JPH03133379A - タンパク質分解酵素を用いない核酸の抽出およびｐｃｒ増幅方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は細胞物質またはビリオン物質から核酸を抽出す
るための迅速かつ有効な方法に関する。

また、こうして抽出された核酸を増幅または検出するた
めの方法にも関する。従って、これらの方法は診断の目
的に使用することができる。

〔従来の技術〕

生物学的な診断、検査および分析操作の技術分野では、
生物学的な被検体、例えば全血またはそれらの両分に由
来する核酸の調査が必要である。

このような試験管内操作は、第一段階として核酸の単離
が必要である。例えば、遺伝疾患の試験を行うためには
相当純粋なゲノムＤＮＡ試料が必要であり、組み換え技
術にはベクターＤＮＡおよびクローン化せしめるＤＮＡ
の両方を単離することが必要である。感染体、例えば細
菌性およびウィルス性感染細胞の検出におけるＤＮＡ診
断操作は、一般に、細胞溶解次いで放出ＤＮＡの検出が
必要である。

一般的に、細胞中でＤＮＡは遊離の分子として存在しな
いで、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質の複雑な会合物
として存在する。これは、遺伝情報の担体としてＤＮＡ
が果す役割の結果であり、機能上ＲＮＡと各種タンパク
質とのその掛かわりの結果である。

被検体中におけるＤＮＡと他の物質の複雑な会合物のた
め、効果的な抽出には、ＤＮＡが破壊された細胞壁およ
び細胞膜から放出され、ＤＮＡタンパク質複合体が変性
またはタンパク質分解によって分離され、次いでＤＮＡ
が他の巨大分子から分離されることが必要である。１以
上のこれらの結果を達成するために種々の手段が当該技
術分野で使用されている。例えば、細胞溶解は凍結解凍
、超音波手段、剪断作用および他のｂ！１械的な技法に
よるか、あるいは酵素、界面活性剤またはキレート化剤
で処理することにより行うことができる。プロテアーゼ
および他の加水分解性剤を使用してタンパク質からＤＮ
Ａを分離することができる。残存タンパク質や他の巨大
分子は各種溶媒、ｇ７ＩＪえばフェノールまたは他のア
ルコール類を使用して抽出することかできる。

幾つかのＤＮＡ単離法は、例えば、ヨーロッパ特許公開
第１．４５３５６号、同２４０１９１号および同２４５
９４５号公報に記載されており、これらのすべては一連
の特定の工程でアルコールおよび酵素的タンパク質分解
剤を使用する。一般に、これらの繰作はウィルスＤＮＡ
の抽出に向けられており、すべての利用可能なりＮＡを
得るには精密に実施しなければならない数多くの複雑な
工程を伴う。従って、既知方法の多くは労働集約的であ
り、望ましくない溶媒の使用が必要であるため簡単には
自動化できない。

興味の対象となる核酸の単離または抽出は、ポリメラー
ゼ連鎖反応を用いる核酸の増幅および検出に関して最近
開発された方法の利点を取り入れることが必要である。

米国特許第４．６８３，１９５号および同４，６８３，
２０２号明細書は、ポリメラーゼを用いる様々な生物学
的被検体に見い出される核酸に対する有用な増幅および
検出方法を記載する。標準的な核酸抽出方法は、Ｍａｎ
ｉａｔｉｓらの、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　
：八Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　　Ｍａｎｕａｌ　（Ｎｅｗ　
Ｙｏｒｋ　：　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　　１９８２）　　、　　２
８０〜２８１ページを引例として挙げる。この引例は、
溶解細胞に対するプロテアーゼの使用およびフェノール
／クロロホルム抽出を含む標準的な抽出方法に向けられ
ており、一般に、その全操作を行うには多くの時間がか
かり、そして危険な有機溶媒の使用を要する。また、Ｎ
ｕｎｂｅｒｇらのＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃ
ｉ。

竪Ａ、　７５　（１１）、　５５５３〜５５５６ページ
（１９７８）によればハムスター卵巣細胞がら、５ａｉ
ｋｉ　らのＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ　ｙ、　３．１．
００８−１．０１２ヘージ＜１９８５）ニ、Ｊ：　しば
全血液被検体の軟層から、そしてＢｅ１ｌらのＰｒｏｃ
　。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓΔ、　７８　（９）
、　５７５９〜５７６３ページ＜１９８１）によれば全
血からＤＮＡを抽出するのに前記方法が使用されている
。

診断試験を商業的に実施可能ならしめるには、それが経
済的な競争性を有することも必要である。

このことは、操作の全態様が単純で、使用が容易で、か
つある程度自動化されねばならないことを意味する。被
検体からＤＮＡの抽出は、その被検体から最大限のＤＮ
Ａを得と同時に経済的な利益を上げるために入念な開発
が必要な態様の１つである。さらに、診断結果が急いで
必要な場合には、抽出操作を迅速にしなければならない
。

従って、前述の冗長で時間のかかる工程および有機溶媒
の使用を回避する改良された抽出方法を開発するのに相
当な精力が注がれてきた。かくして、ＫｏｇａｎらのＮ
、ＥｎＨ，Ｊ、Ｍｅｄ、　、３１又（１６）、　９８５
〜９９０ページ（１９８７）は、遠心によって全血から
取り出された細胞を煮沸することによる遺伝疾患を検出
するためのＤＮＡ抽出を記載する。この抽出されたＤＮ
Ａは、その後増幅にかけられる。

同様に、５ａｉｋｉらのＮａｔｕｒｅ、　３２４．１６
：３−１６６ページ（１９８６）は、β−グロビンを増
幅するのに全血の緩衝化軟層（末梢血単核細胞および顆
粒球を含む）の煮沸を記載する。類似の仕事は、鎌状赤
血球およびＩＩＬＡ　　ＤＮＡの検出に関するヨーロッ
パ特許公開第２３７３６２号公報に示されている。ある
場合には、軟層の細胞は鉱油で被覆された後、加熱工程
にかけられる。

これらの操作では、前述した危険なフェノール／クロロ
ホルム抽出を避け、そして迅速（２，３分で行われる）
であるが、ＨＬＡまたはβ−グロビンＤＮＡのような全
血試料中に多量存在するＤＮＡ抽出に対して非常に有用
であるにすぎない。

目的のＤＮＡが多くの感染体（例えば、ウィルス）の存
在する場合のごとき非常に少量で存在するときは、全血
または軟層画分からの抽出にさらなる改良が高感度検出
にとって必要である。さらに、増幅前に全血から除去す
ることが必要なポリメラーゼ活性に対する妨害物も多く
存在する。

最近の技術革新は平成２年４月１６日出願の特願平２−
９７７８９号明細書に記載されている。これらの出願は
、ＤＮＡの抽出のための全血またはそれらの末梢血単核
細胞画分（ＰＢＭＣ）の煮沸に向けられている。このよ
うな操作は被検体からＤＮＡを抽出することが見い出さ
れているが、感度のさらなる改良が必要である。

さらに、当該技術分野における他の最近の進歩は、非イ
オン溶解性洗剤およびタンパク質分解酵素（例えば、プ
ロティナーゼＫ）の使用を必要とする。この方法の基本
的な利点の１つは、ＤＮＡ抽ＰＣＲＵｓｅｒｓ、　２号
、１および３ページ、５月（１９８９）に記載されてい
る。

〔発明が解決しようとする課題〕

この改良は当該技術分野で広く受は入れられているが、
特にＤＮＡが被検体中で非常に低濃度で存在する場合に
は、さらにＤＮＡ抽出操作を簡略化することが依然と必
要である。就中、終了まで１または２時間を必要としな
いような核酸の迅速かつ効果的な抽出方法の必要性が存
在する。従って、相当短縮化されそして簡略化された試
料調製方法がほとんどの診断状況にとって必要である。

〔課題を解決するための手段〕

従来技術の抽出操作が包含する課題は、Ａ、タンパク質
分解酵素の不存在下で、１種以上の核酸を含有する細胞
またはビリオン試料を、（１）　ｐＨ４〜１０に下記溶
解性組成物を維持する有機緩衝剤、 （２）ＤＮＡポリメラーゼ活性に対する触媒量の補因子
源、 （３）安定化剤、 （４）前記細胞またはビリオンから核酸を放出するのに
十分量で存在する少なくとも１種の適合性非イオン界面
活性剤、 を含んでなる溶解性組成物と混合する工程、Ｂ、得られ
る混合物を５〜１５分間水の沸点またはその付近で加熱
する工程、ならびに Ｃ９その加熱された混合物から核酸を回収する工程、を
含んでなる細胞またはビリオンから核酸の迅速抽出方法
によって解決される。

この発明はまた、次の各工程を含んでなるポリメラーゼ
連鎖反応を用いる核酸の増幅方法をも提供する。

■、Ａ、タンパク質分解酵素の不存在下で、１種以上の
核酸を含有する細胞またはビリオン試料を、（１）　ｐ
Ｈ４〜１０に下記組成物を維持する有ＩＲ緩衝剤、 （２）ＤＮＡポリメラーゼ活性に対する触媒量の補因子
源、 （３）安定化剤、 （４）前記細胞またはビリオンから核酸を放出するのに
十分量で存在する適合性非イオン界面活性剤、 を含んでなる溶解性組成物と混合する工程、Ｂ、得られ
る混合物を５〜１５分間水の沸点またはその付近で加熱
する工程、ならびに Ｃ１その加熱された混合物から核酸を抽出する工程を必
須のものとして構成される抽出操作、ならびに ■　こうして回収された核酸をポリメラーゼ連鎖反応を
用いて増幅する工程。

以下、本発明を具体的に説明する。

本発明は、いずれかの起源（ヒト、動物もしくは植物組
織または流体）に由来する細胞そのもの、ビリオンまた
はそれらの成分を含有するいずれかの被検体から１種以
上の核酸の抽出または増幅に向けられる。好ましくは、
全血またはその成分が核酸源である。本発明の主目的は
診断にあるとはいえ、抽出された核酸は各種の検査、医
学的研究分野でＤＮＡ、ｔたはメツセンジャーＲＮＡの
クローニングあるいはゲノムＤＮＡの配列決定にも使用
することができる。抽出された核酸の他の用途は当業者
に自明であろう。

核酸は、ゲノムＤＮＡあるいは細菌、ウィルスまたは酵
母などの感染体によって細胞または体液中で発生するＤ
ＮＡであることができる。核酸を含有する試料は、新鮮
な患者の試料、新鮮もしくは凍結細胞ベレットであるこ
とができ、あるいはいずれか他の適当な状態で提供され
うる。処理される被検体が全血である場合、一般に、抽
出される核酸はゲノムＤＮＡである。しかしながらこの
発明は、感染体（はとんどは、ヘルペス、サイトメガロ
ウィルス、エプスタイン−バールウィルス、ならびニＨ
ＩＶ−１、ＨＩＶ−ＩＩ　オよびＩＩＴＬＶ−１ノヨう
なレトロウィルスなどのウィルス）に侵された細胞に由
来するＤＮＡの抽出および検出にとって特に有用である
。好ましくは、サイトメガロウィルス、エプスタイン−
パールウィルスおよびＨＩＶウィルスのＤＮＡが本発明
によって抽出されそして検出されるが、＋＋ｒｖ−ｒウ
ィルスのＤＮＡの抽出および検出が最も興味深いもので
ある。

核酸源でありうる全血のある成分は、末梢血単核細胞画
分（ＰＢＭＣ）である。これは、標準的な操作を用いる
遠心によって全血からフィコール・パキ１　（Ｆｉｃｏ
ｌｌ−Ｐａｑｕｅ、商標）　（Ｐｂａｒｍａｃｉａ　ｆ
ｎｃ、。

ＰｉｓｃａｔａＬＩＩａｙ、　Ｎ、Ｊ、）のクツション
上に得られる。

それは単球とリンパ球からなるものと信じられている。

細胞またはビリオン含有試料は、それらの細胞またはウ
ィルス粒子の溶解を促進する温度で溶解組成物と混合さ
れる。一般に、この温度は１５〜３０℃であり、室温が
最も有用である。

この発明の方法ではタンパク質分解酵素がまったく使用
されないことに特徴がある。このような酵素は、タンパ
ク質の加水分解を触媒するいずれかの酵素または酵素調
製品として米国特許出願第１７８．２０２号に概述され
ている。

この溶解組成物は、ｐＨ４〜１０、好ましくはｐＨ７〜
９を維持する１種以上の有機！ｆＦｒ剤を含む。限定さ
れるものでないが、有用な１４１剤としては、３−（Ｎ
−モルホリノ）プロパンスルホン酸、３−（Ｎ−モルホ
リノ）エタンスルホン酸、トリシン、グリシン、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよび当業者に自明
の他の［剤が挙げられる。

好ましくは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
が使用される。使用される緩衝剤量は、ｐＫａに依存し
そして目的のｐＨを維持するに必要な量である。一般に
、１〜１００ミリモル濃度で存在する。

ＤＮＡポリメラーゼに対する補因子源もまた本発明の組
成物に含められる。有用な補因子は、殻的に金属イオン
、例えばマグネシウムイオンおよびマンガンイオンであ
る。それらは遊離イオンとして、または塩化マグネシウ
ム、酢酸マグネシウム、臭化マグネシウム、硫酸マグネ
シウム、塩化マンガン、臭化マンガンもしくは当業者に
自明の他の塩として供給することができる。含まれる補
因子量は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を効果的に発揮する
のに必要な量である触媒量で存在する限り、増幅に使用
される他の試薬、例えば、ポリメラーゼ、ブライマーお
よび当業者にとって自明の他の考慮されるものによって
変動可能である。−般的にこの量は少なくとも０．５ミ
リモル濃度、好ましくは１〜２０ミリモル濃度である。

マグネシウムイオンは塩化マグネシウムの状態にあるの
が好ましい。

安定化剤もまたこの組成物に含められる。この剤はバイ
ンダー物質とも考えることができる。それは１種以上の
合成または天然の水溶性または水分散性高分子物貰、例
えば、抽出された核酸と複合化しないタンパク質、ゼラ
チンもしくはその誘導体、セルロースもしくはその誘導
体、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールお
よび当業者に自明の他のものであることができる。この
安定化剤は、一般に、組成物１ｍ１当たり０．１〜１０
Ｂの量で存在する。

溶解組成物は、試験検体中の細胞またはウィルス粒子の
細胞質膜または核膜から核酸を放出するのに十分量で存
在する１種以上の適合性非イオン界面活性剤を含む。「
適合性」とは、抽出される核酸や溶解組成物中で使用さ
れる他の材料のいずれにも界面活性剤が悪影響を及ぼさ
ないことを意味する。

この組成物で使用できる各種の界面活性剤が存在し、限
定されるものでないがこれらとしてポリオキシエチレン
ソルビタン誘導体、ポリオキシエチレンエーテル類、ポ
リグリコールエーテル類、ポリフルオロアルキルポリオ
キシエチレン類、フッ化アルキルアルコキシレート類お
よびフッ化アルキルエーテル化合物類が挙げられる。界
面活性剤の他の有用な種やこれらの具体例は、当業者に
自明であろうが、特に界面活性剤に対する標準的匹遵ｍ
Ｅ剰、ｓ　１９８６．　　（Ｎｏｒｔｈ　Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ　Ｅｄｉｔｉｏｎ。

ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ　　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　　Ｐｕｂ
ｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、　　Ｇｌｅｎ　　ＲｏｃｋＮ
Ｊ）を参照すればなおさら自明となろう。

限定されるものでないが、代表的なポリオキシエチレン
ソルビタン誘導体としては、ポリオキシエチレン（２０
）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ（商標）２０
として販売されている〕、ポリオキシエチレン（４）ソ
ルビタンモノラウレー）　（Ｔｗｅｅｎ（商標）２１と
して販売されている〕、ポリオキシエチレン（２０）ン
ルビタンモノバルミテー）　ＣＴｗｅｅｎ（商標）４０
として販売されている〕およびポリオキシエチレンク２
０）ソルビタンモノステアレート（Ｔｗｅｅｎ（商標）
６０として販売されている〕ならびにその他ＩＣＩ　Ａ
ｍｅｒｉｃａｓ、　Ｉｎｃ、によって商標Ｔｗｅｅｎの
下で販売されているものが挙げられる。

代表的なポリグリコールエーテル類としては、限定され
るものでないが、ＴｃｒＨｉｔｏｌ（商標）非イオン界
面活性剤〔例えば、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商？”）ＮＰＸ
およびＴｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＮＰ−７など〕として
ＩＪｎｉｏｎ　Ｃａｒｂｉｄｅから販売されているもの
が挙げられる。

前述のフッ化物類に属する代表的な界面活性剤としては
、限定されるものでないが、Ｚｏｎｙｌ（商標）ＦＳＮ
およびＺｏｎｙｌ（商標）ＦＳＮ−１００のようなＺｏ
ｎｙｌ（商標）系の界面活性剤（ＤｕＰｏｎｔ製）、３
Ｍ社から市販されているＦｌｕｏｒａｄ　（商標）系の
界面活性剤、例えばＦｌｕｏｒａｃｌ（商標）ＦＣ−１
７０−Ｃ，Ｆｌｕｏｒａｄ（商標）ＦＣ−１７０、Ｆｌ
ｕｏｒａｄ（商標）ＦＣ−４３０，Ｆｌｕｏｒａｄ（商
標）ＦＣ−４３１およびＦｌｕｏｒａｄ（商標）ＦＣ−
７４０が挙げられる。

有用なポリオキシエチレンエーテル類としては、限定さ
れるものでないが、オクチルフェノキシポリエトキシエ
タノール（Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００もしくはＴ
ｒ　ｉ　ｔｏｎ　（商標）Ｘ−１０２としてまたはＳｉ
ｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌによってＮｏｎ１ｄｅｔ　（商
標）ＮＰ−４０として販売されている〕ようなＲｏｈｍ
　＆　ＨａａｓのＴｒ　ｉ　ｔｏｎ　（商標）系界面活
性剤、またはノニルフェノキシポリエトキシエタノール
［Ｔｒｉｔｏｎ（商標）−Ｎとして販売されている〕よ
うなもの、あるいはＩＣＩ　Ａｍｅｒｉｃａｎｓ。

Ｉｎｃ、、のＢｒ１ｊ（商標）系界面活性剤、例えばポ
リオキシエチレン（２）セチルエーテル（Ｂｒｉｊ（商
標）５２として販売されている〕などが挙げられる。

一般的に、それぞれ２種の相違する部類に属する界面活
性剤に由来するものである少なくとも２種の非イオン界
面活性剤が使用される。好ましい部類のものは、ポリオ
キシエチレンエーテル類とポリオキシエチレンソルビタ
ン誘導体である。従って、好ましい態様としては、Ｔｒ
　ｉ　ｔｏｎ　（商標）Ｘ−１００またはＮｏｎ　１ｄ
ｅｔ　（商標）ＨＰ−４０とＴｕ＋ｅｅｎ　（商標）２
０との組み合わせの如き前記２つの部類の各々に由来す
る界面活性剤が挙げられる。

この溶解組成物中の非イオン界面活性剤の量は、存在す
るものと信られている細胞またはウィルス体の量に応じ
て変動しつる。これが抽出された核酸の検出にとって増
幅操作がどれ程の感度をもつかを大きく左右する。一般
に、それは少なくとも０．１重量％、好ましくは０．１
〜５重量％（総組酸物重量基準）の量で存在する。界面
活性剤に多様性が存在するので、界面活性剤量は必要に
より個々の界面活性剤について調整することができる。

界面活性剤が１種の部類より多くに由来するときには、
それらの界面活性剤が等量で存在するのが好ましい。

任意ではあるが、この溶解組成物は１〜１５０ミリモル
の量で塩を含むことが好ましく、より好ましくは５０〜
１００ミリモルの塩を含む。このような塩としては、高
濃度で水性溶液中でイオン化されるものであって、−価
の塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび当業
者に既知の他の塩が挙げられる。アルカリ金属塩が好ま
しく、塩化カリウムが最も好ましい。また、すべての条
件下で完全にイオン化されないがも知れないが、この溶
解組成物のρ］１で十分にイオン化される化合物もまた
使用できるであろう。このような化合物の具体例として
は、トリシン、グリシン、グリシンナトリウム塩、トリ
シンナトリウム、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスル
ホン酸ナトリウム塩および当業者に既知の他の塩のよう
な緩衝剤が挙げられる。これらの化合物の混合物も使用
できる。さらに、この塩は追加の化合物としてというよ
りも溶解組成物の列挙した成分の１種以上と共に供給し
てもよい。

試験試料と溶解組成物を十分な時間（一般に、１０分未
満）混合した後、この発明の抽出方法における主要な工
程は、十分な時間水の沸点またはその近傍で前記混合物
を加熱して試料中のタンパク質を破壊しそしてすべての
細胞を溶解することである。この工程の温度は、大気圧
、煮沸時間および他の環境的要因に応じて変動するであ
ろう。

殻的に海水面レベルでは、加熱温度は１００℃またはそ
の近傍であるが、８０℃程度の低温および１２０℃程度
の高温であることもできる。

前記温度で試料を維持する時間は、試料中のタンパク質
を変性しそして細胞およびビリオンを溶解して核酸を放
出するのに必要な時間である。これは、加熱工程中に試
料の一部を採取して完全なタンパク質が残存するか否か
を測定することによって容易に決定することができる。

この時間も使用される温度によって変動する。すなわち
、低温では加熱時間はより長くなる。一般的に、試料は
目的の温度で少なくとも５分で１５分未満、そして好ま
しくは８〜１２分加熱され、１０分が最適である。

加熱は試料を保持する寸法として十分でありそして加熱
処理に耐えることのできるいずれか適当な容器中で行う
ことができる。例えば、それはフラスコ、試験管、遠心
管、毛細管、ビー力、キュベツトおよび他の標準的な実
験室の備品で行うことができる。好丈しくは、加熱およ
び化学反応を含む種々の処理用に設計された自蔵式反応
容器中で行われる。このような容器の殆どは当該技術分
野で知られている９ 加熱後、放出された核酸（一般に、ＤＮＡ）は適当な方
法で回収される。濾過、遠心、デカン）〜または吸引を
初めとする、いずれか適当な方法で可溶性ＤＮＡ分子を
含有する流体から細胞物資および凝集した細胞破砕残渣
を分離する。濾過は、標章的な濾過装置または濾過膜を
備えた各種デバイスを用いて行うことができる。特に有
用な分離手段は、微孔質濾過膜、例えば、Ｐａ１ｌ　Ｃ
ｏｒｐ、製のポリアミド膜〔例、Ｌｏｐｒｏｄｙｎｅ（
商標）膜およびＢｉｏｄｙｎｅ（商標）膜〕である。そ
れらは、分析操作を促進する界面活性剤または他の材料
の未塗布または予備塗布されたものを使用することがで
きる。

これらの膜は、アッセイの他の工程を実施するための適
当なコンテナーの分離基材として使用することもできる
。しかしながら、試験装置の一部として固定されている
のが好ましい。米国特許第３．８２５，４１０号、同３
　、８８８　、６２９号、同３，９７０，４２９号およ
び同４，４４６，２３２号明細書に記載されるものを初
めとする各種の試験装置が当該技術分野で知られている
。特に有用な装置は、ヨーロッパ特許公開第３０８，２
３１号公報に記載されている。

この発明の方法は、前記既述した工程を含み、−ｉには
他の工程は不要である。しかしながら、全血被検体が用
いられる場合には、適当な方法で赤血球細胞を除去する
ことが望ましいかも知れない。他の任意の遠心工程は、
前記混合または加熱工程のいずれかに先立って主な妨害
物または細胞破砕残渣を除去する方法として有用である
かも知れない。

患者の被検体からＩＩＩＶ−（ＤＮＡの迅速な抽出に対
するこの発明の好ましい態様では、その方法は次の工程
を含んでなる。

Ａ、　タンパク質分解酵素の不存在下で、ＨＩＶ−１怒
染細胞を含むことが信られる患者の被検体を、溶解性組
成物であって、 （１）その組成物をｐ］１４〜１０に維持する有機緩衝
剤、 （２）少なくとも０．５ミリモル濃度のマグネシウムイ
オン源、 （３）安定化剤、および （４）細胞の細胞質膜と核膜からＩＩＩＶ利　ＤＮＡを
放出するのに十分量で存在する適合性界面活性剤少なく
とも１種、を含んでなる溶解性組成物と混合する工程、 Ｂ、水の沸点またはその付近で得られた混合物を５〜１
５分間加熱する工程、ならびにＣ０加熱された混合物か
ら旧Ｖ−Ｉ　　ＤＮＡを回収する工程。

より具体的には、細胞またはビリオンからの核酸の迅速
抽出方法は次の工程を含んでなる。

Ａ、　タンパク質分解酵素の不存在下で、１種以上の核
酸を含有する細胞またはビリオンの試料を、溶解性組成
物であって、 〈１）その組成物をｐＨ７〜９に維持するためのトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン、（２）塩化カリウ
ム１〜１５０ミリモル濃度、（３）マグネシウムイオン
０．５〜２０ミリモル濃度、（４）組成物１ｍＮ当たり
ゼラチン０．１〜１０ｍｇ、（５）総組酸物重量基準で
、ポリオキシエチレンソルビタン誘導体の非イオン界面
活性剤０．１〜５重量％、および （６）総組酸物重量基準で、ポリオキシエチレンエーテ
ル非イオン界面活性剤０．１〜５重量％、を含んでなる
溶解性組成物と混合する工程、Ｂ、水の沸点またはその
付近で８〜１２分間得られた前記混合物を加熱する工程
、ならびにＣ１加熱された混合物から核酸を回収する工
程。

本明細書でプライマー、プローブまたは検出される核酸
フラグメン）−と称して使用される「オリゴヌクレオチ
ド」の語は、２種以上、好ましくは３種を越えるデオキ
シリボヌクレオチド類またはリボヌクレオチド類を称す
る。その厳密な寸法は、オリゴヌクレオチドの最終用途
または機能を初めとする多くの要因によって左右される
ので限定的でない。このオリゴヌクレオチドは合成的に
誘導されてもクローニングにより誘導されてもよい。

［プライマーＪの語は、天然に見い出されるか合成産品
であるかを問わず、ある核ＭＭに相補的なプライマーエ
クステンション産物の合成が誘導される条件下に置かれ
た場合に合成の開始点として働きうるオリゴヌクレオチ
ドをいう。このような条件には、ヌクレオチド（例えば
、４種の標準的なデオキシリボヌクレオシド三リン酸）
やＤＮＡポリメラーゼのような重合用試薬の存在、適当
な温度およびｐＨが含まれる。

この発明の実施に際して、プライマー、プローブおよび
フラグメントは全血またはＰＢＭＣ画分から抽出される
標的核酸の特異的核酸配列に実質的に相補性である。「
実質的に相補性（的）」とは、ハイブリダイゼーション
の形成が起こりうるように適合する十分な数の塩基が相
補的物質上に存在することを意味する。しかしながら、
すべての塩基対が適合することを意味しない。

ある態様では、この検出方法で使用されるプライマー類
（またはそれらの塩）少なくとも１種は、特異的に結合
するリガンドで標識されている。

「標識されている」の語は、リガンドが簡単には脱離し
ないような状態でこのプライマーに付着されていること
を称する。この特異的結合リガンドは、ビオチンもしく
はその誘導体、レクチン、糖、タンパク質、ハプテン、
′薬剤または抗体もしくは抗原性物質のような免疫学的
な種であることができる。

本発明は、２つの相補的な鎖を有する標的核酸の増幅ま
たは検出に有用である。既に興味の対象とされている殆
どの核酸配列は、ＤＮＡにおいて見られるもののように
二本鎖である。しかしながら、−本鎖の核酸配列、例え
ば、ｍＲＮＡも同様に増幅しそして検出することができ
る。

特異的核酸配列は、鋳型としての配列を含有する核酸を
用いて生成される。この核酸が２つの鎖を含む場合には
、分離工程としてかまたはプライマーエクステンション
産物の形成と同時にそれらの鎖を分離すること（変性と
称される）が必要である。変性は、従来技術文献に記載
されるようないずれか適当な物理的、化学的または酵素
的手段を用いて行うことができる。適当な温度に加熱す
ることが好ましい手段である。

一度び分離された鎖が使用可能になったなら、一般にｐ
１１７〜９の緩衝化された水性溶液中で２種以上のプラ
イマー（標識されているかまたは未標識）を用いて付加
核酸鎖の合成を行うことができる。好ましくは、過剰モ
ル量の２種のプライマーが緩衝化された溶液に加えられ
る。その具体的な量は、従来技術文献（例えば、米国特
許第４，６８３，２０２号明細書）に教示されている。

前記デオキシリボヌクレオシド三リン酸類（ｄＡＴＰ　
、　ｄＣＴＰ　、　ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）も適当量
前記合成混合物に加えられ、こうして得られる溶液は１
０分未満、好ましくは１〜４分間９０〜１００℃に加熱
される。マグネシウムイオンまたはマンガンイオンなど
の酵素の補因子も前記三リン酸類に対して過剰モル量存
在するのが好ましい。この加熱後、溶液を室温まで冷却
することが好ましく、次いでブライマーエクステンショ
ン産物の形成を誘導（または触媒）する適当な試薬が入
れられる。この誘導試薬は、一般に重合剤として当該技
術分野で知られている。これらの産物を形成する反応は
、既知の条件（一般に、室温からもはや重合が起らなく
なる温度まで）下で行われる。

この重合剤は、酵素（例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼｌ　、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウボリメラ
ーゼ、逆転写酵素および当該技術分野で既知の他の酵素
）を初めとするブライマーエクステンション産物の合成
を行うことのできるいずれかの化合物または試薬類の組
み合わせであってよい。

特に有用な酵素は、クローン化されるかまたは天然に見
い出される、例えば各種のサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）
属およびメタノサーマス（Ｈｅｔｌ＋ａｎｏｔｂｅｒｍ
ｕｓ）属の細菌種に由来するものである。他の重合剤は
、米国特許第４，６８３，２０２号明細書に記載されて
いる。

好ましい熱安定性酵素は、サーマス・アクアティカス（
Ｔｈｅｒｍｕｓ　！ＩＬ！↓譚孤リュ）ますはサーマス
・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ山胛吟吐辻旺）に由
来する天然のＤＮＡポリメラーゼか、あるいは微生物の
いずれかのゲノムからクローン化された遺伝子から合成
的に産生される。一般的に、エクステンション産物の合
成は、各プライマーの３′末端で開始され合成が終了す
るまで鋳型に沿って５′から３′の方向に進行する。あ
る重合剤（例えば、逆転写酵素）は前記鋳型に沿って３
′から５′の方向に進行するかも知れない。

新たに合成された鎖類とそれらの各プライマーを含んで
なる新たに形成されたプライマーエクステンション産物
は、この方法の次の工程で使用される最初の標的類を有
する二本鎖分子を形成する。

次に、前述したようにこれらの鎖を変性によって分離し
て一本鎖分子を提供し、その上に前述のように新たな核
酸を合成する。この増幅工程の進行をＩｌｔ枕するには
追加の試薬が必要であるから知れないが、その後のエク
ステンション産物の殆どは２種のプライマーと結合され
た特異的核酸配列からなるであろう（すなわち、相補的
産物）。

鎖の分離およびエクステンション産物の合成工程は必要
とされるだけ繰り返して、使用、例えば検出に必要な特
異的核酸の所定量を生成することができる。一般的に、
一連の工程は少なくとも１度、好ましくは最低１０回か
ら５０回まで繰り返される。

１種より多くの標的核酸の増幅が必要な場合には、前述
の一最的な操作中で数組の適当なプライマーが使用され
る。

サザーンプロット、ゲル電気泳動、染色および当該技術
分野で既知の他の手段を初めとする各種の検出手段を用
いて、検出可能なハイブリッドの存在を測定することが
できる。

少なくとも１種のプライマーエクステンション産物が生
じた後のこの発明の方法におけるある時点でその産物を
検出可能なズーブ（後述する）とハイブリッドを形成す
ることができる。

一般に、興味の対象とする核酸配列の所定量が生じたと
き、そのプライマーエクステンション産物を最後に分離
し、最初のプライマーエクステンション産物を、検出の
ために標識されそしてそれらに相補的であるオリゴヌク
レオチド１０−ブと接触して生成物を形成する。このプ
ローブは、標的核酸配列と相補的であるオリゴヌクレオ
チドを含んでなる。これらのプローブ類はいずれか適当
な鎖長の核酸であることができるが、好ましくは１５〜
４０個の核酸を有する。それらは、特異的な結合リガン
ドとその受容体の複合化を妨げないであろう適当な検出
可能物質で標識される（通常、５′末端）。

標識を付着される操作およびプローブを調製する方法は
、当該技術分野で周知であり、例えば、八ｇｒａｕ＋ａ
　Ｉ　　らのＮｕｃｌｅｉｃ　　八ｃｉｄ　　Ｒｅｓ、
、１４．　６２２７〜６２４５ページ（１９８６）およ
びプライマーに特異的結合リガンドを付着させることに
関して前述した引用文献に記載されている。有用な標識
としては、放射性同位体、電子稠密体、発色体、蛍光体
、リン光成分、フェリチンおよび他の磁性粒子、化学発
光成分および酵素（このものが好ましい）が挙げられる
。

有用な酵素としては、グルコースオキシダーゼ、ペルオ
キシダーゼ、ウリカーゼ、アルカリ性ホスファターゼお
よび当該技術分野で既知の他の酵素が挙げられる。この
ような酵素に対する基質および色素生成組成物も周知で
ある。

特に好ましい態様では、標識がペルオキシダーゼであり
、そしてアッセイのある時点で過酸化水素および適当な
色素生成組成物を加えて検出可能な色素を提供させる。

例えば、有用な色素生成試薬としては、テトラメヂルベ
ンジジンおよびその誘導体、ならびに米国特許第４，０
８９，７４７号明細書に記載されるようなトリアリール
イミダゾールロイコ染料のごときロイコ染料またはペル
オキシダーゼと過酸化水素の存在下で反応して色素を提
供する他の化合物が挙げられる。特に有用な色素生成組
成物は、国際公開第８８７０２８０６号、同８８７０２
８０７号および特開平１−１００４５３号公報に記載さ
れている。

相補的産物中にあるプローブの存在の検出は、適当な既
知の検出装置および方法を用いて行うことができる。特
定の１０−ブは検出装置と使用することなく肉眼で見る
ことができる。

相補的産物中のプローブを検出するためには、反応媒体
中の他の物質から相補的産物を分離することがしばしば
重要である。これは、適当な不溶化手段、例えば、本発
明の方法のある時点で固体材料に付着するかまたは付着
を起こしうるプライマーまたはプローブを用いることに
よって行うことができる。得られる不溶化複合化生成物
は、濾過、遠心または他の適当な分離手段によって未複
合化物から分離することができる。

特に有用な分離手段は、Ｉ”ａｌｌ　Ｃｏｒｐ、によっ
て販売されているポリアミドＭ（前述）のような微孔質
沢過膜である。これらの膜は、アッセイの他の工程を実
施するのに適するコンテナーの分離基材としても使用で
きる。しかしながら、それらは前述したように試験装置
の一部として固定されることが好ましい。

本明＃［［＋書で開示する方法を使用して、生物学的被
検体中に見い出される感染症、遺伝疾患または細胞疾患
（例えばガン）に付随する特異的核酸の検出または特性
決定を行うことができる。それはまた法医学的捜査にお
けるＤＮＡの類別および組織の類別に使用できるかも知
れない。この発明の対象には、いずれかの器官に由来す
るヒトゲノムＤＮＡの特異的な欠陥または変異、例えば
鐘状赤血球血症、嚢胞性線維症、α−サラッセミア、β
−サラッセミアおよび当業者に自明の他の疾患を含む。

各種の感染症も、それが酵母、細菌またはウィルスに起
因するか否かを問わず、存在する細胞または少量の生体
を特徴とする特異的なりＮＡ配列によって診断すること
ができる。このような細菌としては、限定されるもので
ないが、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌ　ｌａ）、クラ
ミジア（Ｃｈ　Ｉ　ａｍｙｄ　ｉ　ａ　）、ゴノローエ
（Ｇｏｎｏｒｒ）＋ｅａ）、シゲラ（注１吐堕）および
リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）が挙げられる。限定さ
れるものでないが検出可能なウィルスとしては、ヘルペ
ス、サイトメガロウィルス、ニブスタン−バールウィル
ス、肝炎ウィルスならびにＨＴＬＶ−１およびＩ［Ｖ−
ｒのようなレトロウィルスが挙げられる。

寄生性原虫、酵母およびカビも検出可能である。

他の検出可能な種は当業者にとって自明であろう。

〔実施例〕

以下の例はこの発明の実施を具体的に説明する目的で含
めるものであって、いずれかの方法に限定することを意
味しない。

例で使用した材料は以下のものであった。

電気泳動の移動性緩衝液（ｐＨ８）は、トリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン（８９ミリモル濃度）、ホウ
酸（８９ミリモル濃度）およびエチレンジアミン四酢酸
（２ミリモル濃度）から構成した。

ハンクス・バランスド（Ｈａｎｋｓ　ｂａｌａｎｃｅｄ
）塩溶液は、Ｓｉｇｍａ　Ｃ１＋ｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、
から入手した。

ＤＮＡ定量に用いた色素は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍがら
入手した２−［２−（４−ヒドロキシフェニル）−６ペ
ンズイミダゾール）−６−（１−メチル−４ピペラジル
）ベンズイミダゾールの３塩酸塩であった。

Ｌｅｕｃｏｐｒｅｐ（商標）チューブは、Ｂｅｃｔｏｎ
　ＤｉｃｋｅｒｓｏｎＬａｂｗａｒｅ（Ｌｉｎｃｏｌｎ
　Ｐａｒｋ、　Ｎ、Ｊ）から入手した。

細胞は、５ｐｅｃｔｒａ　５ｅｒｖｉｃｅｓ　（Ｒｏｃ
ｈｅｓｔｅｒ、　Ｎ、Ｙ、）由来のＯｌｙｍｐｕｓ　Ｂ
Ｈ−２９微鏡を使用して数えた。

ＤＮＡは以下のように定量しな： 遠心後、ＤＮＡ含有上澄（５μりを前記のイミダゾール
色素含有緩衝溶液＜２＋ｎｔりに加えた（最終濃度０．
１ｇ／ｍＺ）。トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン（１０ミリモル濃度）、エチレンジアミン四酢酸（１
ミリモル濃度）および塩化ナトリウム（０，１モル濃度
）を含む緩衝液を、塩酸でｐＨ７，４に調整した。蛍光
はＴＫＯ１００蛍光測定器（ＨｏｅｒｅｒＳｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）で測定し、
検量線と比較してＤＮＡを定量した。

増幅に使用したブライマーは、下記配列を有していた。

フ゛ライマー１　：　５　’−ＵＧＣＴ八ＴＣ：ＴへＡ
ＧＴＴＣＣＣＣＴＴＧＧＴＣＴＴＣ−３”ブライマー２
　：　５　’−［１八ＧＴＧＧＣＧＧＧＡＣＡＴＣ＾八
ＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣ＾＾Δ−３′ブライマー３二５′
−＾ＧＣＡにＣＡＧＧ八八（：へへＧＴＡＴＧＧ−３’
およびブライマー４　：　５　’−ＵＣＣＡＧＡＣＴ（
：ＴＧＡＣ：ＴＴＧＣ＾＾ＣＡＧ−３’。

ブライマー１および２は旧Ｖ−Ｉ　　ＤＮへの■領域の
核酸配列を増幅するが、ブライマー３および４は）ＩＩ
Ｖ−ｒ　　ＤＮＡのｅｎｖ領域の核酸配列を増幅する。

アガロースゲル３％５ｕＳｉｅｖｅ（商標）および１？
６Ｓｅａｋｅｍ（商標）は、ＦＭ＾Ｂｉｏｒ’ｒｏｄｕ
ｃｔｓ　（ＲｏｃｋｌａｎｄＨａｉｎｅ）から入手した
。

対照溶解組成物（前述のｌＩｉｇｕｃｈｉのものと類似
）は次のように調製した。

トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩緩ｆＢ
液（１０ミリモル濃度、ｐｔｌ　８．３）、塩化カリウ
ム（５０ミリモル濃度）、塩化マグネシウム（２，５ミ
リモル濃度）、ゼラチン（０、Ｌｔ−ｔ　ｇ／　ｍｎ）
、Ｎｏｎ１ｄｅｔ（商標）Ｐ−４０非イオン界面活性剤
（０，４５重量％）およびＴｗｅｅｎ（商標）２０非イ
オン界面活性剤（０，４５重１％）を混合して溶液とし
た。この溶液をオートクレーブにかけ、凍結状態で保存
した。使用前にそれを解凍し、次いでプロティナーゼに
溶液けＯｍｇ／ｍ１）を加えた（解凍液１００μβ当た
り酵素溶液０．６μｐ）。

この発明で有用な溶解組成物は、その使用前にプロティ
ナーゼＫを添加しない他は対照組成物と同様に調製した
。

増幅に使用したＰＣＲ溶液は、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン塩酸塩ＦＩＴ液（１００ミリモル濃度
、ｐＨ８＞、ゼラチン（１μｇ／ｌｌ１ｌ）、塩化カリ
ウム（５００ミリモル濃度）、塩化マグネシウム（１０
０ミリモル濃度）、ｄＮＴＰ　（各ｄＮＴＰの１．５ミ
リモル濃度を含有する６μｌ）、サーマス・アクアティ
カス由来のＤＮＡポリメラーゼ（７，４単位、４単位／
ｍ１）および前述のブライマー類（各１０マイクロモル
濃度）を含めた。

例１　　　の全血０　からの旧Ｖ−ＩＤＮＡの　出この
例は、本発明の抽出方法の実施をｌＩｉｇｕｃｈｉ（前
述）の溶解組成物を用いる従来技術と比較で例示する。

以下の操作を用いて地方病院の旧Ｖ−１感染患者から得
られた数種の各種全血試料を試験した。各試料（８ｍｆ
ｆｉ）はしｅｕｃｏｐｒｅｐ　（商標）チューブに集め
、室温にて２０分間１８，０００ｘｇで遠心し、そして
得られた血漿と細胞層（約６ｍ１）を慎重に取り出して
１５社のコニカル・チューブに移した。ハンクス・バラ
ンスド塩溶液の等量を加え、数回転回して溶液を混合し
た。次に、室温で１０分間３００　Ｘ　ｇにて遠心し、
取り出し廃棄した。ベレットをハンクス・バランスド塩
溶液（３ｍｊ７）に再懸濁し、回転させ完全な細胞懸濁
液を得た。次に細胞を数え次いで溶液を２つの容量に分
割した（各駒１．５ａ＋４）。これらの２つの容量を１
０分間１４，０００ｒ、ｐ、ａ＋、にて遠心し、各上澄
を取採廃棄した。得られた細胞のベレットを２０℃で凍
結し、後者のＤＮＡ抽出についてすぐさま評価した。一
つの細胞ベレットをこの発明の方法を用いて抽出し、も
う一つを対照方法（ブライマー類に溶解組成物を用いる
）登用いて抽出した。

この発明の方法を次のように行った。

前述のように得られた細胞ペレットをプロティナーゼＫ
を欠く溶解組成物（５０，ｕｌ）に加え、回転させてベ
レットを解体した。次に、得られた溶液を１０分間ｉｏ
ｏ℃で加熱し、１４，０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、で約２秒間遠
心した。こうして得られたＤＮＡを定量し、反応チュー
ブ当たりＤＮＡ約１μｇを以下に記載するようなポリメ
ラーゼ連鎖反応を用いて増幅した。

前述の各患者試料の第二細胞ベレットを対照組成物（５
０μｅ）に加え、次いで回転させベレットを解体した。

得られた溶液を１時間５０〜６０℃にてインキュベーシ
ョンし、次いで１０分間９５℃にてインキュベーション
した。約２秒間１．４０００ｒ、ｐ、ｍ、にて遠心した
後、ＤＮＡを定量した。反応チューブ当たりＤＮＡ約１
μｇを下記のようなポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅
した。

対照抽出操作は相違する温度で２度別々に加熱する工程
で１時間を越えることが観察された。本発明の操作は、
１度の加熱工程が必要であるにすぎず、そして１０分間
の加熱を含め単に約１２分必要であるにすぎない点でよ
り簡略化された。これらの利点は、抽出および増幅が限
定された人員によって限定された期間で多くの患者試料
が試験されるであろう臨床研究所および医院で実施され
る場合に特に重要である。従ってこの発明の抽出方法は
膨大な量の試験にとってより現実的である。

例２　　　された旧Ｖ−ＩＤＮ＾の この例は、例１で抽出されたＤＮＡをポリメラーゼ連鎖
反応を用いる増幅を具体的に説明する。

本発明ならびに対照抽出方法に由来する例１で抽出され
たＤＮＡ試料（各１μｇ）を、次の方法のポリメラーゼ
連鎖反応を用いて増幅した。

これらのＤＮＡ試料（２５μｍ）をＰＣＲ，溶液（前記
２００μｍ）と混合しそして３２周期で増幅した。各周
期は、１分間かけて９７℃まで加熱し、３０秒間９７℃
に保持し、１．５分かけて５５℃まで冷却し、３０秒間
５５℃に保持し、４５秒かけて７０℃まで加熱し、次い
で１分間７０°Ｃに保持した。次に、アリコート（６μ
ｌ）を抜き出し、予めエチジウムブロマイド（水１ｍＮ
当なり１０ｍｇ、４μりで染色した４％アガロースゲル
にかけた。移動Ｍ街液にはエチジウムブロマイド溶液（
２４μ２）を含めた。このゲルを１時間１２０ボルトで
電気泳動し、次いで写真をとりそして吸収帯を可視化し
た。

すべての複製において本発明は、Ｈｉｇｕｃｈｉの対照
方法である従来技術（前述）よりも遥かに迅速がつ簡単
であった。ある場合には、本発明のエチジウムブロマイ
ドの吸収帯は対照方法で得られる吸収帯より遥かに強烈
であったが、この比較はすべての複製について見られな
かった。

〔発明の効果〕

この発明の抽出方法は、種々の患者の被検体における細
胞またはビリオンから核酸を抽出するのに迅速かつ有効
である。この方法は１５程の短時間で実施でき、そうす
ることで従来の危険な操作を避けることができる。有機
溶媒が不要であり、それが自動化しやすくするように操
作工程が少なく、例えばある種の輸送容器にかけやすい
。オペレーターはこの発明の方法を容易に使用すること
ができ、迅速な診断結果を得ることができる。

この発明ではプロティナーゼにのような高価なタンパク
質分解酵素の使用が回避される。意外にもこの操作は２
〜３分間以内で実施され、ＨｉＨｕｃｈｉ（前述）の１
〜２時間と全く異なる。タンパク質分解酵素の存在を伴
うことなく、時間のかかる不活化工程が必要であり、あ
るいは時ならぬ酵素を失活する試薬を避ける必要がない
。

これらの利点は、ポリメラーゼ連鎖反応増幅で普通に使
用される試薬を含む特殊な抽出組成物の使用によって達
成される。本発明の組成物は患者の被検体と容易に混合
され、２〜３分間煮沸され、次いで放出された核酸が適
当な方法で容易に単離される。前記平成２年４月１６日
出願の特願平２−９７７８９号明ＩｉＩ書に記載された
希釈組成物をこの発明によっても避けれる。前述したよ
うに、抽出後未反応混合物は増幅が容易である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ａ、タンパク質分解酵素の不存在下で、１種以上の
   核酸を含有する細胞またはビリオン試料を、 （１）ｐＨ４〜１０に下記溶解性組成物を維持する有機
   緩衝剤、 （２）ＤＮＡポリメラーゼ活性に対する触媒量の補因子
   源、 （３）安定化剤、 （４）前記細胞またはビリオンから核酸を放出するのに
   十分量で存在する少なくとも１種の適合性非イオン界面
   活性剤、 を含んでなる溶解性組成物と混合する工程、Ｂ、得られ
   る混合物を５〜１５分間水の沸点またはその付近で加熱
   する工程、ならびに Ｃ、その加熱された混合物から核酸を回収する工程、を
   含んでなる細胞またはビリオンから核酸の迅速抽出方法
   。 ２、 I 、Ａ、タンパク質分解酵素の不存在下で、１種
   以上の核酸を含有する細胞またはビリオン試料を、 （１）ｐＨ４〜１０に下記組成物を維持する有機緩衝剤
   、 （２）ＤＮＡポリメラーゼ活性に対する触媒量の補因子
   源、 （３）安定化剤、 （４）前記細胞またはビリオンから核酸を放出するのに
   十分量で存在する相溶性非イオン界面活性剤、 を含んでなる溶解性組成物と混合する工程、Ｂ、得られ
   る混合物を５〜１５分間水の沸点またはその付近で加熱
   する工程、ならびに Ｃ、その加熱された混合物から核酸を抽出する工程を含
   んでなる抽出操作、ならびに II、こうして回収された核酸をポリメラーゼ連鎖反応を
   用いて増幅する工程、 を含んでなるポリメラーゼ連鎖反応を用いる核酸の増幅
   方法。