CN108410951B - 一种新的核酸提取试剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于低温核酸扩增的样品核酸快速提取试剂及其应用方法。核酸提取试剂包括样品处理试剂、核酸吸附棒和漂洗液。将待检样品与提取试剂以1:1‑1:10的比例混合，在热水（约60℃‑100℃）下水浴1分钟后所得的溶液在纤维素核酸吸附棒的转移下经过漂洗后可直接用于低温核酸扩增检测。本发明核酸提取试剂使用安全简便，成本低廉，结合重组酶聚合酶扩增技术，能够在非实验室条件下对细菌、昆虫、各种动物组织、法医样品（口腔细胞、毛发、尿液、唾液、血液、组织样品）及组织中的细菌和病毒等分子生物学样品进行检测。

Description

一种新的核酸提取试剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种用于低温核酸扩增技术释放样品核酸的方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

分子诊断与核酸检测已广泛地应用于传染病或遗传病诊断、无创产前基因检测、流行病学调查、致病微生物检测、科学研究等领域，它比免疫学检测技术灵敏度更高, 结果更准确、可靠[1]。然而，分子诊断首先需要进行核酸提取，核酸提取技术目前还只是专业人员掌握的专业性技术，随着基于核酸水平的检测技术及临床诊断技术迅猛发展，如今急需一种简便的现场DNA释放并检验的方法，能够广泛应用于基层医院、检测现场甚至大众家庭中的核酸提取或释放技术，进而结合更为方便的低温核酸扩增技术，实现对样本的快速检测，从而让基层医院、畜牧饲养技术指导中心、市场监督管理部门、甚至普通大众能够自行进行传染病原的检测、遗传基因分型测试等等[2,3]。

核酸在细胞中总是与组蛋白等有机物结合在一起，核酸的提取首先需要将细胞裂解，而后将核酸与蛋白质、多糖、脂质等大分子有机物分离开来，并且要保持核酸一级结构的完整性。经过近几十年的发展，核酸的提取主要分为三种方法：酚氯仿提取法（酚氯仿法），二氧化硅膜离心吸附柱提取法（吸附柱法），二氧化硅表面修饰磁性颗粒吸附核酸提取法（磁珠法）[4]。最初的酚氯仿法操作复杂、耗时长，而且提取的核酸含量不稳定，在临床基因检测和实验室研究当中已经很少使用。吸附柱法广泛的应用到临床基因检测和实验室的研究工作中，市场上有多种专业试剂盒可供使用，它具有提取核酸的纯度高、含量稳定等优点，但是这种方法操作复杂，需要专业人员进行操作，而且需要借助昂贵的实验室高速离心机等设备，无法应用到普通大众的基因检测当中[5]；磁珠法比吸附柱法操作过程更加简便，而且提取的核酸同样纯度高、含量高，但是基于磁珠DNA分离提纯的方法操作仍然步骤较多，且需要专业技能，并依赖于实验室设备[6]。近些年来，用Chelex-100提取方法提取少量DNA成为比较简单流行的方法。Chelex-100是一种由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成化学合成树脂；它含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，具有更高的金属离子选择性和较强的结合力，通过离心除去Chelex-100颗粒，使这些与Chelex-100结合的物质与DNA分离，并防止结合到Chelex中的抑制剂或杂质带到PCR反应中。但整个过程仍需要多次离心和洗涤步骤，无法脱离实验室进行[7,8]。

FTA卡是由Whatman公司开发的一项专利技术，国际专利申请号为WO00/62023 和WO02/16383，应用于室温下DNA和RNA的采集、运输、纯化和储存，所有工作均在一张卡上完成，采集和保存操作步骤大幅度简便化，并去除了高速离心，微量点样等实验室环节。然而，FTA卡对于制备过程却需要点样、晾干、洗脱等过程，需要至少约半个小时的时间，因此它对于现场样品的保存和运输更具有重要的意义，而对于现场检测应用并无突出优势；且通过打孔的方式将DNA加入反应管后，纸片会影响从底部进行荧光扫描的恒温荧光仪器对于荧光值的读取与记录；而且FTA卡因受专利保护，使用成本较高。尽管徐飞等（FTA卡和普通定性滤纸提取DNA方法研究.生物技术通报,2011（11）：221-224）通过对FTA采样卡和普通定性滤纸的两种DNA提取方法进行比较，证明普通定性滤纸可作为更为经济的DNA 模板制备方法一定程度上替代FTA卡，对于使用步骤中时间较长和滤片影响荧光读取的问题仍存在。

随着核酸提取技术的发展，目前已出现多种更为简便的DNA提取装置和提取试剂及方法。这些方法的基本原理多为通过向裂解液或裂解试剂中添加低浓度作用力较强的变性剂如阳离子或阴离子表面活性剂成分，并添加一定量的作用力较弱的非离子型表面活性剂进行中和，通过高温孵育数分钟，在碱性环境下，通过强变性剂对细胞壁、细胞膜、核膜或线粒体膜等进行蛋白变性和结构破坏，并将DNA释放出来。变性剂作用力强弱、变性剂的浓度，碱性环境等成为DNA释放的关键因素。然而，这些试剂或环境对于下游步骤的DNA或RNA扩增所必须的聚合酶同样具有强烈的抑制作用。因此探索合适的释放环境并解除扩增抑制是追求便捷高效核酸释放方法的关键所在。

Sekikawa T等（Sekikawa T, Kawasaki Y, Katayama Y, et al. A simplemethod for extracting DNA from Cryptosporidium oocysts using the anionicsurfactant LSS.[J]. N Biotechnol, 2011, 29(1):139-143.）利用月桂酰肌氨酸钠（N-Lauroylsarcosine Sodium）和吐温-20等试剂提取隐孢子虫卵的DNA，用于环介导等温扩增技术检测，该DNA提取方法为将隐孢子虫卵置于特定的核酸裂解释放液中，在90℃条件下恒温水浴15分钟，操作大为简化。其核酸裂解释放配方为：0.1%月桂酰肌氨酸钠，5%吐温-20或Trixon X-100；并首次系统阐述并通过实验证明了终浓度0.1%月桂酰肌氨酸钠对DNA聚合酶的抑制作用，可以通过稀释至0.01%或非离子型表面活性剂消除。申请号为CN201210021643.5的发明专利，提供了一种从细胞中提取核酸的核酸提取方法，该方法无需针对不同的微生物样品设计不同的核酸提取试剂，也无需复杂的操作过程，只需针对不同样品在105℃-160℃的特定温度范围内进行孵育释放核酸，其采用较为通用的缓冲液[20mM Tris-HCl (三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)、2% TritonX-100]，通过高温裂解原理使细胞破碎并释放DNA，应用于下游扩增实验。尽管操作简便迅速，加热时间只约两分钟，然而需要购买特定的高温裂解装置，且需要较高的能源驱动。

细胞中的核酸在碱性条件下能够更好的释放，而且低温核酸扩增方法能够在碱性条件下进行反应。蒋超等（使用碱裂解法快速提取药材DNA方法的研究. 药物分析杂志,2013, 45(7):1081-1090.）应用碱裂解法快速提取动物和植物药材中的DNA，对144个中药材进行PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳可检测到123个中药材DNA的PCR产物。该方法操作步骤少，提取速度快，不需要使用酚、三氯甲烷等有毒试剂，但是需要煮沸、离心等操作，提取时间仍需要10分钟。

国际申请专利WO2013/175188描述了一种从生物样品中提取核酸的方法和装置，该装置是将含有多个官能团的杀虫剂结合在纤维素滤器上，将该装置接触含有微生物的样品，通过加入缓冲液或者加热处理，各种官能团就能将微生物的细胞膜或者细胞壁弱化溶解，并捕获释放的核酸，而后进行PCR扩增。所采用的含有多个官能团的杀虫剂为甲硅烷基化的季铵化合物(SiQAC)，例如3-( 三甲氧基甲硅烷基) 丙基二甲基十八烷基氯化铵，它带有三个官能团，分别是烷基链( 疏水部分)、甲硅烷基基团( 结合部分) 和氯化铵基团( 带电荷部分)。带正电荷的分子吸附到带负电荷的细胞表面上，通过SiQAC 分子上的亲脂链破坏细胞膜，以及通过该膜的扩散导致细胞溶解。实验产生甚至比GeneXpert金标“更好”的更好的扩增结果。该方法操作简单，价格低廉，然而其使用方式类似FTA卡使用，现场操作仍需要较长的时间，整个DNA过程超过15分钟。另外，该申请提到将含有多个官能团的杀虫剂结合在纤维素滤器，进而对核酸进行捕捉，虽操作简单方便，但其需要将捕捉到核酸的官能化纸加入到PCR反应体系中，若这张含有核酸的官能化纸加入到重组酶聚合酶反应体系中，会干扰荧光扩增仪的荧光读值。

Morono等（Morono Y, Terada T, Hoshino T, et al. Hot-alkaline DNAextraction method for deep-subseafloor archaeal communities[J]. Appl EnvironMicrobiol, 2014, 80(6):1985-1994.）也探索了在热碱性条件下提取海底古细菌DNA的方法，古细菌比一般细菌病毒或细胞的细胞膜较难破裂，所以在应用到普通病原和细胞的DNA提取可能无需这么严酷的裂解条件。Nori等（Nori D V, Mccord B R. The applicationof alkaline lysis and pressure cycling technology in the differentialextraction of DNA from sperm and epithelial cells recovered from cotton swabs[J]. Analytical & Bioanalytical Chemistry, 2015, 407(23):6975-6984.）建立了应用压力循环技术在碱性条件下提取棉拭子中人体精液和阴道上皮细胞的DNA的方法，表明在强碱性条件下能够破碎细胞进而释放核酸，但是整个核酸释放过程需要20分钟，在现场检测和大众家庭应用中样品处理时间过长，从而影响后续的实验。

苟大平等（一种适于PCR和LAMP检测的松木中松材线虫DNA快速提取方法.林业科学,2015,51(6)）运用Chelex-100结合异硫氰酸胍蛋白变性缓冲液快速提取微量木块中线虫DNA，并结合常规PCR与环介导等温扩增( LAMP)对提取的线虫DNA的75倍稀释液再稀释32倍后进行检测验证，检测结果仍然为阳性。虽然该提取方法DNA浓度远大于常规方法且操作简单，但是需要经过冻融和煮沸，整个DNA的提取过程大约需要20分钟，在大众家庭和现场检测中仍然需要较长的时间。

专利申请号为CN201510446386.3的发明专利提供了一种“一步法”提取血清或血浆样本中核酸的方法，需要加入核酸释放试剂在94℃条件下裂解10分钟，而后降温即可用于PCR扩增，但是这需要借助PCR仪或者恒温孵育设备，仍然无法应用到普通大众和现场检测当中。申请号为201710931302.4的发明专利提供了一种从口腔、全血以及干血斑中提取核酸的核酸提取方法，并且需要离心去上清之后再加入核酸释放剂，但是这需要借助离心机等设备，在普通家庭或者现场检测较难实现。

恒温扩增技术因其操作简单、仪器控温容易实现已作为基于核酸扩增技术的现场快速检验的最重要的手段之一。其中，基于重组酶聚合酶的扩增技术，Recombinasepolymerase amplification（RPA），重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。因其反应时间短、扩增效率高，扩增特异性强、反应温度低等多个方面均具有明显的优势。上文提到的多种较简便的DNA提取方法，但是它们或是因为需要在恒定的高温条件下孵育，或是因为其中的试剂抑制了低温核酸扩增反应中酶的活性等，导致它们无法在普通家庭和现场进行快速DNA提取或释放。本次研究发明主要针对基于重组酶聚合酶的扩增技术进行的优化与改进。

David S. Boyle,Dara A. Lehman等（David S. Boyle,Dara A. Lehman,Lorraine Lillis,Dylan Peterson,et al. Rapid Detection of HIV-1 Proviral DNAfor Early Infant Diagnosis using Recombinase Polymerase Amplification.Research Article 2013,4(2):e00135）将重组酶聚合酶扩增技术应用到对人类免疫缺陷病毒检测的检测当中，应用酚氯仿提取法（酚氯仿法）提取细胞混合物中的DNA，并结合63种HIV-1特异性引物和探针对HIV-1进行RPA检测，从而确定了HIV-1基因组的2个不同区域（LTR和POL序列），并且能够检测到HIV-1所有的全球亚型，虽然实现了RPA对HIV-1诊断的新突破，但其还是使用酚氯仿等有毒试剂提取相关的基因组DNA，此提取方法操作步骤复杂。Brittany Rohrman等（Brittany Rohrman, Rebecca Richards-Kortum. Inhibition ofRecombinase Polymerase Amplification by Background DNA: A Lateral Flow-BasedMethod for Enriching Target DNA. Analytical Chemistry 2015, 87:1963−1967）开发了一种通过侧流层析试纸条富集靶DNA的方法，加入模板后漂洗3次，使靶DNA与寡核苷酸结合，而后切除捕获到的背景DNA的区域，最后通过洗脱溶液将靶DNA洗脱下来进行重组酶聚合酶扩增。本方法虽然可以获得较纯的目标DNA，但是操作时间较长且无法针对不同的目标模板进行提纯。

Zou Y等（Zou Y， Mason MG, Wang Y, Wee E, Turni C, Blackall PJ, et al.Nucleic acid purification from plants, animals and microbes in under 30seconds. . PLoS Biol 15(11): e2003916.https://doi. org/10.1371/journal.pbio.2003916）开发了一种纤维素纸片的快速纯化技术。通过三种不同的裂解试剂，对植物叶片、动物全血、病毒等样本进行裂解，将3mm纤维素纸片置于高盐浓度的裂解液后吸附DNA或RNA约30秒至1分钟，并在漂洗液中漂洗约1分钟后，将纤维素片放入扩增液中进行反应，可应用的扩增类型包括普通的PCR扩增、基于BST DNA聚合酶的环介导等温扩增（LAMP）及基于重组酶聚合酶的低温扩增反应，整个DNA制备过程只需要寥寥数分钟。同时，研究者制作了8mm2的纤维素纸条蘸取针对植物叶片释放的DNA样本，经过简单洗脱后，将纸片浸入反应液三次后即可进行反应，将整个过程缩短至30秒时间，且无需通过移液器进行微量加样，操作非常便利。但是该更为快速的方法为了便于DNA或RNA吸附于纤维素纸片上，所公布的抽提液均为高盐浓度的弱酸、中性或弱碱环境，如果通过蛋白酶K等或粘稠的高浓度盐酸胍辅助裂解样本。如果采用纤维素纸条蘸取的方式，需要在漂洗液中漂洗更长时间，充分将高浓度盐酸胍等去除之后才能加入到扩增反应体系中。这点通过文中所公布的时间及本发明人均已证实，因此提取过程仍不够简便。而通过将纸片置于反应液中，也同时有前述影响荧光读取的问题。

Cameron Myhrvold、Feng Zhang等（Cameron Myhrvold, Feng Zhang, CatherineA,et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Case13）开发了一种快速检测临床病毒样品的方法（heating unextracted diagnostic samples to obliteratenucleases（HUDSON）和 specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking技术（SHERLOCK）），通过对病毒样品进行热处理和化学处理使核酸酶和病毒失去活性的基础上释放核酸，而后结合重组酶聚合酶扩增反应进行检测，该方法已经完全实现了脱离实验室操作，并特别适合容易降解的RNA样品处理，整个过程需要约10-30分钟。而对于DNA样本释放与制备，其时间上并无优势。

为了克服现有技术的不足，本发明专利旨在提供一种适用于低温核酸扩增技术的核酸提取试剂及其方法，进而实现能够在普通大众生活和现场进行基因检测或基于核酸的病原微生物检验。

发明内容

本发明根据现有成果，尤其受Zou Y、Ben Cobb等文章或专利的启发，通过探索一种既可在低浓度下具有较强烈的裂解作用的变性剂或作用PH环境，能够较为快速并方便的将组织细胞破碎，又可以通过一种简便的方式去除或降低强变性剂对于扩增聚合酶的影响，从而提供一种用于低温核酸扩增技术释放样品核酸的试剂，只需一步操作就能完成对诸如尿液、唾液、血液、牛奶、菌液、口腔拭子、各种动物组织以及组织中的细菌和病毒等样本中核酸的提取，获得的核酸可直接用于低温核酸扩增技术进行核酸扩增和检测，这样就可以实现在非实验室条件下完成基于核酸分子的检测。

本发明所述的核酸提取试剂包括样品处理试剂、核酸吸附棒和漂洗液。

通过对比不同的强变性剂异硫氰酸胍、盐酸胍、尿素、十二烷基硫酸钠、月桂酰肌氨酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、二甲基十八烷基[3-三甲基硅丙基]氯化铵（CAS#: 27668-52-6），现有公布的强变性试剂均为DNA提纯过程的中间环节，通过洗脱步骤可以去除对扩增的抑制作用。如果直接加入扩增体系，实验证明均对DNA聚合酶有强烈抑制作用。根据本发明的一个优选实施方案，样品处理试剂由三种主要成分组成，一是终浓度为0.2mM-1mM的甲硅烷基化的季铵化合物(SiQAC)，优选为3-( 三甲氧基甲硅烷基) 丙基二甲基十八烷基氯化铵，二是终浓度为0.1%-10%的吐温-20或Trixon X-100或其组合，三是终浓度为0.05-0.5mol/L的NaOH，样品处理试剂的PH值为12-13.6，其中的百分比指的是质量体积比，试剂的介质为去离子水。

核酸吸附棒基质材料为介质表面存在游离羟基的材料，优选是纤维素材料；例如，纤维素滤纸或纤维素基质能够吸附甲硅烷基化的季铵化合物(SiQAC)，进而吸附DNA分子，或者对DNA分子的直接吸附。

漂洗液为5mM-50mM的TRIS-Ac盐类缓冲液或者其它常见的缓冲盐类，PBS，TE，PH介于6.5-9.0之间。

在优选的情况下，低温核酸扩增技术释放样品核酸的试剂配制方法为：在灭菌去离子水中加入甲硅烷基化的季铵化合物(SiQAC)，使其终浓度为0.2mM-1mM，再加入吐温-20或Trixon X-100或它们之间的混合物，使其浓度为0.1%-10%（%为质量体积比），而后缓慢加入NaOH，浓度为0.05-0.5mol/L，溶液的pH值为12-13.6。

具体的，在一个优选的实施方案中，使用本发明所述的核酸提取试剂提取核酸的方法包括如下步骤：（1）将样本与权利要求1或2所述的样品处理试剂接触；（2）用核酸吸附棒在步骤（1）的离心管中蘸取；（3）将步骤（2）蘸取过的核酸吸附棒在漂洗液中蘸取。进一步地，在所述步骤（1）接触之后还可以对样品-样品处理试剂混合物进行热处理，热处理的温度为60℃-100℃，时间为1分钟-3分钟；优选为65℃水浴1分钟。例如，吸取0.1-0.2ml样本，加入到1ml的核酸提取试剂中，反复吹打多次，盖上盖子，65℃水浴1分钟；用核酸吸附棒在上一步骤的离心管中上下蘸取3次，然后在漂洗液中蘸取3次。将漂洗过的纤维素核酸吸附棒加入到重组酶扩增反应体系中蘸取3次即可进行后续扩增反应。

本发明提供的核酸提取试剂，其中的离子型表面活性剂甲硅烷基化的季铵化合物(SiQAC)能够使蛋白质变性，在65℃下水浴1分钟能够破坏病毒颗粒的外壳蛋白结构，和革兰氏阴性菌和一些革兰氏阳性菌的细胞膜结构，使其中的核酸释放。离子型表面活性剂对低温扩增反应酶有抑制作用，这就需要加入适宜浓度的（0.1%-10%）吐温-20、Trixon X-100或者它们的混合剂，以抵消这种抑制作用，虽然这种抑制作用不能完全被吐温-20、TrixonX-100或者它们的混合剂抵消，但是再经过漂洗液漂洗之后，重组酶扩增反应体系中的离子表面活性剂不再对体系有抑制作用。另一方面，本发明还提供了上述试剂或方法在基于重组酶聚合酶低温核酸扩增技术中的应用，所述重组酶聚合酶低温核酸扩增技术为RPA技术。所述低温，是指核酸扩增反应发生在45℃以下，优选为37-42℃。

本发明的有益效果：本发明提供的核酸提取试剂实现了在室外快速提取多种样品核酸的目的，可以完全脱离实验室设备，结合低温核酸扩增技术能够形成一套家用或现场进行基因检测的方法。使用该试剂进行核酸提取操作简便，成本低廉。而且其提取获得的核酸样本对后续扩增反应没有抑制作用。

附图说明

图1为本发明核酸提取试剂和细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取志贺氏菌核酸检测对比

图2为本发明核酸提取试剂和动物基因组DNA快速抽提试剂盒提取牛线粒体DNA检测对比

图3为本发明核酸提取试剂和其它快速释放核酸方法提取对虾白斑综合症病毒orf234基因检测对比

图4为本发明核酸提取试剂和传统柱式方法提取人体口腔细胞DNA检测对比

图5为本发明核酸提取试剂与传统方法提取核酸质量对比实验

具体实施方式：

本发明实施例公开了一种快速提取核酸的试剂及应用该试剂提取核酸的方法及试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明的范围内。本发明的方法及试剂盒已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。但是，以下实施例仅仅是例证，本发明并不局限于这些实施例。

实施案例一：致病微生物-志贺氏菌核酸提取及检测

通过对致病微生物病源志贺氏菌进行恒温扩增检测，对本发明提供的试剂和市售基因组提取试剂盒的核酸提取效果进行比较。分别吸取5ul志贺氏菌菌液样品，加入到2支1.5mL离心管中，并命名为SF-1、SF-2。

（1）核酸快速提取方法：使用本发明的提取试剂

取SF-1号离心管，向离心管中加入200ul核酸提取试剂，置于65℃水浴1min，放置-20℃备用。

核酸提取试剂配制如下：在灭菌去离子水中加入3-( 三甲氧基甲硅烷基) 丙基二甲基十八烷基氯化铵，使其终浓度为1mM，再加入Triton X-100，使其浓度为1%（%为质量体积比），而后缓慢加入NaOH，浓度为0.05mol/L，溶液的pH值为12.6。

（2）细菌基因组DNA抽提试剂盒：使用商业化提取试剂

取SF-2号离心管，采用细菌基因组DNA抽提试剂盒进行核酸提取，具体参数参照细菌基因组DNA快速抽提试剂盒的说明书（ThermoFisher 货号：A29790）进行核酸提取纯化。包括以下步骤：

a 取SF-2号离心管，室温14000 rpm离心10 min，弃上清，收集菌体。加入800ul S1，震荡混匀，将样本全部转移到珠管中。

b 加入100ul S2,充分颠倒混匀,65℃水浴10min。

C 取出珠管，充分震荡混匀10min，14000 rpm离心2min。

d 将上清液全部转移至新的离心管中，加入900ul S4，混匀。然后将全部溶液和沉淀物转移至吸附柱内（吸附柱放入收集管中），14000 rpm 离心1 min，倒掉收集管中溶液，将吸附柱放回收集管中。

e 加入500ul S5，10000 rpm 离心1 min，倒掉收集管中溶液。

f 将吸附柱放回收集管中，14000 rpm 离心30 sec。

g 取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入100ul S6，室温静置1min，14000 rpm 离心1 min。

h 得到的DNA溶液置于-20℃保存备用。

本实施例通过对志贺氏菌基因片段进行重组酶聚合酶扩增的检测，对本发明提供的试剂和商业化提取试剂的核酸提取效果进行比较，志贺氏菌基因片段的引物序列如下：

上游引物序列：

5’-GGATAAAGTCAGAACTCTCCATTTTGTGG-3’（SEQ ID No 1）

下游引物序列：

5’-GCTTCGGCAGTGCGGAGGTCATTTGCTGTCAC-3’（SEQ ID No 2）

用本发明中的核酸吸附棒分别蘸取核酸快速释放方法获得的样本处理液和传统离心柱方法获得的核酸进行重组酶聚合酶扩增反应体系的配制，涡旋震荡混匀。重组酶聚合酶扩增反应体系如下：

50mM 三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液 pH8.0

80mM醋酸钾

10mM 醋酸镁

2mM 二硫苏糖醇

5% 聚乙二醇（分子量2000-20000）

3mM ATP

20mM 磷酸肌酸

80ng/ul 肌酸激酶

500ng/ul GP32蛋白

150ng/ul uvsX重组酶

60ng/ul uvsY重组蛋白因子

8Units Klenow聚合酶大片段（exo-）

400uM dNTP

300nM 每条上下游引物

10ng DNA 模板

1x Sybr green I

按上述体系配制，涡旋震荡混匀，于恒温荧光扩增仪进行检测荧光的变化值，扩增温度为37℃，反应20min，每30s读取一次荧光。

结果分析：

如附图1，应用细菌基因组DNA抽提试剂盒提取DNA样本，并进行恒温荧光扩增，从扩增曲线上看，该方法提取检测的扩增曲线指数区域明显。

应用本发明核酸快速释放法进行样本处理，并进行恒温荧光扩增，从扩增曲线上看，指数区域较明显，有明显的指数增长期,起峰时间上与细菌基因组DNA抽提试剂盒很相近。

实施案例二：基因组检测，牛基因组DNA

肉源性成分检测可以通过对动物组织、血液及食品、肉类制品中的DNA成分进行检测，本实施例通过对牛肉基因组中的ATP片段进行恒温扩增检测，对本发明提供的试剂和动物基因组DNA快速抽提试剂盒法提取效果进行对比。各取20mg的牛肉加入到2支离心管中，命名为Bs-1、Bs-2。

（1）核酸快速提取方法：使用本发明的提取试剂

取Bs-1号离心管，向离心管中加入200ul核酸提取试剂，置于65℃水浴1min，放置-20℃备用。

核酸提取试剂配制如下：在灭菌去离子水中加入3-( 三甲氧基甲硅烷基) 丙基二甲基十八烷基氯化铵，使其终浓度为0.4mM，再加入Triton X-100，使其浓度为5%（%为质量体积比），而后缓慢加入NaOH，浓度为0.25mol/L，溶液的pH值为13.3。

（2）动物基因组DNA抽提试剂盒：使用商业化提取试剂

取Bos-2号离心管，采用动物基因组DNA抽提试剂盒进行核酸提取，具体参数参照动物基因组DNA抽提试剂盒的说明书（ThermoFisher 货号：K182000）进行核酸提取纯化。包括以下步骤：

a 向Bs-2号离心管加入180ul Digestion Buffer ,再加入20ul Proteinase K溶液，震荡混匀。55℃水浴1h至细胞完全裂解。

b 室温12000 rpm 离心3 min，将上清液全部转移至新的离心管中，加入20ul RNA酶A，充分混匀，室温静置2min。

c 向离心管中加入200ul Lysis/Binding Buffer，充分混匀，再加入200ul无水乙醇，震荡混匀5sec

d 然后将全部溶液和沉淀物转移至吸附柱内（吸附柱放入收集管中），10000 rpm离心1 min，倒掉收集管中溶液，将吸附柱放回收集管中。

e 向吸附柱中加入500ul Wash Buffer 1，10000 rpm 离心1 min，倒掉收集管中的溶液，将吸附柱放回收集管中。

f 向吸附柱中加入500ul Wash Buffer 2，14000 rpm 离心3 min，倒掉收集管中的溶液。

g 取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入50ul Elution Buffer，静置1min，14000 rpm 离心1min。

h 得到的DNA溶液置于-20℃保存备用。

本实施例通过对牛线粒体基因片段进行重组酶聚合酶扩增的检测，对本发明提供的试剂和商业化提取试剂的核酸提取效果进行比较，牛线粒体基因片段的引物序列如下：

上游引物序列：

5’-CAACAGGAATCTCCTCAGACGTAGA-3’（SEQ ID No 3）

下游引物序列：

5’-GCTAGAATTAGTAAGAGGGCCCCTAA-3’（SEQ ID No 4）

用本发明中的核酸吸附棒蘸取核酸快速释放法获得的样本处理液经过漂洗后加入重组酶扩增反应液；与此同时吸取1ul抽提试剂盒获得的核酸进行重组酶聚合酶扩增反应体系的配制，涡旋震荡混匀，于恒温荧光扩增仪进行检测荧光的变化值，扩增温度为37℃，反应20min，每30s读取一次荧光，重组酶聚合酶扩增反应体系按实施案例一进行。

结果分析：

如附图2，应用动物基因组DNA抽提试剂盒和本发明核酸快速释放法提取得到的DNA样本，进行恒温荧光扩增，从扩增曲线上看，两者的扩增曲线指数区域较为明显，出峰时间上也很相近。

实施案例三：对虾白斑综合症病原体wssv病毒核酸提取及检测

通过对病虾组织感染wssv病毒进行恒温扩增检测，对本发明提供的试剂和DNA-EZReagent V试剂盒的核酸释放效果进行比较。分别吸取10ul病虾肝胰腺样品，加到2支1.5mL离心管中，并命名为Ws-1、Ws-2。

（1）核酸快速提取方法：使用本发明的提取试剂

取Ws-1号离心管，向离心管中加入200ul核酸提取试剂，置于65℃水浴1min，放置-20℃备用。

核酸提取试剂配制如下：在灭菌去离子水中加入3-( 三甲氧基甲硅烷基) 丙基二甲基十八烷基氯化铵，使其终浓度为0.7mM，再加入吐温-20，使其浓度为10%（%为质量体积比），而后缓慢加入NaOH，浓度为0.5mol/L，溶液的pH值为13.6。

（2）DNA-EZ Reagent V试剂盒：使用商业化提取试剂（生工生物工程（上海）有限公司货号：B642315）

a 取Ws-2号离心管，加入50ulDNA提取液。

b 80℃加热5min。

c 简短震荡混匀后取裂解物直接进行恒温荧光检测。

本实施例通过对对虾wssv病毒基因片段进行重组酶聚合酶扩增的检测，对本发明提供的试剂和商业化提取试剂的核酸提取效果进行比较，wssv病毒基因片段的引物序列如下：

5’-CCAGAGATGGGAGTAACACGT-3’（SEQ ID No 5）

下游引物序列：

5’-CTCCTCTGTTGCGAATACTTCTAAAT-3’（SEQ ID No 6）

用本发明中的核酸吸附棒蘸取核酸快速释放法获得的样本处理液经过漂洗后加入重组酶扩增反应液；与此同时吸取1ul使用DNA-EZ Reagent V试剂盒提取的核酸进行重组酶聚合酶扩增反应体系的配制，涡旋震荡混匀，于恒温荧光扩增仪进行检测荧光的变化值，扩增温度为37℃，反应20min，每30s读取一次荧光，重组酶聚合酶扩增反应体系按实施案例一进行。

结果分析：

如附图3，应用DNA-EZ Reagent V试剂盒提取wssv样本，并进行恒温荧光扩增，从扩增曲线上看，通用一步法提取检测的扩增曲线指数区域较不明显，间接表明该试剂中有对重组酶聚合酶反应体系抑制的成分。

应用本发明核酸快速释放法进行样本处理，并进行恒温荧光扩增，从扩增曲线上看，有明显的指数增长期，且检测时间较短。

实施例四：口腔拭子，人基因组DNA

本实施案例检测刮取的口腔细胞样本，分别置于1.5mL离心管中，并命名为Hs-1、Hs-2。

（1）核酸快速释放方法

取Hs-1号离心管，向离心管中加入200 ul核酸释放剂，置于65℃水浴1min，放置-20℃备用。

核酸提取试剂配制如下：在灭菌去离子水中加入3-( 三甲氧基甲硅烷基) 丙基二甲基十八烷基氯化铵，使其终浓度为0.2mM，再加入Triton X-100，使其浓度为5%（%为质量体积比），而后缓慢加入NaOH，浓度为0.1mol/L，溶液的pH值为13。

（2）Zou Y文章中所提的核酸快速释放方法

取Hs-2号离心管，加入200 ul裂解液和2颗6mm的钢珠，上下剧烈震荡8秒，所得的裂解物用于后续的重组酶聚合酶扩增的检测。

本实施例通过对口腔拭子中人体基因片段进行重组酶聚合酶扩增的检测，对本发明提供的试剂和上述文章中介绍的核酸提取效果进行比较，人体基因组片段的引物和探针序列如下：

上游引物序列：

5’-TGCAAATACATCTTTGTTCTTGGGAGCGGGAGG-3’（SEQ ID No 7）

下游引物序列：

5’-GGACTTGCTCTTCAGGTAGAAGAGGTAGTAGT-3’（SEQ ID No 8）

探针序列：

5’-GGGGCAGAATTTACAGGAATGGCCTCC(dT-fam)GG[thf]CA(dT-bhq1)

GTGGTGGCACTGC(C3-block)-3’（SEQ ID No 9）

用本发明中的核酸吸附棒蘸取核酸快速释放法获得的样本处理液经过漂洗后加入重组酶扩增反应液；与此同时用8 mm²的纤维素纸条蘸取针对口腔上表皮细胞释放的DNA样本3秒，在漂洗液中漂洗3秒，将纸片浸入重组酶扩增反应液三次后即可进行反应。重组酶聚合酶扩增（结合核酸外切酶III）反应体系如下：

30mM 三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液 pH7.8

100mM醋酸钾

14mM 醋酸镁

3mM 二硫苏糖醇

5% 聚乙二醇（分子量2000-20000）

2mM ATP

20mM 磷酸肌酸

100ng/ul 肌酸激酶

400ng/ul 大肠杆菌recA蛋白

200ng/ul 大肠杆菌SSB蛋白

60ng/ul 大肠杆菌recO蛋白

40ng/ul 大肠杆菌recR蛋白

60ng/ul 大肠杆菌recF蛋白

20ng/ul Bsu DNA聚合酶

50ng/ul 核酸外切酶III

400uM dNTP

300nM 每条上下游引物

10ng DNA 模板

80nM 荧光探针

按上述体系配制，涡旋震荡混匀，于恒温荧光扩增仪进行检测荧光的变化值，扩增温度为37℃，反应20min，每30s读取一次荧光。

结果分析：

如附图4，应用Zou Y文章中所提的核酸快速释放方法提取的口腔DNA样本，并进行恒温荧光扩增，没有出现明显的扩增曲线，而是出现一条与基线平行的水平线，间接表明反应体系中没有进行恒温扩增。

应用本发明核酸快速释放法进行样本处理，并进行恒温荧光扩增，从扩增曲线上看，基线平整，有明显的指数增长期和平台期。

实施案例五：快速释放核酸法以及对比实验

为了检测本发明和商业化提取试剂释放的DNA含量，将核酸释放法和柱式法口腔拭子基因组DNA试剂盒抽提得到的DNA用TE Buffer进行梯度稀释10倍、100倍、1000倍，加以验证。

模板处理：

本实施案例检测刮取的口腔细胞样本，分别置于1.5mL离心管中，并命名为Hp-1、Hp-2。

（1）核酸快速释放方法

取Hp-1号离心管，向离心管中加入200ul核酸释放剂，置于65℃水浴1min，吸取5ul裂解物加入45ul TE Buffer稀释成10倍，以此类推稀释100倍、1000倍，放置-20℃备用。

核酸提取试剂配制如下：在灭菌去离子水中加入3-( 三甲氧基甲硅烷基) 丙基二甲基十八烷基氯化铵，使其终浓度为0.2mM，再加入吐温-20或Trixon X-100或它们的混合物，使其浓度为5%（%为质量体积比），而后缓慢加入NaOH，浓度为0.1mol/L，溶液的pH值为13。

（2）传统离心柱方法

取Hp-2号离心管，采用离心柱方法进行核酸提取，具体参数参照柱式法口腔拭子基因组DNA试剂盒（生工生物工程（上海）有限公司货号：B518268）的说明书进行核酸提取纯化，此方法进行DNA洗脱时加入200ul TE Buffer。吸取5ul基因组DNA加入45ul TE Buffer稀释成10倍，以此类推稀释100倍、1000倍，放置-20℃备用。

分别吸取1ul上述稀释3个梯度的6个模板进行重组酶聚合酶扩增反应体系的配制，涡旋震荡混匀，于恒温荧光扩增仪进行检测荧光的变化值，扩增温度为37℃，反应20min，每30s读取一次荧光。

在核酸定量技术中，会应用荧光定量PCR技术进行检测，通过对Ct值得分析来确定核酸的含量。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系[Russell HiguchiKinetic PCR Analysis: real-time monitoring of DNA amplificationreactions.Nature Biotechnoligy，1993，11（9）：1026-1030]，起始模板拷贝数越多，Ct值越小，起峰的时间越早。

结果分析：

如附图5，本发明核酸快速释放法与商业化提取试剂盒相比，两者都有明显的扩增曲线且前者的荧光差值要大于后者，前者起峰时间要稍早于后者，实验结果说明，本发明的核酸释放法要优于商业化提取试剂盒。

参考文献

[1] Md Mahbubor Rahman and Abdelhamid Elaissari.Nucleic acid samplepreparation for in vitro molecular diagnosis: from conventional techniques tobiotechnology. Drug Discovery Today Volume 17, Numbers 21/22 , November 2012.

[2] David S. Boyle,Dara A. Lehman,Lorraine Lillis,Dylan Peterson,etal. Rapid Detection of HIV-1 Proviral DNA for Early Infant Diagnosis usingRecombinase Polymerase Amplification. Research Article 2013,4(2):e00135

[3] Camila Gonçalves Athanasio, James K. Chipman, Mark R. Viant andLeda Mirbahai. Optimisation of DNA extraction from the crustaceanDaphnia.PeerJ 2016, 4:e2004.

[4] Yalcınkaya, B., et al. Comparison of DNA extraction methods formeat analysis. Food Chemistry 2016.

[5] A. A. Krinitsina,T. V. Sizova, M. A. Zaika,A. S. Speranskaya andA. P. Sukhorukov. A Rapid and Cost-Effective Method for DNA Extraction fromArchival Herbarium Specimens.Biochemistry 2015,80（11）：1478-1484.

[6] R Sepp, I Szabo, H Uda, H Sakamoto. Rapid techniques for DNAextraction fromroutinely processed archival tissue for use in PCR.Clin Pathol1994,47:318-3.

[7] Walsh PS, Metzger DA, Higuchi R. Chelex 100 as a medium forsimple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material.Biotechniques 1991,10:506–513.

[8] Kwon HwangBo,Su Hyun Son,Jong Suk Lee. Rapid and simple methodfor DNA extraction from plant and algal species suitable for PCRamplification using a chelating resin Chelex 100 .Plant Biotechnol Rep 2010,4:49–52.

序列表

SEQ ID No 1：

5’-GGATAAAGTCAGAACTCTCCATTTTGTGG-3’

SEQ ID No 2：

5’-GCTTCGGCAGTGCGGAGGTCATTTGCTGTCAC-3’

SEQ ID No 3：

5’-CAACAGGAATCTCCTCAGACGTAGA-3’

SEQ ID No 4：

5’-GCTAGAATTAGTAAGAGGGCCCCTAA-3’:

SEQ ID No 5：

5’-CCAGAGATGGGAGTAACACGT-3’

SEQ ID No 6：

5’-CTCCTCTGTTGCGAATACTTCTAAAT-3’

SEQ ID No 7：

5’-TGCAAATACATCTTTGTTCTTGGGAGCGGGAGG-3’

SEQ ID No 8：

5’-GGACTTGCTCTTCAGGTAGAAGAGGTAGTAGT-3’

SEQ ID No 9：

5’-GGGGCAGAATTTACAGGAATGGCCTCC(dT-fam)GG[thf]CA(dT-bhq1)

GTGGTGGCACTGC(C3-block)-3’。

序列表

<110> 苏州先达基因科技有限公司

<120> 一种新的核酸提取试剂及其应用

<130> 2018002

<160> 0

<170> SIPOSequenceListing 1.0

Claims (11)

1.一种用于核酸提取的样品处理试剂，其特征在于由如下三种成分组成：终浓度为0.2mM-0.7mM的3-（三甲氧基甲硅烷基）丙基二甲基十八烷基氯化铵；终浓度为10%的吐温-20或终浓度为1%-5%的Triton X-100；终浓度为0.05mol/L的NaOH。

2.一种核酸提取试剂，其特征在于包含权利要求1所述的样品处理试剂，核酸吸附棒和漂洗液。

3.权利要求2所述的核酸提取试剂，其特征在于所述核酸吸附棒的基质材料为介质表面存在游离羟基的材料。

4.权利要求3所述的核酸提取试剂，其特征在于所述介质表面存在游离羟基的材料为纤维素材料。

5.权利要求4所述的核酸提取试剂，其特征在于所述纤维素材料为纤维素滤纸。

6.权利要求2至5任一项所述的核酸提取试剂，其特征在于所述漂洗液选自5mM-50mM的TRIS-Ac盐类缓冲液、PBS或TE，pH介于6.5-9.0之间。

7.一种提取样品中核酸的方法，包括如下步骤：（1）将样品与权利要求1所述的样品处理试剂接触；（2）用核酸吸附棒在步骤（1）的离心管中蘸取；（3）将步骤（2）蘸取后的核酸吸附棒在漂洗液中蘸取。

8.权利要求7所述的提取样品中核酸的方法，其特征在于在所述步骤（1）接触之后对样品-样品处理试剂混合物进行热处理，热处理的温度为60℃-100℃，时间为1-3分钟。

9.权利要求8所述的提取样品中核酸的方法，其特征在于热处理为65℃水浴1分钟。

10.权利要求7至9任一项所述的提取样品中核酸的方法，其特征在于待检样品与样品处理试剂的体积比为1:1-1:10。

11.权利要求1-10任一项所述的试剂或方法在基于重组酶聚合酶低温核酸扩增技术中的应用，其特征在于利用大肠杆菌重组RecA或T4 uvsX、单链结合蛋白、聚合酶介导的重组扩增反应。

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