CN102358899B

CN102358899B - 硅质膜离心吸附柱再生液

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Publication number: CN102358899B
Application number: CN 201110294478
Authority: CN
Inventors: 孙燕; 李治; 文娣娣
Original assignee: Shaanxi Normal University
Current assignee: Shaanxi Normal University
Priority date: 2011-09-30
Filing date: 2011-09-30
Publication date: 2013-03-20
Anticipated expiration: 2031-09-30
Also published as: CN102358899A

Abstract

一种硅质膜离心吸附柱再生液，由溶液A和溶液B按体积比为1∶1混合而成，所述的溶液A为抗坏血酸水溶液，所述的溶液B由硫酸铜或氯化铜、硫酸亚铁或氯化亚铁、乙二胺四乙酸、非离子型表面活性剂、去离子水组成，所述的非离子型表面活性剂为聚乙二醇辛基苯基醚、吐温-20、吐温-40、吐温-60中的任意一种。本发明的再生液可以消除使用过的硅质膜离心吸附柱上残留的核酸样品，有效恢复其核酸结合能力，使其可以再次应用于其他核酸样品的纯化。另外，本发明的再生液还可以有效提高放置时间过长的新的硅质膜离心吸附柱的核酸结合能力，提高核酸纯化效率。本发明成本低、环境污染小，可以使硅质膜离心吸附柱重复使用。

Description

硅质膜离心吸附柱再生液

技术领域

本发明属于核酸纯化技术领域，具体涉及一种硅质膜离心吸附柱的再生液配制及使用方法。

背景技术

核酸提取已经成为分子生物学实验中一项很基本的技术，各种不同的提取技术总体上可以分为以下三种：

(1)碱裂解法：由于经典的碱裂解法和酚氯仿抽提法实验成本低、不需要一些尖端的的实验设备，因而早期被广泛应用，但是这种方法同时也受到了一些实际操作的限制，譬如不能有效地保证所提取的DNA的质量、实验耗时长等。

(2)依赖于未修饰的硅质树脂法：用这种方法提取的DNA产物不论是从质量还是数量上都优于经典的碱裂解法，但其产物应用范围比较局限，诸如不能应用于体外转录/翻译、显微注射、免疫应用等方面，从而限制了它的发展。

(3)依赖于硅质膜离心吸附柱法：与依赖于未修饰的硅质树脂法相比，硅质膜离心吸附柱的硅质膜是经过化学修饰的，其表面带有大量阴离子基团，从而使得硅质膜可以在高盐低pH的情况下高效的吸附核酸。

在过去的二十几年时间内依赖于硅质膜离心吸附柱提取核酸的技术已经较为完善，其可以大幅度的提高核酸提取的质量和数量，而且不需要一些复杂仪器的辅助。虽然硅质膜离心吸附柱具有操作方便、实验耗时短等优点，但是硅质膜离心吸附柱不能重复使用。对于使用过的吸附柱而言，在核酸洗脱时会有5％～10％的核酸残留在硅质膜上，这些核酸既有自由形态的也有与蛋白质结合形态的，如果重复使用，会造成对第二次纯化的核酸样品的污染；即使提取同一样品，也会使核酸的提取效率大大降低，因此一般商品化的硅质膜离心吸附柱均不建议重复使用。如果实验室大量使用一次性的吸附柱，无疑大大增加了实验成本。除此之外，使用过的吸附柱残留有重组DNA等物质，在使用后必须经处理再丢弃，否则可能造成对环境的损害。如果希望重复使用，早期多采用无菌水或TE缓冲液反复浸泡洗涤，以达到去除硅质膜上残留核酸的目的；但是这样的处理很难完全清除硅质膜离心吸附柱上残留的核酸、蛋白等生物分子，导致硅质膜离心吸附柱在重复使用过程中吸附能力下降，更为严重的是会造成样品间的交叉污染。

近年来，Siddappa N.B.等(Biotechniques，42，186-192(2007))提出将使用过的硅质膜离心吸附柱浸泡在1mol/L的盐酸水溶液中一段时间，再次使用前用大量无菌水清洗；NicoSia A.等(Analytical Biochemistry，385，182-183(2009)和Biomedical chromatography，24，1263-1264(2010))提出分别用(1)0.2或1mol/L的NaOH水溶液、0.1％或0.15％的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)水溶液和(2)1.5mol/L的HCl水溶液、0.15％的TritonX-100水溶液处理使用过的硅质膜离心吸附柱。这些方法都能达到去除硅质膜上残留核酸的目的，但是这些溶液中使用了较高浓度的有腐蚀性的强酸强碱，存在安全隐患，此外，这些方法处理完硅质膜离心吸附柱后还需要用大量的无菌水清洗，操作步骤多，费时。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述硅质膜离心吸附柱在再生过程中不能完全去除硅质膜上残留核酸和使用腐蚀性酸碱的缺点，提供一种无酸碱腐蚀性、环境污染小的硅质膜离心吸附柱的再生液。

解决上述技术问题所采用的技术方案是：本发明的硅质膜离心吸附柱的再生液由溶液A与溶液B按体积比为1∶1混合而成，所述的溶液A为4～10mmol/L的抗坏血酸水溶液，所述的溶液B由硫酸铜或氯化铜、硫酸亚铁或氯化亚铁、乙二胺四乙酸、非离子型表面活性剂、去离子水组成，溶液B中Cu²⁺浓度为0.2～1mmol/L、Fe²⁺浓度为0.2～1mmol/L、乙二胺四乙酸浓度为0.15～1mmol/L、非离子型表面活性剂的体积分数为0.1％～0.4％。

上述的非离子型表面活性剂为聚乙二醇辛基苯基醚、吐温-20、吐温-40、吐温-60中的任意一种。

本发明硅质膜离心吸附柱的再生液中，所述的溶液A优选10mmol/L的抗坏血酸水溶液，所述的溶液B中优选Cu²⁺浓度为0.2mmol/L、Fe²⁺浓度为0.2mmol/L、乙二胺四乙酸浓度为0.3mmol/L、非离子型表面活性剂的体积分数为0.3％。

本发明的的非离子型表面活性剂优选聚乙二醇辛基苯基醚。

本发明的硅质膜离心吸附柱的再生液可用于再生使用过的用于质粒提取、琼脂糖凝胶回收或聚合酶链式反应产物回收的硅质膜离心吸附柱，还可用于再生未使用的用于质粒提取、琼脂糖凝胶回收或聚合酶链式反应产物回收的硅质膜离心吸附柱。

本发明硅质膜离心吸附柱再生液的使用方法如下：

向硅质膜离心吸附柱中加入500μL硅质膜离心吸附柱再生液，室温静置5～30分钟，室温10000转/分钟离心1分钟，弃去接液管内液体，再向硅质膜离心吸附柱中加入750μL灭菌水，室温静置2分钟，室温10000转/分钟离心1分钟，弃去接液管内液体，完成硅质膜离心吸附柱的再生处理。

本发明不仅可以去除已经使用过的硅质膜离心吸附柱上残留的核酸样品，而且能够有效恢复已经使用过的硅质膜离心吸附柱的核酸结合能力，使其可以再次应用于其他核酸样品的纯化。另外，本发明的再生液还可以有效提高放置时间过长的新的硅质膜离心吸附柱的核酸结合能力，提高核酸纯化效率。本发明成本低、环境污染小，可以使硅质膜离心吸附柱重复使用。

附图说明

图1是再生和未再生的不同用途的硅质膜离心吸附柱所提取核酸为模板的PCR扩增产物的凝胶电泳图。

图2是不同再生次数的用于质粒提取的硅质膜离心吸附柱的质粒提取量。

图3是再生和未再生的使用过的用于琼脂糖凝胶回收的硅质膜离心吸附柱的核酸回收量。

图4是再生和未再生的使用过的用于聚合酶链式反应产物回收的硅质膜离心吸附柱的核酸回收量。

图5是再生液对用于质粒提取的未使用过的硅质膜离心吸附柱质粒提取量的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。

实施例1

将0.176g抗坏血酸加入100mL去离子水中，配制成10mmol/L的抗坏血酸水溶液，即溶液A；将0.003g硫酸铜、0.003g硫酸亚铁、0.009g乙二胺四乙酸、0.3mL聚乙二醇辛基苯基醚加入100mL去离子水中，配制成溶液B，溶液B中硫酸铜的浓度为0.2mmol/L、硫酸亚铁的浓度为0.2mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为0.3mmol/L，聚乙二醇辛基苯基醚的体积分数为0.3％；将100mL溶液A、100mL溶液B混合均匀，制备成硅质膜离心吸附柱再生液。

实施例2

将0.070g抗坏血酸加入100mL去离子水中，配制成4mmol/L的抗坏血酸水溶液，即溶液A；将0.003g硫酸铜、0.003g硫酸亚铁、0.004g乙二胺四乙酸、0.1mL聚乙二醇辛基苯基醚加入100mL去离子水中，配制成溶液B，溶液B中硫酸铜的浓度为0.2mmol/L、硫酸亚铁的浓度为0.2mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为0.15mmol/L，聚乙二醇辛基苯基醚的体积分数为0.1％；将100mL溶液A、100mL溶液B混合均匀，制备成硅质膜离心吸附柱再生液。

实施例3

将0.106g抗坏血酸加入100mL去离子水中，配制成6mmol/L的抗坏血酸水溶液，即溶液A；将0.009g硫酸铜、0.008g硫酸亚铁、0.009g乙二胺四乙酸、0.2mL聚乙二醇辛基苯基醚加入100mL去离子水中，配制成溶液B，溶液B中硫酸铜的浓度为0.5mmol/L、硫酸亚铁的浓度为0.5mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为0.3mmol/L，聚乙二醇辛基苯基醚的体积分数为0.2％；将100mL溶液A、100mL溶液B混合均匀，制备成硅质膜离心吸附柱再生液。

实施例4

将0.141g抗坏血酸加入100mL去离子水中，配制成8mmol/L的抗坏血酸水溶液，即溶液A；将0.012g硫酸铜、0.011g硫酸亚铁、0.015g乙二胺四乙酸、0.3mL聚乙二醇辛基苯基醚加入100mL去离子水中，配制成溶液B，溶液B中硫酸铜的浓度为0.7mmol/L、硫酸亚铁的浓度为0.7mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为0.5mmol/L，聚乙二醇辛基苯基醚的体积分数为0.3％；将100mL溶液A、100mL溶液B混合均匀，制备成硅质膜离心吸附柱再生液。

实施例5

将0.176g抗坏血酸加入100mL去离子水中，配制成10mmol/L的抗坏血酸水溶液，即溶液A；将0.017g硫酸铜、0.016g硫酸亚铁、0.029g乙二胺四乙酸、0.4mL聚乙二醇辛基苯基醚加入100mL去离子水中，配制成溶液B，溶液B中硫酸铜的浓度为1mmol/L、硫酸亚铁的浓度为1mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为1mmol/L，聚乙二醇辛基苯基醚的体积分数为0.4％；将100mL溶液A、100mL溶液B混合均匀，制备成硅质膜离心吸附柱再生液。

实施例6

在实施例1～5中，溶液B中的硫酸铜用等摩尔的氯化铜替换、硫酸亚铁用等摩尔的氯化亚铁替换，聚乙二醇辛基苯基醚用等体积的吐温-20替换，其他原料及其含量与相应实施例相同，制备成硅质膜离心吸附柱再生液。

本实施例的吐温-20也可用等体积的吐温-40替换，还可用等体积的吐温-60替换。

为了确定本发明的最佳原料配比，发明人进行了大量的实验室研究试验，各种试验情况如下：

实验材料：聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100，分子量为646.86，化学式为C₃₄H₆₂O₁₁)，由Sigma公司提供；抗坏血酸、硫酸铜(CuSO₄)、硫酸亚铁(FeSO₄)、乙二胺四乙酸(EDTA)均为市售产品；未使用的硅质膜离心吸附柱(用于质粒提取、琼脂糖凝胶回收和聚合酶链式反应产物回收的硅质膜离心柱)，由Qiagen公司提供；使用过的硅质膜离心吸附柱(用于质粒提取、琼脂糖凝胶回收和聚合酶链式反应产物回收的硅质膜离心柱)，由本实验室收集，也为Qiagen公司产品。

实验仪器：紫外分光光度计Biophotometer，由Eppendorf公司提供；电泳设备，由北京市六一仪器厂提供；PCR仪S1000，由Bio-rad公司提供。

为了研究溶液A中抗坏血酸的浓度以及溶液B中Cu²⁺、Fe²⁺、EDTA、TritonX-100的浓度对硅质膜离心吸附柱的再生液性能的影响，发明人设计了五因素四水平的正交试验，试验因素和水平见表1。将10mL溶液A与10mL溶液B混合，制备成不同配比的硅质膜离心吸附柱再生液，分别用于处理已经使用过的用于质粒提取的硅质膜离心吸附柱，然后用处理过的硅质膜离心吸附柱提取5mL过夜培养菌液中的质粒，使用紫外分光光度计对提取的质粒进行定量，并对测量数据进行直观分析，结果见表1。

表1正交试验设计及直观分析

由表1的正交试验结果可见，溶液A中抗坏血酸的浓度为4～10mmol/L，溶液B中Cu²⁺浓度为0.2～1mmol/L、Fe²⁺浓度为0.2～1mmol/L、乙二胺四乙酸浓度为0.15～1mmol/L、聚乙二醇辛基苯基醚的体积分数为0.1％～0.4％时，溶液A与溶液B按体积比为1∶1混合制备成的硅质膜离心吸附柱再生液可以高效彻底的消除使用过的硅质膜离心吸附柱上残留的核酸，其中，溶液A中抗坏血酸的浓度为10mmol/L，溶液B中Cu²⁺浓度为0.2mmol/L、Fe²⁺浓度为0.2mmol/L、乙二胺四乙酸浓度为0.3mmol/L、聚乙二醇辛基苯基醚的体积分数为0.3％时，溶液A与溶液B按体积比为1∶1混合制备成的硅质膜离心吸附柱再生液可以最大化的恢复硅质膜离心吸附柱的核酸吸附能力。

为了证明本发明的有益效果，发明人进行了大量的实验室研究试验，各种试验情况如下：

1、再生液消除核酸交叉污染的能力

将100mL溶液A(10mmol/L的抗坏血酸水溶液)、100mL溶液B(由CuSO₄、FeSO₄、EDTA、TritonX-100、去离子水组成，其中CuSO₄的浓度为0.2mmol/L、FeSO₄的浓度为0.2mmol/L，EDTA的浓度为0.3mmol/L，TritonX-100的体积分数为0.3％)混合均匀，制备成硅质膜离心吸附柱再生液。

取6个未使用的用于质粒提取的硅质膜离心吸附柱，按照试剂盒说明进行质粒提取，所提取的质粒带有Kan⁺抗性，保留获得的质粒。然后向其中3个硅质膜离心吸附柱中加入500μL硅质膜离心吸附柱再生液，室温静置5～30分钟，室温10000转/分钟离心1分钟，弃去接液管内液体，再向硅质膜离心吸附柱中加入750μL灭菌水，室温静置2分钟，室温10000转/分钟离心1分钟，弃去接液管内液体，完成硅质膜离心吸附柱的再生处理，再生的硅质膜离心吸附柱作为实验组；对另外3个硅质膜离心吸附柱不进行再生处理，作为对照组。将实验组和对照组的硅质膜离心吸附柱按照试剂盒说明再次进行另一种质粒的提取，此次提取的质粒带有Amp⁺抗性。以实验组和对照组中获得的质粒为模板，以第一次提取实验获得质粒的特异引物为引物，进行PCR扩增，扩增的目标产物是第一次获得质粒的一段特异性序列。对扩增产物进行凝胶电泳，检验实验组和对照组中获得的质粒中是否污染第一次的质粒样品。

按照与上述试验相同的方法，对用于琼脂糖凝胶回收和聚合酶链式反应产物回收的硅质膜离心吸附柱进行再生处理以及PCR扩增，然后对扩增产物进行凝胶电泳，试验结果见图1。图1中1号为实验组硅质膜离心吸附柱提取质粒为模板的PCR扩增产物的凝胶电泳图；2号为对照组硅质膜离心吸附柱提取质粒为模板的PCR扩增产物的凝胶电泳图；3号为实验组琼脂糖凝胶回收用硅质膜离心吸附柱回收产物为模板的PCR扩增产物的凝胶电泳图；4号为对照组琼脂糖凝胶回收用硅质膜离心吸附柱回收产物为模板的PCR扩增产物的凝胶电泳图；5号为实验组聚合酶链式反应产物回收用硅质膜离心吸附柱回收产物为模板的PCR扩增产物的凝胶电泳图；6号为对照组聚合酶链式反应产物回收用硅质膜离心吸附柱回收产物为模板的PCR扩增产物的凝胶电泳图。由图1的凝胶电泳结果可见，对照组可检测到一条特异的目的条带；而实验组的PCR扩增产物经电泳无任何特异条带。

同时，将实验组和对照组所提取的带有Amp⁺抗性的质粒转化成大肠杆菌，并将转化细胞涂布于带有Kan⁺抗性的LB固体培养基上。经过夜培养，对照组提取的质粒转化后生长出单克隆，说明有第一次质粒的残留污染，而实验组提取的质粒转化后未生长出单克隆，说明无第一次质粒的残留污染。

结合凝胶电泳结果和转化实验结果，经过硅质膜离心吸附柱再生液处理后的硅质膜离心吸附柱第二次提取的质粒没有受到第一次提取的质粒污染，经过再生液处理之后的用于琼脂糖凝胶回收的硅质膜离心吸附柱以及用于聚合酶链式反应产物回收的硅质膜离心吸附柱提取的核酸中，也没有检测到任何扩增产物。说明本发明的再生液可以有效清除使用过的硅质膜离心吸附柱上残留的核酸，从而确保重复使用的硅质膜离心吸附柱所获得核酸样品的纯度。

2、再生次数对硅质膜离心吸附柱提取的质粒量的影响

取3个使用过的用于质粒提取的硅质膜离心吸附柱，采用实验1制备的硅质膜离心吸附柱再生液进行再生处理后，作为实验组；同时取3个使用过的用于质粒提取的硅质膜离心吸附柱，不进行任何处理，作为对照组。将实验组和对照组的硅质膜离心吸附柱按照试剂盒说明进行质粒提取，然后对实验组的硅质膜离心吸附柱进行重复再生处理，之后继续提取质粒。每次实验，实验组和对照组的硅质膜离心吸附柱均用于提取5mL过夜培养菌液中的质粒，使用紫外分光光度计对提取的质粒进行定量，实验结果取3次测试结果的平均值，结果见图2。图2中1号为对照组使用过的用于质粒提取的硅质膜离心吸附柱提取的质粒量；2～6号依次为实验组使用过的用于质粒提取的硅质膜离心吸附柱重复使用1～5次提取的质粒量。

由图2可见，经硅质膜离心吸附柱再生液处理后，不论是再生液第1次处理的实验组，还是重复使用5次后的实验组，获得的质粒量都明显高于对照组；而且重复使用5次之后的实验组所获得的质粒量与第1次处理后使用该硅质膜离心吸附柱获得的质粒量没有明显差异，说明本发明中的再生液可以有效的恢复使用过的硅质膜离心吸附柱的核酸吸附能力，在很大程度上增加了硅质模离心吸附柱的使用次数。

3、再生液对用于琼脂糖凝胶回收的硅质膜离心吸附柱核酸吸附能力的影响

取3个使用过的用于琼脂糖凝胶回收的硅质膜离心吸附柱，采用实验1制备的硅质膜离心吸附柱再生液进行再生处理后，作为实验组；同时取3个使用过的用于琼脂糖凝胶回收的硅质膜离心吸附柱，不进行任何处理，作为对照组。分别向实验组和对照组的硅质膜离心吸附柱中加入含有等量核酸的凝胶，按照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明进行琼脂糖凝胶回收操作，使用紫外分光光度计对回收的核酸进行定量，实验结果取3次测试结果的平均值，结果见图3。图3中1号为对照组使用过的硅质膜离心吸附柱回收的核酸量，2号为实验组使用过的硅质膜离心吸附柱回收的核酸量。

由图3可见，经硅质膜离心吸附柱再生液处理后，实验组中再生处理的硅质膜离心吸附柱的核酸回收量高于对照组，说明本发明可以有效的恢复并提高使用过的用于琼脂糖凝胶产物回收的硅质膜离心吸附柱的核酸结合能力。

4、再生液对用于聚合酶链式反应产物回收的硅质膜离心吸附柱核酸吸附能力的影响

取3个使用过的用于聚合酶链式反应产物回收的硅质膜离心吸附柱，采用实验1制备的硅质膜离心吸附柱再生液进行再生处理后，作为实验组；同时取3个使用过的用于聚合酶链式反应产物回收的硅质膜离心吸附柱，不进行任何处理，作为对照组。分别向实验组和对照组的硅质膜离心吸附柱中加入含有等量核酸的聚合酶链式反应产物，按照回收试剂盒说明进行回收操作，使用紫外分光光度计对回收的核酸进行定量，实验结果取3次测试结果的平均值，结果见图4。图4中1号为对照组使用过的硅质膜离心吸附柱回收的核酸量，2号为实验组使用过的硅质膜离心吸附柱回收的核酸量。

由图4可见，经硅质膜离心吸附柱再生液处理后，实验组中再生处理的硅质膜离心吸附柱的核酸回收量高于对照组，说明本发明可以有效恢复并提高使用过的用于聚合酶链式反应产物回收的硅质膜离心吸附柱的核酸结合能力。

5、再生液对未使用的硅质膜离心吸附柱核酸吸附能力的影响(以用于质粒提取的硅质膜离心吸附柱为例)

用实验1制备的硅质膜离心吸附柱再生液分别处理出厂后放置了6个月、9个月和12个月的未使用的用于质粒提取的硅质膜离心吸附柱，作为实验组，每组处理3个。同时，以未处理的放置同样时间的未使用的用于质粒提取的硅质膜离心吸附柱作为对照组。分别使用实验组和对照组的硅质膜离心吸附柱提取5mL过夜培养菌液中的质粒，使用紫外分光光度计对提取的质粒进行定量，实验结果取3次测试结果的平均值，结果见图5。图5中1、3、5号依次为对照组中出厂后放置了6、9、12个月的硅质膜离心吸附柱的质粒提取量，2、4、6号依次为实验组中出厂后放置了6、9、12个月的硅质膜离心吸附柱的质粒提取量。

由图5可见，实验组中再生液处理过的硅质膜离心吸附柱所获得的质粒总量明显高于对照组，说明本发明的再生液对于放置时间较长的未使用的硅质膜离心吸附柱的核酸结合能力也有比较明显的改善作用，且与硅质膜离心吸附柱的放置时间无明显关系。

Claims

1.一种硅质膜离心吸附柱再生液，其特征在于：它由溶液A与溶液B按体积比为1∶1混合而成，所述的溶液A为4～10mmol/L的抗坏血酸水溶液，所述的溶液B由硫酸铜或氯化铜、硫酸亚铁或氯化亚铁、乙二胺四乙酸、非离子型表面活性剂、去离子水组成，溶液B中Cu²⁺浓度为0.2～1mmol/L、Fe²⁺浓度为0.2～1mmol/L、乙二胺四乙酸浓度为0.15～1mmol/L、非离子型表面活性剂的体积分数为0.1％～0.4％；

2.根据权利要求1所述的硅质膜离心吸附柱的再生液，其特征在于：所述的溶液A为10mmol/L的抗坏血酸水溶液，所述的溶液B中Cu²⁺浓度为0.2mmol/L、Fe²⁺浓度为0.2mmol/L、乙二胺四乙酸浓度为0.3mmol/L、非离子型表面活性剂的体积分数为0.3％。

3.根据权利要求2所述的硅质膜离心吸附柱的再生液，其特征在于：所述的非离子型表面活性剂为聚乙二醇辛基苯基醚。