试剂2为HBV荧光定量PCR试剂盒自带核酸提取试剂。

实施例3：细胞裂解试剂在鼻咽拭子甲型H1N1流感病毒RNA提取中的应用

(1)样本处理

取临床采集、经鉴定为甲型H1N1流感病毒阳性的鼻咽拭子3个，在每个拭子收集管中加入1.5ml生理盐水，用漩涡混合器充分振荡，收集漂洗液用于核酸提取。然后以台塑DNA/RNA萃取试剂(磁珠法)为对照核酸提取试剂，比较实施例1中配制的5种细胞裂解试剂对鼻咽拭子中甲流病毒RNA的提取效果。

台塑磁珠法核酸提取试剂操作按其说明书进行，3个拭子漂洗液各吸取200μl，提取后各用100μl洗脱缓冲液将核酸从磁珠上分离下来。实施例中配制的细胞裂解试剂使用的固相材料为台塑对照试剂中的磁珠，核酸提取操作步骤如下：

①5种细胞裂解试剂分别提取3个拭子漂洗液样本，裂解试剂和样本体积各为200μl，置于1.5ml离心管，同时每个加入40μl台塑磁珠(与台塑核酸提取试剂中磁珠使用体积相同)，漩涡混合，室温放置10min，每隔2min将液体中的磁珠悬浮混匀一次。

②将离心管置于磁架上，待磁珠被磁力吸附到管壁一侧，用移液器吸弃液体后将离心管从磁架上取下。

③在离心管中加入500μl洗涤液，漩涡振荡混匀后将离心管置于磁架上，待磁珠被磁力吸附到管壁一侧，用移液器吸弃液体，将离心管从磁架上取下。

④在离心管中加入500μl80％乙醇，漩涡振荡混匀后将离心管置于磁架上，待磁珠被磁力吸附到管壁一侧，用移液器完全吸弃液体，将离心管从磁架上取下。

⑤在上述离心管中加入100μlTE，和磁珠漩涡混匀后室温放置1min，然后将离心管置于磁架上，待磁珠被磁力吸附到管壁一侧，用移液器吸取的洗脱液即为从鼻咽拭子中提取的核酸，含有甲型H1N1流感病毒RNA。

上述细胞裂解试剂提取核酸全部操作步骤所需时间约26min。将台塑对照提取试剂、自配的细胞裂解试剂提取的核酸一起，准备用于扩增检测。

(2)荧光PCR检测

根据上海克隆生物高技术有限公司甲型H1N1病毒核酸荧光PCR检测试剂盒说明书配制检测试剂，取RT-PCR缓冲液22×12.5μl、引物探针I管22×2μl、混合酶22×0.5μl混于一离心管中，旋涡振荡器上振荡混匀10秒，按每个反应管15μl分装。分别加入试剂盒阴性对照和阳性对照、以及上述不同核酸提取试剂分离获得的18个核酸模板各10μl。每个反应管体积为25μl，将上述反应管放到ABI7500荧光PCR仪上，反应管先在50℃反应15分钟，然后95℃保温2分钟，再按94℃15秒→55℃40秒，循环50次，55℃采集FAM荧光通道的信号。扩增结束后按照试剂盒说明书分析判断实验结果。

(4)检测结果

台塑对照核酸提取试剂、配制的5种细胞裂解试剂结合磁珠固相材料分别提取3个拭子样本核酸，并经甲型H1N1流感病毒荧光PCR检测试剂盒检测，结果如表2所示。从试剂盒检测样本的Ct值可知，本发明配制的5种细胞裂解试剂结合磁珠固相材料可以用于人鼻咽拭子中甲型H1N1流感病毒RNA的提取，并且以按照优选配方配制的细胞裂解试剂A提取病毒RNA效率最高，而台塑对比提取试剂和细胞裂解试剂C-E提取效果相当。

表2细胞裂解试剂对鼻咽拭子中甲型H1N1流感病毒RNA的提取检测

Claims (14)

1.一种用于生物样品中核酸提取纯化的细胞裂解试剂，其特征在于，细胞裂解试剂呈碱性并含有胍盐、铵根离子(NH₄ ⁺)以及表面活性剂，与固相材料组合使用可以提取纯化样品中的核酸。

2.如权利要求1所述的细胞裂解试剂，细胞裂解试剂中的胍盐是指异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍、碳酸胍、磷酸胍或者硝酸胍；铵根离子来源于氨水或氨气；表面活性剂是指十二烷基磺酸钠(SDS)、Tween20、TritonX-100、NP-40、十二烷基肌氨酸钠、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)或者它们1-3种的组合。

3.如权利要求1所述的细胞裂解试剂，细胞裂解试剂中的胍盐浓度为2-8M。

4.如权利要求3所述的细胞裂解试剂，细胞裂解试剂中的胍盐为异硫氰酸胍或盐酸胍，浓度为6M。

5.如权利要求1所述的细胞裂解试剂，细胞裂解试剂中的铵根离子浓度为0.1-1M。

6.如权利要求5所述的细胞裂解试剂，细胞裂解试剂中的铵根离子浓度为0.5M。

7.如权利要求1所述的细胞裂解试剂，细胞裂解试剂中的表面活性剂浓度为1-20％。

8.如权利要求7所述的细胞裂解试剂，细胞裂解试剂中的表面活性剂为SDS和TritonX-100，浓度各为1％和10％。

9.如权利要求1所述的细胞裂解试剂，细胞裂解试剂呈碱性，pH值为8-13。

10.如权利要求9所述的细胞裂解试剂，细胞裂解试剂pH值为9.0。

11.如权利要求1所述的细胞裂解试剂，涉及的生物样品包括全血、血清、血浆、唾液、尿液、脑脊液、细胞培养液、组织培养液、或者是从人鼻咽部或泌尿生殖道部位采集的拭子。

12.如权利要求1所述的细胞裂解试剂，固相材料是指具有二氧化硅材质的硅胶膜或玻璃纤维膜、或者二氧化硅表面修饰的磁性颗粒材料。

13.如权利要求1所述的细胞裂解试剂，在细胞裂解试剂中释放的核酸与固相材料结合后，经过洗脱步骤从固相材料上分离获得纯化的核酸。

14.如权利要求1所述的细胞裂解试剂，细胞裂解试剂分离纯化的核酸是指样品中的总核酸，包括DNA和RNA。