CN115404233A - 一种核酸提取试剂及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种核酸提取试剂及其使用方法，所述核酸提取试剂包含了TBE缓冲液、表面活性剂和吸附剂，所述核酸提取试剂可以快速裂解且裂解后所释放的核酸样本可以长期稳定保存，所述核酸提取试剂具备一定的纯化和抗干扰能力；所述核酸提取试剂的使用方法包括以下步骤：将所述核酸提取试剂放入样品管内；将含有样本的拭子浸没于所述样品管内的所述核酸提取试剂内；将所述样品管内的所述核酸提取试剂混匀，并使其瞬时离心；将含有瞬时离心的所述核酸提取试剂的所述样品管放置在室温下静置2‑5min，取所述样品管内的上清液；将所述上清液用于PCR扩增。本发明的所述使用方法在操作过程中无需加热和中途开盖，可有效的避免核酸样本在检验过程中被污染。

Description

一种核酸提取试剂及其使用方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种核酸提取试剂及其使用方法。
背景技术
核酸是生物分子必不可少的物质之一，核酸检测是病原体检测筛查至关重要的一环。目前新型冠状病毒检测的基本方法是对受检人群的鼻咽或口咽拭子进行RNA逆转录聚合酶链式反应即RT-PRC，是世界卫生组织和中国国家卫健委作为确诊新冠感染的主要依据。
核酸检测广泛应用于各种病原体样本的检测与基因扩增中，核酸提取是核酸检测中最关键的步骤，目前市面上核酸提取试剂盒中的基本操作步骤主要是裂解-洗涤-洗脱，操作步骤较为繁琐，耗时长且成本较高。
申请号为CN202110916887.9的专利申请公布了一种核酸释放剂，其中含有的成分可以破坏样本蛋白质结构且能变性、吸附及沉淀样本中核酸扩增抑制物质，其操作步骤中首先先根据样本类型的区别进行稀释，然后再加入裂解试剂进行加热孵育，核酸才能得到释放，操作过程相对繁琐。
公告号为CN112176029B的专利公布了一种核酸样本释放剂的配方中含有盐酸胍、异硫氰酸胍，胍盐容易受到温度的变化及盐离子浓度等成分影响，从而造成核酸的提取效果下降。
因此，如何高效简便的提取核酸样本，并快速的提取、纯化核酸，同时又可以长期稳定的保存核酸样本，核酸提取试剂是关键所在。
发明内容
本发明提供了一种核酸提取试剂，本发明还提供了所述核酸提取试剂的使用方法。
为实现本发明的第一个目的，采用如下技术方案：
一种核酸提取试剂，包括以下成分：
pH为7-9、浓度为2-30mmol/L的缓冲液；
浓度为0.2-10％的表面活性剂；
浓度为1-20％的吸附剂。
作为本发明所述的一种核酸提取试剂的优选方案，所述缓冲液为TBE缓冲液。
作为本发明所述的一种核酸提取试剂的优选方案，所述表面活性剂包括活性成分，所述活性成分为十二烷基硫酸钠和曲拉通中的一种或多种。
作为本发明所述的一种核酸提取试剂的优选方案，所述表面活性剂还包括添加剂，所述添加剂为吐温20。
作为本发明所述的一种核酸提取试剂的优选方案，所述吸附剂为螯合树脂chelex100。
作为本发明所述的一种核酸提取试剂的优选方案，所述表面活性剂的浓度为2％。
作为本发明所述的一种核酸提取试剂的优选方案，所述缓冲液的浓度为10 mmol/L、pH为8.3。
作为本发明所述的一种核酸提取试剂的优选方案，所述吸附剂的浓度为 6％。
为实现本发明的第二个目的，采用如下技术方案：
一种核酸提取试剂的使用方法，包括以下步骤：
第一步：将由所述缓冲液、所述表面活性剂和所述吸附剂制成的核酸提取试剂放入样品管内；
第二步：将含有样本的拭子浸没于所述样品管内的所述核酸提取试剂内；
第三步：通过将所述样品管以上、下颠倒结合摇晃的方式或通过将所述样品管进行涡旋震荡的方式使得所述核酸提取试剂混匀，以至于所述核酸提取试剂瞬时离心；
第四步：将含有瞬时离心的所述核酸提取试剂的所述样品管放置在室温下静置2-5min，取所述样品管内的上清液。
作为本发明所述的核酸提取试剂的使用方法的优选方案，将所述上清液用于PCR扩增。
在本发明中，所述上清液即为样本中的核酸释放到核酸提取试剂经离心产生的核酸溶液，因此，将所述上清液用于PCR扩增即为将所述核酸溶液用于PCR 扩增。
本发明的有益效果：
(1)本发明采用的样本核酸提取试剂可以将需多步骤的核酸提取流程简化为一步提取，流程简化且高效便捷；
(2)核酸提取试剂中含有核酸稳定剂的成分，使其能够稳定保存的时间更长，其在室温下可稳定保存48h，4℃的温度下可稳定保存72h，-20℃的温度下可稳定保存3个月，-70℃的温度下可稳定保存至少12个月；
(3)核酸提取试剂中含有一定的吸附成分，打破传统检测流程中快速裂解液而无法纯化核酸样本的瓶颈，本申请的核酸提取试剂具备一定的纯化和抗干扰能力；
(4)使用时仅需将采样管中核酸样本浸没于核酸提取试剂内并进行上下颠倒混匀或涡旋震荡混匀，在常温下静置2-5min，即可同步完成灭活样本与提取样本的核酸，无需其它的步骤就可取出用于检测；
(5)采用本申请使用方法检测核酸样本的检出效果与采用磁珠提取法处理后的检出率一致；
(6)核酸提取试剂的使用方法操作过程中可同时完成核酸样本保存、细胞裂解、核酸的提取和纯化；
(7)核酸提取试剂在使用的操作过程中无需对其加热和中途打开盛有核酸提取试剂的样品管的管盖，可有效的避免检验过程中可能会发生的污染。
附图说明
图1：实施例八的乙型流感梯度样本荧光PCR检测扩增图；
图2：实施例八的新型冠状病毒核酸质控品样本(S1～S4)检测N基因的荧光PCR检测扩增图；
图3：实施例八的新型冠状病毒核酸质控品样本(S1～S4)检测ORF1ab基因的荧光PCR检测扩增图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例一
一种核酸提取试剂，包括以下成分：
缓冲液：PH为8.3、浓度为10mmol/L的TBE缓冲液；
表面活性剂：浓度为2％的十二烷基硫酸钠；
吸附剂：浓度为6％的螯合树脂chelex100。
实施例二
一种核酸提取试剂，包括以下成分：
缓冲液：PH为8.3、浓度为10mmol/L的TBE缓冲液；
表面活性剂：浓度为2％的曲拉通；
吸附剂：浓度为6％的螯合树脂chelex100。
实施例三
一种核酸提取试剂，包括以下成分：
缓冲液：PH为8.3、浓度为10mmol/L的TBE缓冲液；
表面活性剂：浓度为2％的十二烷基硫酸钠和吐温20；
吸附剂：浓度为6％的螯合树脂chelex100。
实施例四
一种核酸提取试剂，包括以下成分：
缓冲液：PH为8.3、浓度为10mmol/L的TBE缓冲液；
表面活性剂：浓度为2％的十二烷基硫酸钠和曲拉通；
吸附剂：浓度为6％的螯合树脂chelex100。
实施例五
一种核酸提取试剂，包括以下成分：
缓冲液：PH为8.3、浓度为10mmol/L的TBE缓冲液；
表面活性剂：浓度为2％的吐温20和曲拉通；
吸附剂：浓度为6％的螯合树脂chelex100。
实施例六
一种核酸提取试剂，包括以下成分：
缓冲液：PH为8.3、浓度为10mmol/L的TBE缓冲液；
表面活性剂：浓度为2％的表面活性剂为十二烷基硫酸钠、吐温20和曲拉通；
吸附剂：浓度为6％的螯合树脂chelex100。
实施例七
实施例一～实施例六的核酸提取试剂的使用方法，包括以下步骤：
第一步：将由缓冲液、表面活性剂和吸附剂制成的核酸提取试剂放入样品管内；
第二步：将含有样本的拭子浸没于样品管内的核酸提取试剂内，旋紧样品管的管盖；
第三步：通过将样品管以上、下颠倒5次，再摇晃1次或通过将样品管进行涡旋震荡5s使得核酸提取试剂混匀，以至于核酸提取试剂瞬时离心；
第四步：将含有瞬时离心的核酸提取试剂的样品管放置在室温下静置 2-5min，取样品管内的上清液。
第五步：将上清液作为扩增模板用于PCR扩增。
实施例八
在本申请中，以实施例一的核酸提取试剂作为实施例八的研究对象。
1.实验材料
(1)实施例一的拭子样本核酸提取试剂；
(2)释放剂Ⅰ(释放剂Ⅰ购自市场)：其主要成分包括：浓度为5mol/L 的EDTA，PH为8.5、浓度为50mmol/L的Tris缓冲液，浓度为25％的DMSO，浓度为2％的Triton X-100，浓度为0.3mol/L的盐酸胍。
2.以实施例一的拭子样本核酸提取试剂，分别对乙型流感病毒培养物的梯度(来源：广东和信健康科技有限公司微生物组培养)和新型冠状病毒质控品 (S1～S4)(来源：国家卫健委研制、广东和信健康科技有限公司生产)进行提取、纯化，所得核酸溶液作为扩增模板，直接加至PCR反应液中，上PCR扩增仪进行扩增。
同时以释放剂Ⅰ作为对照，取同时平行取样的拭子临床阳性样本按照厂家说明书进行核酸提取，取提取后的核酸PCR检测。
在图1、图2和图3中的“现有技术”即为购自市场上的释放剂Ⅰ。
乙型流感梯度样本的检测结果见表1和图1，在检测过程中核酸PCR检测所使用的PCR扩增试剂盒是商品化有证的乙型流感病毒核酸检测试剂盒。
表1实施例一的核酸提取试剂与释放剂Ⅰ的乙型流感梯度样本释放核酸结果
Figure BDA0003794845400000061
表1中的释放核酸结果指的是实施例一的样本核酸提取试剂比释放剂Ⅰ提高的倍数。
表1中的△Ct指的是采用释放剂Ⅰ释放的Ct值与采用实施例一的核酸提取试剂释放的的Ct值的差。
由图1和表1的结果可知，实施例一的核酸提取试剂对样本的处理并提取、纯化核酸的效果要明显优于释放剂Ⅰ。
新型冠状病毒核酸质控品样本的检测结果见图2、图3和表2，在检测过程中核酸PCR检测所使用的PCR扩增试剂盒是商品化有证的新型冠状病毒核酸检测试剂盒。
表2实施例一的核酸提取试剂与释放剂Ⅰ的新型冠状病毒核酸质控品样本检测结果
Figure BDA0003794845400000071
表2中的△Ct指的是采用释放剂Ⅰ检测灵敏度的Ct值与采用实施例一的核酸提取试剂检测的灵敏度的Ct值的差。
由图2、图3和表2的结果可知，实施例一的核酸提取试剂对样本的处理并提取、纯化核酸的效果要优于释放剂Ⅰ。
综上，本发明的样本核酸提取试剂对RNA病毒和DNA病毒的处理效果均满足需求，且效果优于其他厂家的样本释放剂。
实施例九
将实施例一的样本核酸提取试剂按实施例七的使用方法分别对11份装不同来源的腺病毒阳性临床样本进行核酸提取，所得核酸溶液作为扩增模板，直接加至PCR反应液中，上PCR扩增仪进行扩增。
同时以磁珠提取法为对照。取同时平行取样的腺病毒临床阳性样本按照厂家说明书进行核酸提取，其中核酸提取所使用的试剂盒是广东和信健康科技有限公司核酸提取或纯化试剂，提取后的核酸PCR检测。
采用实施例一的核酸提取试剂和磁珠提取试剂对腺病毒阳性临床样本处理后的PCR扩增结果如表3所示。
表3腺病毒阳性临床样本的PCR扩增结果
样本编号 磁珠提取试剂 样本释放剂
样本1 26.94 26.15
样本2 31.67 32.34
样本3 30.04 31.60
样本4 33.64 32.50
样本5 23.92 25.63
样本6 27.81 28.85
样本7 29.44 29.97
样本8 28.20 28.12
样本9 31.80 32.63
样本10 27.36 27.23
样本11 32.64 31.40
由表3的结果可知，实施例一的核酸提取试剂与磁珠提取试剂对不同来源的腺病毒阳性临床样本进行处理后的检出率一致。
实施例十
核酸提取试剂的稳定性测试
以实施例一的拭子蘸取副流感病毒培养物的梯度样本溶液(来源：广东和信健康科技有限公司微生物组培养)以及腺病毒培养物的梯度样本溶液(来源：广东和信健康科技有限公司微生物组培养)后，折断到盛放样本核酸提取试剂的样品管中，旋紧管盖，然后分别在室温放置0小时、6小时、12小时、24小时；在4℃放置0小时、24小时、48小时、72小时；在-20℃放置0个月、1个月、2个月、3个月和在-70℃放置0个月、3个月、6个月、12个月，平衡至直接加溶液至PCR反应液中，进行上机扩增检测。
PCR检测所使用的PCR扩增试剂盒是广东和信健康科技有限公司腺病毒核酸检测试剂盒与副流感病毒1型核酸扩增(PCR)荧光定性检测试剂盒。
室温储存下的样本扩增结果见表4.1，4℃储存下的样本扩增结果见表4.2，-20℃储存下的样本扩增结果见表4.3，-70℃储存下的样本扩增结果见表4.4。
表4.1室温储存下的样本扩增结果
Figure BDA0003794845400000091
表4.2 4℃储存下的样本扩增结果
Figure BDA0003794845400000092
表4.3-20℃储存下的样本扩增结果
Figure BDA0003794845400000093
表4.4-70℃储存下的样本扩增结果
Figure BDA0003794845400000094
由表4.1～4.4的样本扩增结果可知，以实施例一的扩增结果为例展示，说明样本核酸提取试剂对DNA病毒(腺病毒)和RNA病毒(副流感病毒1型)，室温下可稳定保存48小时，4℃下可稳定保存72小时，-20℃下可稳定保存3 个月，-70℃下可稳定保存至少12个月。
以上所述仅是本发明的实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种核酸提取试剂，其特征在于，所述核酸提取试剂包括以下成分：
pH为7-9、浓度为2-30mmol/L的缓冲液；
浓度为0.2-10％的表面活性剂；
浓度为1-20％的吸附剂；
其中，所述缓冲液为TBE缓冲液；所述表面活性剂包括活性成分，所述活性成分为十二烷基硫酸钠和曲拉通中的一种或多种；所述吸附剂为螯合树脂chelex100。
2.根据权利要求1所述的一种核酸提取试剂，其特征在于，所述表面活性剂还包括添加剂，所述添加剂为吐温20。
3.根据权利要求2所述的一种核酸提取试剂，其特征在于，所述表面活性剂的浓度为2％。
4.根据权利要求1所述的一种核酸提取试剂，其特征在于，所述缓冲液的浓度为10mmol/L、pH为8.3。
5.根据权利要求1所述的一种核酸提取试剂，其特征在于，所述吸附剂的浓度为6％。
6.权利要求1-5任一项所述的核酸提取试剂的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步骤：
第一步：将由所述缓冲液、所述表面活性剂和所述吸附剂制成的核酸提取试剂放入样品管内；
第二步：将含有样本的拭子浸没于所述样品管内的所述核酸提取试剂内；
第三步：通过将所述样品管以上、下颠倒结合摇晃的方式或通过将所述样品管进行涡旋震荡的方式使得所述核酸提取试剂混匀，以至于所述核酸提取试剂瞬时离心；
第四步：将含有瞬时离心的所述核酸提取试剂的所述样品管放置在室温下静置2-5min，取所述样品管内的上清液。
7.根据权利要求6所述的核酸提取试剂的使用方法，其特征在于，将所述上清液用于PCR扩增。
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