CN112195175A - 基于氧化石墨烯的核酸提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于氧化石墨烯的核酸提取方法。本发明的技术方案是提供一种含有氧化石墨烯的核酸提取试剂。本发明所述的方法其原理是利用氧化石墨烯的自身特性及氧化石墨烯表面的大量官能团，在短时间内裂解生物样品中的细胞，并能特异性的吸附细胞分解后释放出的核酸上吸附的蛋白质，使核酸充分的游离出来，方便离子柱或磁珠的抓取，从而获得纯净的核酸。本发明提供的核酸提取方法包括以下步骤：细胞裂解、核酸吸附、样品洗涤、核酸洗脱。本发明所述的核酸提取方法在提取生物样品中的核酸时，具有操作简便、核酸分离充分、核酸提取得率高的优点，适合于分子生物学基因操作或临床基因诊断领域中各种类型生物样品的核酸提取纯化。

Description

基于氧化石墨烯的核酸提取方法
技术领域
本发明属于新材料应用技术领域，具体涉及一种基于氧化石墨烯的核酸提取方法。
背景技术
自20世纪50年代以来，分子生物学就一直是生物学的前沿与生长点。而随着分子生物学技术的不断完善，它使整个生命科学的研究上升到一个全新的阶段。分子生物学主要的研究领域就是细胞中的遗传因子，即我们所说的核酸。在细胞中，核酸总是与各种蛋白质结合在一起的，分子生物学中的最一项基本操作就是将核酸从细胞中提取出来。核酸的提取主要是指将核酸从生物样品细胞中释放到胞外，并与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子分开，提取的核酸应保证其分子一级结构的完整性，并排除其它杂质分子污染，才能更好满足下游核酸杂交、扩增、测序等分子生物学基因操作或临床基因检测对核酸模板质量的要求。
常见的核酸提取纯化方法有：酚氯仿提取法、表面活性剂加热碱裂解提取法、离心柱法，及磁珠法等。目前酚氯仿提取法由于操作复杂，提取结果不稳定在临床基因检测中已较少使用；表面活性剂加热碱裂解法提取虽然操作简便，但由于提取的核酸含有大量杂质，容易影响了下游检测导致结果假阴性；离心柱法和磁珠法提取的核酸纯度较高，且能实现操作自动化，具有提取高效、便捷、大通量的优点。
市场上离心柱法或磁珠法在生物样品处理与核酸提取过程中所用的细胞裂解液通常含有高离盐和去垢剂等成分，其原理由去污剂使蛋白质变性进而细胞膜破裂，释放的核酸在高离盐环境中与离心柱或磁珠吸附结合，进一步通过洗涤步骤除去离心柱或磁珠表面的杂质，最后经过洗脱步骤可以获得纯化的核酸。在实际操作中，由于大多数的高离盐具有降低溶液pH 值的作用，这些细胞裂解液中的高离盐在pH 值近中性或偏酸性的条件容易产生沉淀，不仅带来试剂需要加热溶解和吸取操作不方便的不足，而且影响样品中细胞裂解效果、降低了核酸提取的得率。筛选出一种既高效、稳定的核酸提取方法就成为当前研究亟需解决的问题。
近年来，随着纳米技术的快速发展，纳米材料已广泛的运用于生命科学领域，氧化石墨烯作为其中的明星材料，广泛运用于材料学、分子诊断学等方面，除了它本身优良的性能外，它还具有良好的抗菌能力。经过研究，这是因为氧化石墨烯表面分布着大量的亲水氧化基团，正是这些亲水氧化基团高关联的分布特点使氧化石墨烯有着类似的破坏细胞膜的能力，不仅如此，氧化石墨烯表面存在的未氧化区域里的石墨烯还会大量的吸附细胞内游离的磷脂分子，净化提纯环境。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于氧化石墨烯的核酸提取方法，不仅能在短时间内裂解生物样品中的细胞，还能特异性的吸附细胞分解后核酸上吸附的蛋白质，使核酸充分的游离出来，方便离子柱或磁珠的抓取，从而获得纯净的核酸。
为实现上述目的，本发明所使用的技术方案是提供一种含氧化石墨烯的核酸提取试剂，具体组成如下。
(1) 氧化石墨烯，其浓度为0.01-0.1%。
(2) 表面活性剂：可以是但不限于DTAB、DDAB、Triton X-100、EDDAB等或其中2-3种的组合，浓度为0.5-5.0％，优选的表面活性剂为DTAB和DDAB，优选的浓度各为0.5％和1.0％。
配制的核酸提取试剂适合置于室温保存。
本发明所述的核酸提取试剂的使用方法如下。
(1) 细胞裂解：核酸提取试剂与全血、血清、血浆、唾液、尿液、脑脊液、细胞和组织培养液等生物样品等体积均匀混合，室温放置10min ；泌尿生殖道或口腔拭子样品需先用生理盐水振荡清洗，然后吸取漂洗液加入核酸提取试剂提取核酸。
(2) 核酸吸附：将离子柱或磁珠等磁性材料，放入裂解液中振荡10min，核酸则吸附在离子柱或磁珠等磁性材料上。
(3) 样品洗涤：分别采用洗涤液1和洗涤液2洗涤固相材料各一次，洗液弃去。
(4) 核酸洗脱：在离子柱上或磁珠等磁性颗粒中加入50-100μl TE(pH8.0)，振荡洗脱10min，获得的洗脱液即为从生物样品中提取纯化的核酸。
本发明的有益效果是：本发明所述的核酸提取方法在提取生物样品中的核酸时，具有操作简便、核酸分离充分、核酸提取得率高的优点，适合于分子生物学基因操作或临床基因诊断领域中各种类型生物样品的核酸提取纯化。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以通过技术常识对本发明作各种技术性改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1。
配制核酸提取试剂：0.01% 氧化石墨烯溶液，0.5% DTAB，1.0% DDAB，用10％ NaOH调节试剂pH 值约9.0。
同时还配制洗涤液1(200mM Tris-HCl[pH8.0]、25mM NaCl、31mM EDTA、17mM SDS、70％无水乙醇)、洗涤液2（无水乙醇）以及TE 溶液(pH8.0)。
核酸提取试剂在全血 DNA 提取中的应用。
1）、选取50-200μl新鲜全血样本于1.5ml离心管中，加入100-500μl核酸提取试剂和50-200mg/L的纳米磁珠10-30μl，振荡混匀1 min，室温静置10分钟。
2）、将步骤 1）的离心管中置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁后，用无菌移液枪头吸弃上清液。
3）、使用无菌移液枪头向步骤 2）离心管中加入500-800μl洗涤液1，振荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁后，用无菌移液枪头吸弃上清液。
4）、使用无菌移液枪头向步骤 3）离心管中加入100-200μl洗涤液2，振荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁后，用无菌移液枪头吸弃上清液，室温干燥10-20min至管内无液体残留。
5）、使用无菌移液枪头向步骤 4）离心管中加入100-200μl TE溶液，60℃水浴5-10min。
6）、将步骤 5）离心管振荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁后，用无菌移液枪头吸取上清液至新的离心管，即获得全血DNA。
实施例2。
配制核酸提取试剂：0.05% 氧化石墨烯溶液，1.0% DDAB，5% Triton X-100，1%EDDAB，用10％ NaOH 调节试剂pH 值约8.0。
同时还配制洗涤液1(200mM Tris-HCl[pH8.0]、25mM NaCl、31mM EDTA、17mM SDS、70％无水乙醇)、洗涤液2（无水乙醇）以及TE 溶液(pH8.0)。
核酸提取试剂在全血 DNA 提取中的应用。
1）、选取50-200μl新鲜全血样本于1.5ml离心管中，加入100-500μl核酸提取试剂和50-200mg/L的纳米磁珠10-30μl，振荡混匀1 min，室温静置10分钟。
2）、将步骤 1）的离心管中置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁后，用无菌移液枪头吸弃上清液。
3）、使用无菌移液枪头向步骤 2）离心管中加入500-800μl洗涤液1，振荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁后，用无菌移液枪头吸弃上清液。
4）、使用无菌移液枪头向步骤 3）离心管中加入100-200μl洗涤液2，振荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁后，用无菌移液枪头吸弃上清液，室温干燥10-20min至管内无液体残留。
5）、使用无菌移液枪头向步骤 4）离心管中加入100-200μl TE溶液，60℃水浴5-10min。
6）、将步骤 5）离心管振荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁后，用无菌移液枪头吸取上清液至新的离心管，即获得全血DNA。
实施例3。
配制核酸提取试剂：0.1% 氧化石墨烯溶液，0.5% DTAB，1.0% DDAB，1% EDDAB，用10％ NaOH 调节试剂pH 值约9.0。
同时还配制洗涤液1(200mM Tris-HCl[pH8.0]、25mM NaCl、31mM EDTA、17mM SDS、70％无水乙醇)、洗涤液2（无水乙醇）以及TE 溶液(pH8.0)。
核酸提取试剂在全血 DNA 提取中的应用。
1）、选取50-200μl新鲜全血样本于1.5ml离心管中，加入100-500μl核酸提取试剂和50-200mg/L的纳米磁珠10-30μl，振荡混匀1 min，室温静置10分钟。
2）、将步骤 1）的离心管中置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁后，用无菌移液枪头吸弃上清液。
3）、使用无菌移液枪头向步骤 2）离心管中加入500-800μl洗涤液1，振荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁后，用无菌移液枪头吸弃上清液。
4）、使用无菌移液枪头向步骤 3）离心管中加入100-200μl洗涤液2，振荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁后，用无菌移液枪头吸弃上清液，室温干燥10-20min至管内无液体残留。
5）、使用无菌移液枪头向步骤 4）离心管中加入100-200μl TE溶液，60℃水浴5-10min。
6）、将步骤 5）离心管振荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁后，用无菌移液枪头吸取上清液至新的离心管，即获得全血DNA。
上述实施例为本发明优选的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种含氧化石墨烯的核酸提取试剂，其特征如下：该试剂主要成分有氧化石墨烯，表面活性剂，剩余溶剂为无核酸酶水。
2. 如权利要求1 所述的核酸提取试剂中氧化石墨烯的优选的浓度为0.01-0.1%。
3. 如权利要求1 所述的核酸提取试剂中表面活性剂可以是但不限于DTAB、DDAB、Triton X-100、EDDAB等或其中2-3 种的组合。
4. 如权利要求3 所述表面活性剂浓度为0.5-5.0％。
5. 如权利要求4 所述表面活性剂为DTAB和DDAB，浓度各为0.5％和1.0％。
6.一种含氧化石墨烯的核酸提取试剂的使用方法包括以下步骤：细胞裂解、核酸吸附、样品洗涤、核酸洗脱。
7. 如权利要求6 所述的细胞裂解步骤为：核酸提取试剂与全血、血清、血浆、唾液、尿液、脑脊液、细胞和组织培养液等生物样品等体积均匀混合，室温放置10min ；泌尿生殖道或口腔拭子样品需先用生理盐水振荡清洗，然后吸取漂洗液加入核酸提取试剂提取核酸。
8. 如权利要求6 所述的核酸吸附步骤为：将离子柱或磁珠等磁性材料，放入裂解液中振荡10min。
9. 如权利要求6 所述的样品洗涤步骤为：分别采用洗涤液1和洗涤液2洗涤固相材料各一次。
10.如权利要求6 所述的核酸洗脱步骤为：在离子柱上或磁珠等磁性颗粒中加入50-100μl TE(pH8.0)，振荡洗脱10min，获得提取纯化后的核酸。
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