CN109750030A - 一种基于磁珠法的快速、不加热的核酸提取试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于磁珠法的快速、不加热的核酸提取试剂盒，含有磁珠的溶液，蛋白酶K；polyA溶液；去蛋白液；洗涤液液；洗脱液；裂解液。本发明还提供了采用上述的试剂盒对核酸进行提取的方法，先加入裂解液和磁珠到样品中，充分震荡混匀，在裂解细胞释放核酸的同时用磁珠捕获核酸，然后分别采用特有的去蛋白液和漂洗液洗涤去除磁珠表面的蛋白质和盐离子等杂质，最后用特有的洗脱液在室温快速洗脱核酸。与常规的磁珠法核酸提取试剂盒相比，本发明的试剂盒步骤简便、快速，整个流程下来仅需要15min左右，而且不需要加热，降低了可能因为气溶胶造成样品间污染的概率；无氯仿苯酚等有毒试剂，安全无污染。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种试剂盒，具体来说是一种基于磁珠法的快速、不加热的核酸提取试剂盒。
背景技术
随着分子生物学的发展，对疾病相关病毒进行检测和分型是分子检测的一个重要应用领域，而从生物材料中高效、简便的提取纯化目的核酸是分子检测的关键技术。目前病毒核酸纯化主要分为三种，分别为煮沸法、醇类沉淀法、柱膜法和磁珠法。
煮沸法是在样品中加入裂解液，通过加热的方法裂解细胞释放核酸，该方法操作简便但是提取的核酸纯度低，通量低，不利于后续的检测，也容易造成污染。醇类沉淀法主要是利用变性剂和表面活性剂进行裂解，释放出核酸后用苯酚、氯仿进行抽提去除蛋白等杂质，然后用乙醇或异丙醇进行沉淀，去除上清后获得核酸沉淀，然后用TB或TE缓冲液进行溶解。该方法步骤繁琐，重复性差，耗时较长，约2h左右，并且使用了有剂试剂，不利于实验操作。柱膜法是用硅胶膜对核酸进行吸附和纯化，主要是用变性剂和表面活性剂裂解细胞，释放核酸分子，在低pH值、高盐以及醇的条件下结合核酸分子，然后用含有胍盐的乙醇溶液洗涤去除蛋白等杂质，用70％或80％的乙醇溶液去除盐离子，干燥去除残留乙醇后在高pH值、低盐的情况下洗脱核酸，该方法操作相对简便，耗时较短，约1h左右，提取的核酸纯度高，但是不利于自动化操作。近年，磁珠法病毒核酸提取广泛的应用，
磁珠法病毒核酸提取和柱膜法类似，主要是用磁性微球替代柱膜吸附核酸，该方法的优点是能够在仪器上进行操作，进行自动化操作，但是由于磁珠吸附核酸的同时也会吸附蛋白等杂质，所以对结合以及洗涤条件要求比较高，获得高纯度的核酸比较困难，这个实验流程耗时约1h。
病毒核酸的提取过程中，在裂解和洗脱的过程中加热利于核酸的释放和洗脱，提高提取的效率，但是加热容易造成基因的污染，在临床检验中容易造成假阳性的检测结果，同时对提取仪器的要求较高。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种基于磁珠法的快速、不加热的核酸提取试剂盒，所述的这种基于磁珠法的快速、不加热的核酸提取试剂盒要解决现有技术中提取核酸的方法过程复杂，实验要求高，而且容易造成假阳性的技术问题。
本发明提供了一种基于磁珠法的快速、不加热的核酸提取试剂盒，包括如下试剂：
含有磁珠的溶液，所述的磁珠为硅基或硅羟基磁珠，所述的磁珠溶液的浓度为50-100mg/mL；
蛋白酶K，所述的蛋白酶K的浓度为50-100mg/mL；
polyA溶液，所述的polyA的浓度为10-50mM；
去蛋白液，所述的去蛋白液中含有终浓度为1-3M的盐酸胍，终浓度为10-20mM的Tris-HCl，Tris-HCl的pH7.0-8.0，质量百分比浓度为20-40％的无水乙醇；
洗涤液，所述的盐离子溶液中含有终浓度为10-50mM的Tris-HCl，Tris-HCl的pH8.0-9.0，质量百分比浓度为5-10％的PEG6000，200-500mM的Nacl溶液；
洗脱液，所述的洗脱液中含有5-20mM的Tris-HCl，Tris-HCl的pH8.0-9.0，质量百分比浓度为0.1-0.5％的Tween-20；
裂解液，所述的缓冲液中含有25-75mM的Tris-HCL，Tris-HCL的pH 8.0，3-5M的GTC(异硫氰酸胍)，质量百分比浓度为5-15％的聚多卡醇，质量百分比浓度为0.5-1％的NP-40(乙基苯基聚乙二醇)，质量百分比浓度为15-25％的异丙醇。
本发明还提供了采用上述的试剂盒提取核酸的方法，包括如下步骤：
1)一个对细胞进行裂解和吸附核酸的步骤：在2mL离心管中加入300-500μL的样本，
加入500-1000μL裂解液、10-30μL含有磁珠的溶液，20-50μL蛋白酶K、5-10μLpolyA溶液，涡旋振荡1min至样本充分混匀，然后颠倒混匀3-5min；
2)一个去除杂蛋白的步骤：将步骤1)的离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，吸去液体，将离心管从磁力架上取下，加入500μL去蛋白液，振荡混匀1min，将离心管放置于磁力架上静置30秒，磁珠完全吸附后，吸去液体；
3)一个对盐离子进行洗涤的步骤：将步骤2)的离心管从磁力架上取下，加入700μL洗涤液，振荡混匀1min。将离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，吸去液体；
4)一个对DNA进行洗脱的步骤：将步骤3)的离心管从磁力架上取下，加入50-100μL洗脱液，振荡混匀，室温孵育3-5min，期间颠倒混匀1-2次，将离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，将核酸溶液转移至一个新离心管中，完成核酸的提取。
本发明的试剂盒采用细胞裂解、磁珠吸附核酸、蛋白质和盐离子去除和核酸洗脱步骤。先加入裂解液到样品中，边震荡边裂解细胞释放核酸，充分裂解后，加入磁珠，用磁珠吸附核酸，然后分别采用特有的去蛋白液和洗涤液洗涤去除磁珠表面的蛋白质和盐离子等杂质，最后用特有的洗脱液在室温快速洗脱核酸。与常规的磁珠法核酸提取试剂盒相比，该试剂盒步骤简便、快速，整个流程下来仅需要15min左右，而且不需要加热，降低了样品之间的污染；安全无污染，无氯仿苯酚等有毒试剂，既可以手工操作也可以用于自动化平台，利用本发明的试剂盒可以快速高效的获得高质量的病毒核酸。适合于工业客户快速、有效、经济的提取核酸，也可以实现DNA和RNA共提。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明的整个实验流程不需要加热，优化出独特的裂解液在常温快速裂解细胞，释放核酸的同时用磁珠捕获核酸，在常温快速的洗脱核酸，洗脱效率较高；与目前国内外的磁珠法病毒核酸提取试剂盒相比，本发明操作简便，时间短，整个流程约15min；将磁珠和裂解液混合后加入样本中，边裂解边结合，缓冲液F中不需要加入乙醇，洗涤后无需晾干，直接加入洗脱液进行洗脱，操作简便快捷。
附图说明
图1显示了采用本发明的试剂盒提取核酸后，对核酸进行PCR后，血浆中HBV基因扩增曲线图。
图2显示了采用本发明的试剂盒提取核酸后，对核酸进行PCR后，血浆中HCV基因扩增曲线图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1
血浆中HBV病毒的检测(与国内某厂家磁珠法试剂盒进行比较研究)
(1)病毒核酸的提取
1.在2ml离心管中加入血浆300ul(阴性血浆中加入终浓度为10IU的WHO HBV标准品)，加入600μL裂解液、15μL磁珠溶液、20μL蛋白酶K溶液和5μL polyA溶液，涡旋震荡1min至样本充分混匀，然震荡混匀3-5min。
2.瞬时离心后，将离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，吸去液体。
3.加入500μL缓冲液去蛋白溶液混匀，涡旋震荡1min。
4.瞬时离心后，将离心管放置于磁力架上静置1-2min，磁珠完全吸附后，吸去液体。
5.加入700μL洗涤液，振荡混匀1min。
6.瞬时离心后，将离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，吸弃液体。
7.瞬时离心后，将离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，吸弃残留液体。
8.将离心管从磁力架上取下，加入70μL洗脱液洗脱液，振荡混匀，室温孵育3-5min，期间颠倒混匀1-2次。
9.将离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，小心将核酸溶液转移至一个新离心管中，并于适当条件保存。取30μL做模板进行Q-PCR检测(如图1)。
(2)病毒基因的检测
PCR体系：
反应程序为：
HBV引物和探针：
hbvfp：5'-agg aac ctc tat gtt tcc ctc ct-3'
hbvrp：5'-cct aaa gcc caa gat gat ggg a-3'
hbv-p：5'-cy5-cca aac cct cgg acg gaa act gca c-bhq3-3'
表1：血浆中HBV检测的平均Ct；
| 检测基因 | 本发明 | 对照试剂盒 |
| HBV | 31.14 | 32.56 |
结论：与对照试剂盒相比，本发明针对血浆中HBV病毒的提取效率更高。
实施例2：血浆中HCV病毒的检测(与国内某厂家磁珠法试剂盒进行比较研究)
(1)病毒核酸的提取
1.在2ml离心管中加入血浆300μL(阴性血浆中加入终浓度为20IU的WHO HCV标准品)，加入600μL裂解液、15μL磁珠溶液、20μL蛋白酶K溶液和5μL polyA溶液，涡旋震荡1min至样本充分混匀，然震荡混匀3-5min。
2.瞬时离心后，将离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，吸去液体。
3.加入500μL缓冲液去蛋白溶液混匀，涡旋震荡1min。
4.瞬时离心后，将离心管放置于磁力架上静置1-2min，磁珠完全吸附后，吸去液体。
5.加入700μL洗涤液，振荡混匀1min。
6.瞬时离心后，将离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，吸弃液体。
7.瞬时离心后，将离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，吸弃残留液体。
8.将离心管从磁力架上取下，加入70μL洗脱液洗脱液，振荡混匀，室温孵育3-5min，期间颠倒混匀1-2次。
9.将离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，小心将核酸溶液转移至一个新离心管中，并于适当条件保存。取30μL做模板进行Q-PCR检测(如Fig2)。
(2)病毒基因的检测
PCR体系：
反应程序为：
HCV引物和探针：
hcvfp：5'-gaaccggtgagtacaccggaa-3'
hcvrp：5'-ggcagtaccacaaggccttt-3'
hcv-p：5'-fam-atttgggcgtgcccccgcragactg-bhq1-3'
表1：血浆中HCV检测的平均Ct；
| 检测基因 | 本发明 | 对照试剂盒 |
| HCV | 31.89 | 33.67 |
结论：与对照试剂盒相比，本发明针对血浆中HCV病毒的提取效率更高。
Claims (2)
1.一种基于磁珠法的快速、不加热的核酸提取试剂盒，其特征在于包括如下试剂：
含有磁珠的溶液，所述的磁珠为硅基或硅羟基磁珠，所述的磁珠溶液的浓度为50-100mg/mL；
蛋白酶K，所述的蛋白酶K的浓度为50-100 mg/mL；
polyA溶液，所述的polyA的浓度为10-50 mM；
去蛋白液，所述的去蛋白液中含有终浓度为1-3M的盐酸胍，终浓度为10-20 mM 的Tris-HCl，Tris-HCl的pH7.0-8.0，质量百分比浓度为20-40%的无水乙醇；
洗涤液，所述的盐离子溶液中含有终浓度为10-50 mM的 Tris-HCl，Tris-HCl的pH8.0-9.0，质量百分比浓度为5-10%的 PEG6000，200-500mM的 Nacl溶液；
洗脱液，所述的洗脱液中含有5-20 mM的 Tris-HCl，Tris-HCl的pH8.0-9.0，质量百分比浓度为0.1-0.5% 的Tween-20；
裂解液，所述的缓冲液中含有25-75 mM的 Tris-HCL，Tris-HCL的pH 8.0，3-5 M 的异硫氰酸胍，质量百分比浓度为5-15%的聚多卡醇，质量百分比浓度为0.5-1%的乙基苯基聚乙二醇，质量百分比浓度为15-25%的异丙醇。
2.采用上述的试剂盒提取核酸的方法，其特征在于包括如下步骤：
一个对细胞进行裂解和吸附核酸的步骤： 在2 mL离心管中加入300-500µL的样本，加入500-1000 µL裂解液、10-30 µL含有磁珠的溶液，20-50µL蛋白酶K、5-10µL polyA溶液，涡旋振荡1 min至样本充分混匀，然后颠倒混匀3-5min；
一个去除杂蛋白的步骤：将步骤1）的离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，吸去液体，将离心管从磁力架上取下，加入500 μL去蛋白液，振荡混匀1 min，将离心管放置于磁力架上静置30 秒，磁珠完全吸附后，吸去液体；
一个对盐离子进行洗涤的步骤：将步骤2）的离心管从磁力架上取下，加入700 μl洗涤液，振荡混匀1 min；
将离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，吸去液体；
一个对DNA进行洗脱的步骤：将步骤3）的离心管从磁力架上取下，加入50-100 μL洗脱液，振荡混匀，室温孵育3-5 min，期间颠倒混匀1-2次，将离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，将核酸溶液转移至一个新离心管中，完成核酸的提取。
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