CN114196669A

CN114196669A - 一种用于核酸提取的漂洗液

Info

Publication number: CN114196669A
Application number: CN202111596568.0A
Authority: CN
Inventors: 瞿志鹏; 曹林; 聂俊伟; 关锡梅
Original assignee: Nanjing Novozan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Nanjing Nuoweizan Animal Health Co ltd
Priority date: 2021-12-24
Filing date: 2021-12-24
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2041-12-24
Also published as: CN114196669B

Abstract

本发明提供一种用于核酸提取的漂洗液，属于生物技术领域。本发明提供的漂洗液用于核酸提取可以增强磁珠与样本中不溶性杂质结合能力，减少复杂环境样本泥沙核酸提取产物的浑浊现象，提高产物的纯度。

Description

一种用于核酸提取的漂洗液

技术领域

本发明涉及核酸提取领域，具体涉及一种用于核酸提取的漂洗液，其可用于复杂环境样本的核酸提取。

背景技术

核酸是由许多核苷酸聚合而成的生物大分子化合物，具体可分为两类：脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的作用。随着分子生物学技术的快速发展，核酸的研究和分析在临床诊断、环境检测、食品安全检测等领域不断地推广和应用，并发挥极大作用。在相关检测工作中，高质量的核酸样品是获得良好结果的前提。目前已经有很多种核酸提取与纯化的方法，主要包括有机溶剂萃取法、离心柱法和磁珠纯化法；其中磁珠法适用于所有类型的核酸，并且快速、低成本且可适配自动化。

磁珠法是通过裂解液裂解细胞组织样本，从样本中游离出来的核酸分子被特异地吸附到磁性颗粒表面，蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中，然后利用磁棒吸附携带核酸的磁珠移动至不同的试剂槽内，通过反复快速搅拌、混匀液体，经过细胞裂解、核酸吸附、洗涤与洗脱等步骤，最终得到纯净核酸的方法。磁珠表面可以进行不同修饰，从而产生不同的应用功能，增强磁珠与核酸分子的结合能力。磁珠法中用到的磁性复合微球是指将无机超顺磁性颗粒(通常是铁和铁的氧化物，主要是四氧化三铁)与有机高分子、生物大分子以及无机物等非磁性材料，以一定的结构相复合，并且通过表面化学修饰手段赋予非磁性基体表面与生物分子连接的功能基团，从而形成的具有磁响应性等多重特性的复合微球。用于核酸提取的磁性复合微球以氧化硅磁性微球为主，在高盐环境下，核酸可吸附到氧化硅表面并与硅羟基相互作用形成复合物，经漂洗，去除蛋白和盐离子后，在低盐环境下洗脱下来。

去污剂是两性分子，其亲脂性羟基(尾部)末端连有极性或带电荷的亲水基团，能够降低水的表面张力，因此也被称为表面活性剂。去污剂被广泛用于生物化学、细胞生物学和分子生物学研究，包括细胞裂解、膜蛋白和脂质的溶解、蛋白质结晶以及减少印迹实验的背景染色等。去污剂主要分为离子型去污剂、非离子型去污剂以及两性离子去污剂。其中非离子型去污剂含有不带电的亲水头部基团，其由聚氧乙烯或糖苷基团组成。由于非离子型去污剂会破坏脂质-脂质和脂质-蛋白质相互作用，但不会破坏蛋白质-蛋白质相互作用，所以又称非变性去污剂。特别的一点，盐对非离子型去污剂的胶束尺寸影响很小。

环境样本一般指在当时生态环境状态下，有典型代表的样品，例如动植物，土壤，河水及沉积物等。环境样本的及时测定可以提供环境污染的当前状态，便于对污染物源头进行迅速地追踪和治理，从而防止污染源的进一步扩大。其中，常见的复杂环境样本，即含有许多可溶性和不可溶性物质的土壤样本，携带丰富的环境特征信息，检测其污染水平对相关检测工作有重要的指导意义。然而，在现有技术条件下，对此类样本进行磁珠法核酸提取，其产物出现明显浑浊现象，且影响下游的检测工作，因此急需一种技术可以彻底去除泥沙样本中的各种干扰物质，从而获得高纯度的核酸样本，为下一步实验相关操作奠定基础。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于核酸提取的漂洗液，在进行复杂环境样本的提取过程中，其能够增强磁珠与样本中不溶性杂质结合能力，改善复杂环境泥沙样本核酸提取产物的浑浊现象，提高产物的纯度。

本发明提供以下技术方案：

本发明的第一方面提供一种用于核酸提取的除盐漂洗液，所述漂洗液包含乙醇和非离子型表面活性剂。

在一些实施方案中，所述漂洗液包含体积分数为50-80％乙醇，优选地，乙醇的体积分数为75％。

在一些实施方案中，所述非离子型表面活性剂在漂洗液中的体积分数为0.1-50％，优选地，0.5-50％，更优选地，0.1-10％。

在一些实施方案中，所述非离子型表面活性剂为烷基酚聚氧乙烯醚型，优选地，烷基酚聚氧乙烯醚型活性剂为OP-10，更优选地，OP-10在漂洗液中的体积分数为0.5-50％，最优选地，OP-10在漂洗液中的体积分数为0.5％。

在一些实施方案中，所述非离子型表面活性剂为脂肪醇聚氧乙烯醚型，分子式为RO(CH₂CH₂O)_nH，其中R＝C₁₂-C₁₈，n＝3-20，优选地，脂肪醇聚氧乙烯醚型活性剂在漂洗液中的体积分数为1-50％，更优选地，脂肪醇聚氧乙烯醚型活性剂为AEO-3或AEO-9中的一种或多种，最优选地，AEO-3或AEO-9在漂洗液中的体积分数为1％。

在一些实施方案中，所述非离子型表面活性剂为脂肪醇聚氧乙烯酯型，优选地，脂肪醇聚氧乙烯酯型活性剂为Tween-20、Tween-21、Tween-40、Tween-60、Tween-61、Tween-65、Tween-80、Tween-81或Tween-85中的一种或多种，更优选地，Tween-20在漂洗液中的体积分数为0.5-50％，最优选地，Tween-20在漂洗液中的体积分数为0.5％。

在一些实施方案中，所述非离子型表面活性剂为聚氧乙烯辛烷基苯酚醚，优选地，聚氧乙烯辛烷基苯酚醚在漂洗液中的含量为于0.5-50％。

在一些实施方案中，所述非离子型表面活性剂为特殊类型非离子表面活性剂，优选地，特殊类型非离子表面活性剂为PEG200、PEG400或PEG600中的一种或多种，更优选地，所述特殊类型非离子表面活性剂在所述漂洗液中的体积分数为0.5-50％，最优选地，PEG200在所述漂洗液中的体积分数为0.5％。

在一些实施方案中，所述漂洗液还包含缓冲成分和盐，优选地，缓冲成分为Tris，盐为NaCl。

本发明的第二方面提供一种核酸提取方法，所述方法包含：

1)对待测样本进行裂解；

2)磁珠吸附裂解样本；

3)用第一漂洗液漂洗已吸附样本的磁珠；

4)用本发明第一方面所述的漂洗液作为第二漂洗液再次漂洗；

5)用洗脱液进行洗脱，获得提取后的核酸产物。

在一些实施方案中，所述第一漂洗液包含有Tris、EDTA、NaCl和乙醇，优选地，所述Tris浓度为30mM，EDTA浓度为20mM，NaCl浓度为200mM，乙醇的体积分数为65％。

在一些实施方案中，所述样本为环境样本，优选地，所述环境样本为泥沙土壤样本。

在一些实施方案中，使用裂解液对样本进行裂解，所述裂解液包含胍盐、金属离子络合物、醇类物质和非离子型表面活性剂，优选地，所述胍盐为异硫氰酸胍、盐酸胍中的一种或多种，优选地，所述金属离子络合物为柠檬酸钠、EDTA-2Na中的一种或多种，优选地，所述醇类物质为异丙醇，优选地，所述非离子型表面活性剂为吐温或Triton X-100中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述洗脱液为TE缓冲液，优选地，TE缓冲液的pH为8.0。

本发明的第三方面提供一种核酸提取试剂盒，所述核酸提取试剂盒包含有本发明第一方面所述的漂洗液。

在一些实施方案中，核酸提取试剂盒还包含样本裂解液，所述裂解液包含胍盐、金属离子络合物、醇类物质和非离子型表面活性剂，优选地，所述胍盐为异硫氰酸胍、盐酸胍中的一种或多种，优选地，所述金属离子络合物为柠檬酸钠、EDTA-2Na中的一种或多种，优选地，所述醇类物质为异丙醇，优选地，所述非离子型表面活性剂为吐温或Triton X-100中的一种或多种。

在一些实施方案中，核酸提取试剂盒还包含洗脱液，优选地，洗脱液为TE缓冲液，更优选地，TE缓冲液的pH为8.0。

在一些实施方案中，核酸提取试剂盒还包含可吸附核酸的磁性介质，优选地，所述磁性介质为磁珠。

术语：

特殊类型非离子表面活性剂指聚乙二醇类表面活性剂。

附图说明

图1是实施例1中21种第二漂洗液和对照组核酸提取产物对比图；

图2是实施例1核酸提取产物检测DNA病毒的QPCR扩增曲线图；

图3是实施例1核酸提取产物检测RNA病毒的QPCR扩增曲线图。

具体实施方式

核酸提取的步骤主要分为样本裂解、核酸分子与磁珠或者硅胶柱结合、漂洗、洗脱四个环节，漂洗步骤作为核酸纯化过程中非常重要的环节，漂洗的效果会直接影响提取的效率与纯度。

在磁珠法提取核酸的反应体系中，磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠。这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应，在磁珠最外层负电基团的作用下，形成“阴离子-阳离子-阴离子”的盐桥结构，使核酸分子被特异性地吸附到磁珠表面。而当反应缓冲液被弃除后，加入水性分子，会快速充分水化核酸分子，解除三者之间的离子相互作用，使吸附到磁珠上的核酸分子被纯化出来。结合后在磁力作用下，将吸附有核酸分子的磁珠转移至不同的漂洗液中漂洗。本发明中的除盐漂洗液中含有非离子型表面活性剂，吸附有核酸分子的磁珠转移至含非离子型表面活性剂中进行漂洗，除去蛋白、盐类及其他小分子化合物。经漂洗完成后，将吸附有核酸分子的磁珠转移至水或者TE缓冲液中洗脱。漂洗液中非离子型活性剂的添加会使得磁珠与复杂样本中的杂质紧密结合，使得洗脱孔位杂质不易掉落，而核酸分子被洗脱下来，溶解在洗脱液中，其他杂质随磁珠回到磁珠孔位，从而降低复杂环境样本提取产物的浑浊度。

以泥沙样本为例，结合本发明的技术方案详细说明本发明的具体实施方式。

下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。但是，下述实施例仅仅是本发明的示例，并不代表或限制本发明的保护范围。本发明的保护范围以权利要求书为准。在以下实施例中，若无特别说明，所用试剂和耗材均购自本领域普通供应商，所用实验方法和技术手段均为本领域常规方法和手段。

实验材料

1、PRV疫苗(DNA病毒)为武汉科前生物科技股份有限公司伪狂犬病活疫苗，兽药生字170047018；

2、PRRSV(RNA病毒)为武汉科前生物科技股份有限公司高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗，兽药生字170041064；

3、Q-PCR试剂盒为南京诺唯赞生物科技股份有限公司

II U⁺One StepqRT-PCRProbe Kit试剂盒(货号Q222-CN)；

4、裂解液为2.5M异硫氰酸胍，20mM EDTA-2Na，60％异丙醇，2％Triton X-100，0.1％Tween-20；

5、磁珠为南京诺唯赞生物科技股份有限公司DNA/RNA Extraction Kit(Prepackaged)试剂盒(货号RM201)中的DNA/RNAReagents；

6、第一漂洗液为30mM Tris，20mM EDTA，200mM NaCl，65％乙醇；

7、洗脱液为1×TE缓冲液(pH＝8.0)。

表1实施例中涉及的序列

实施例1：生物样本的核酸提取

1、样本制备

疫苗母液的制备：加入10mL PBS至单瓶(10头份/瓶)PRV(DNA病毒)疫苗粉剂中，获得PRV疫苗原液，取1mL PRV疫苗原液用PBS稀释到10mL，将稀释后的10mL PRV疫苗溶液加入至单瓶(10头份/瓶)PRRSV(RNA病毒)疫苗粉剂中，获得PRV/PRRSV疫苗混合原液，使用PBS将疫苗混合原液稀释100倍，获得疫苗母液。

环境土壤泥浆制备：将环境土壤泥沙溶解在纯水中，沉淀过夜，取最上层溶液与中层泥浆混合，获得环境土壤泥浆。

模拟生物样本制备：取1mL疫苗母液加入9mL环境土壤泥浆，制得模拟生物样本。

2、制备第二漂洗液

第二漂洗液：75％乙醇，21种添加剂，每种方案中的添加剂种类及含量见表2，以无添加剂的漂洗液为对照。

表2第二漂洗液中21种添加剂种类及含量

3、核酸提取及验证

使用南京诺唯赞VNP-32P全自动核酸提取仪器，对制备的模拟生物样本进行核酸提取。

按照200μL/孔加入模拟生物样本至96孔板中，随后将96孔板放入全自动核酸提取仪中，装上磁棒套护套，运行提取程序，具体程序如下表3所示：

表3全自动核酸提取程序

其中，使用1-21种方案的第二漂洗液及对照漂洗液进行核酸提取，共获得22份核酸提取产物，如图1所示，其中方案1、7、8、15、17的产物是澄清的，其余方案产物浑浊。使用Q-PCR试剂盒对22份核酸提取产物进行Q-PCR核酸检测，验证提取核酸产物质量，按照表4和表5配制反应体系，进行Q-PCR反应。

表4单个DNA病毒Q-PCR反应体系

试剂组分	体积
		2×One Step U<sup>+</sup>Mix	12.5μl
One Step U<sup>+</sup>Enzyme Mix	1.25μl
		50×Rox Dye Reference2	0.5μl
ddH<sub>2</sub>O	4.25μl
		PRV-正向引物(10μM)	0.5μl
PRV-反向引物(10μM)	0.5μl
		PRV-探针(10μM)	0.5μl
核酸提取产物	5μl
		总体积	25μl

表5单个RNA病毒Q-PCR反应体系

22种核酸提取产物Q-PCR检测结果CT值见表6，其中仅方案1、方案7、方案8、方案15、方案17的第二漂洗液提取的产物能够进行Q-PCR扩增，其他方案漂洗液和对照漂洗液均未有扩增，扩增曲线见附图2和附图3。

表6 Q-PCR检测结果

序列表

<110> 南京诺唯赞生物科技股份有限公司

<120> 一种用于核酸提取的漂洗液

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acaagttcaa ggcccacatc tac 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtcygtgaag cggttcgtga t 21

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgtcatcgt cacgacc 17

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggggaatggc cagycagtca a 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gccagrggaa aatgkggctt ctc 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctgggyarga tyatcgccca gca 23

Claims

1.一种用于核酸提取的漂洗液，所述漂洗液包含乙醇和非离子型表面活性剂；其中，所述非离子表面活性剂选自吐温、AEO-3、OP-10、AEO-9和PEG200中的一种或多种。

2.如权利要求1所述的漂洗液，所述乙醇的体积分数为50-80％，优选地，乙醇的体积分数为75％。

3.如权利要求1所述的漂洗液，所述非离子表面活性剂在所述漂洗液中的体积分数为0.1-50％，优选地，0.5-50％。

4.如权利要求1所述的漂洗液，所述非离子表面活性剂为吐温20、OP-10和/或PEG200；优选地，所述非离子表面活性剂在所述漂洗液中的体积分数为0.5-50％。

5.如权利要求1所述的漂洗液，所述非离子表面活性剂为AEO-3和/或AEO-9；优选地，所述非离子表面活性剂在所述漂洗液中的体积分数为1-50％。

6.如权利要求1所述的漂洗液，所述漂洗液还包含缓冲成分和盐；优选地，缓冲成分为Tris，盐为NaCl。

7.一种核酸提取方法，所述方法包含：

1)对待测样本进行裂解；

2)磁珠吸附裂解样本；

3)用第一漂洗液漂洗已吸附样本的磁珠；

4)用权利要求1-6任一项所述的漂洗液作为第二漂洗液再次漂洗；

5)用洗脱液进行洗脱，获得提取后的核酸产物。

8.如权利要求7所述的方法，所述第一漂洗液含有Tris、EDTA、NaCl和乙醇；优选地，所述Tris浓度为30mM，EDTA浓度为20mM，NaCl浓度为200mM，乙醇的体积分数为65％。

9.如权利要求7-8任一项所述的方法，所述样本为环境样本；优选地，所述环境样本为泥沙土壤样本。

10.如权利要求7-9任一项所述的方法，使用裂解液对样本进行裂解，所述裂解液包含胍盐、金属离子络合物、醇类物质和非离子型表面活性剂；优选地，所述胍盐为异硫氰酸胍、盐酸胍中的一种或多种；优选地，所述金属离子络合物为柠檬酸钠、EDTA-2Na中的一种或多种；优选地，所述醇类物质为异丙醇；优选地，所述非离子型表面活性剂为吐温或Triton X-100中的一种或多种。

11.如权利要求7-10任一项所述的方法，所述洗脱液为TE缓冲液；优选地，TE缓冲液pH为8.0。

12.一种核酸提取试剂盒，所述试剂盒包含有权利要求1-6任一项所述的漂洗液。

13.如权利要求12所述的核酸提取试剂盒，还包含有样本裂解液，所述裂解液包含胍盐、金属离子络合物、醇类物质和非离子型表面活性剂；优选地，所述胍盐为异硫氰酸胍、盐酸胍中的一种或多种；优选地，所述金属离子络合物为柠檬酸钠、EDTA-2Na中的一种或多种；优选地，所述醇类物质为异丙醇；优选地，所述非离子型表面活性剂为吐温或TritonX-100中的一种或多种。

14.如权利要求12所述的核酸提取试剂盒，还包含有洗脱液；优选地，洗脱液为TE缓冲液。

15.如权利要求12所述的核酸提取试剂盒，还包含可吸附核酸的磁性介质，优选磁珠。