JPH09238687A - 核酸合成法 - Google Patents
核酸合成法Info
- Publication number
- JPH09238687A JPH09238687A JP8051573A JP5157396A JPH09238687A JP H09238687 A JPH09238687 A JP H09238687A JP 8051573 A JP8051573 A JP 8051573A JP 5157396 A JP5157396 A JP 5157396A JP H09238687 A JPH09238687 A JP H09238687A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pcr
- reaction solution
- nucleic acid
- dna
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、生体由来試料中の目的とする遺伝
子を前処理なしで直接増幅出来る核酸合成法を提供する
ことを目的とする。 【解決手段】 本発明は、生体由来試料中の遺伝子包含
体もしくは生体由来試料そのものと遺伝子増幅反応液を
混合し反応させる核酸合成法において、２５℃における
前記反応液のｐＨを８．５〜９．５にしたことを特徴と
する。例えばヒト血液を試料として用い、種々のｐＨの
ＰＣＲ反応液でＰＣＲを行った結果、図１の電気泳動図
に示す如くｐＨ８．５以上のＰＣＲ反応液を使用するこ
とにより、特異的なＰＣＲ産物を得ることができた。
子を前処理なしで直接増幅出来る核酸合成法を提供する
ことを目的とする。 【解決手段】 本発明は、生体由来試料中の遺伝子包含
体もしくは生体由来試料そのものと遺伝子増幅反応液を
混合し反応させる核酸合成法において、２５℃における
前記反応液のｐＨを８．５〜９．５にしたことを特徴と
する。例えばヒト血液を試料として用い、種々のｐＨの
ＰＣＲ反応液でＰＣＲを行った結果、図１の電気泳動図
に示す如くｐＨ８．５以上のＰＣＲ反応液を使用するこ
とにより、特異的なＰＣＲ産物を得ることができた。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は核酸合成法、特に、
ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction ：
以下ＰＣＲと略す）法による核酸合成法に関する。
ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction ：
以下ＰＣＲと略す）法による核酸合成法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＰＣＲ法は、ＤＮＡ鎖の中の特定の領域
をはさんで、プライマーを結合させ、ＤＮＡポリメラー
ゼを作用させて、ＤＮＡ合成反応を繰り返すことによっ
て、目的のＤＮＡ断片を数十万倍にも増幅できる方法で
ある。ＰＣＲ法は、マリス氏らの発明である特開昭６１
−２７４６９７号に述べられている。
をはさんで、プライマーを結合させ、ＤＮＡポリメラー
ゼを作用させて、ＤＮＡ合成反応を繰り返すことによっ
て、目的のＤＮＡ断片を数十万倍にも増幅できる方法で
ある。ＰＣＲ法は、マリス氏らの発明である特開昭６１
−２７４６９７号に述べられている。
【０００３】ＰＣＲ法は、種々の試料中の核酸の高感度
分析法として使用可能で、特に動物体液由来の試料中の
核酸の分析法に使用できる。従って、ＰＣＲ法は、微生
物に起因する伝染病や遺伝病やガンの診断等に利用され
る。さらに、ＰＣＲは移植や親子鑑定の際のＤＮＡタイ
ピングの検査にも適した方法である。これらの場合末梢
血液が検査対象に選ばれる場合が多い。
分析法として使用可能で、特に動物体液由来の試料中の
核酸の分析法に使用できる。従って、ＰＣＲ法は、微生
物に起因する伝染病や遺伝病やガンの診断等に利用され
る。さらに、ＰＣＲは移植や親子鑑定の際のＤＮＡタイ
ピングの検査にも適した方法である。これらの場合末梢
血液が検査対象に選ばれる場合が多い。
【０００４】ＰＣＲ法の１つの欠点は色素、たんぱく、
糖類あるいは未知の夾雑物が反応を阻害することであ
る。すなわち、代表的な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであ
るThermus aquaticus 由来のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
をはじめ、多くのＤＮＡポリメラーゼは、微量の体液由
来の夾雑物がＰＣＲ反応液中に混在しても、ＰＣＲが強
く阻害されることが良く知られている。通常、ＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼ用の反応液を作製するためには、あら
かじめ２５℃においてｐＨ８．３の１ＭTris-HCl等を用
いて、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液（100mM Tris-HCl,5
00mM KCl,10-40mMMgCl2 ）を作製しておく。そして、使
用時に、この緩衝液を１倍濃度に希釈したものに、dAT
P,dCTP,dGTP,dTTP をそれぞれ 200μＭ、必要なプライ
マーを0.2-1.0 μＭ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを2.5u
nits/100μl となるように添加し、さらに必要によって
は、ゼラチンやNP40,Tween等の界面活性剤等の添加物を
加え、鋳型ＤＮＡを加えてＰＣＲを行う。しかし、この
ような反応液を用いた場合、微量の体液由来の夾雑物が
ＰＣＲ反応液中に混在しても、ＰＣＲが強く阻害される
ことになる。
糖類あるいは未知の夾雑物が反応を阻害することであ
る。すなわち、代表的な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであ
るThermus aquaticus 由来のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
をはじめ、多くのＤＮＡポリメラーゼは、微量の体液由
来の夾雑物がＰＣＲ反応液中に混在しても、ＰＣＲが強
く阻害されることが良く知られている。通常、ＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼ用の反応液を作製するためには、あら
かじめ２５℃においてｐＨ８．３の１ＭTris-HCl等を用
いて、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液（100mM Tris-HCl,5
00mM KCl,10-40mMMgCl2 ）を作製しておく。そして、使
用時に、この緩衝液を１倍濃度に希釈したものに、dAT
P,dCTP,dGTP,dTTP をそれぞれ 200μＭ、必要なプライ
マーを0.2-1.0 μＭ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを2.5u
nits/100μl となるように添加し、さらに必要によって
は、ゼラチンやNP40,Tween等の界面活性剤等の添加物を
加え、鋳型ＤＮＡを加えてＰＣＲを行う。しかし、この
ような反応液を用いた場合、微量の体液由来の夾雑物が
ＰＣＲ反応液中に混在しても、ＰＣＲが強く阻害される
ことになる。
【０００５】そこで、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅に先立
つて被験物から細胞、細菌、ウィルス等（以下、遺伝子
包含体と称する）を分離し、そして、その遺伝子包含体
からのＤＮＡの抽出が必要である。阻害を除去するため
に、酵素、界面活性剤、カオトロピック剤等により遺伝
子包含体を分解し、その後、フェノールあるいはフェノ
ール・クロロホルム等を用いて、遺伝子包含体の分解物
からＤＮＡを抽出する方法が従来より使用されている。
最近ではＤＮＡ精製法として、イオン交換樹脂、ガラス
フィルターあるいはタンパク凝集作用を有する試薬が使
用されている。
つて被験物から細胞、細菌、ウィルス等（以下、遺伝子
包含体と称する）を分離し、そして、その遺伝子包含体
からのＤＮＡの抽出が必要である。阻害を除去するため
に、酵素、界面活性剤、カオトロピック剤等により遺伝
子包含体を分解し、その後、フェノールあるいはフェノ
ール・クロロホルム等を用いて、遺伝子包含体の分解物
からＤＮＡを抽出する方法が従来より使用されている。
最近ではＤＮＡ精製法として、イオン交換樹脂、ガラス
フィルターあるいはタンパク凝集作用を有する試薬が使
用されている。
【０００６】かような精製試薬キットの１つは「ＣＯＬ
ＬＥＣＴＡＧＥＮＥ」（ＡＭＲＡＤ社）の名で市販され
ている。この試薬キットを用いて試料は以下の手順で前
処理される。 １．抗凝固剤処理をした哺乳動物由来の全血を試験管中
で「マグネティクパーティクル」とよく混合し、これに
より白血球と「マグネティクパーティクル」を結合させ
る。 ２．「マグネティクパーティクル」に結合した白血球を
リン酸緩衝液で洗浄する。 ３．「マグネティクパーティクル」に結合した白血球
は、結合状態のままでプロテアーゼで分解し、これによ
りたんぱくは分解され、白血球中のＤＮＡが遊離され
る。 ４．試験管内容物は、プロテアーゼ残査を不活性化する
ため加熱し、冷却後白血球由来の遊離ＤＮＡを含む溶液
を得て、この溶液はそのまま次のＰＣＲに使用される。
ＬＥＣＴＡＧＥＮＥ」（ＡＭＲＡＤ社）の名で市販され
ている。この試薬キットを用いて試料は以下の手順で前
処理される。 １．抗凝固剤処理をした哺乳動物由来の全血を試験管中
で「マグネティクパーティクル」とよく混合し、これに
より白血球と「マグネティクパーティクル」を結合させ
る。 ２．「マグネティクパーティクル」に結合した白血球を
リン酸緩衝液で洗浄する。 ３．「マグネティクパーティクル」に結合した白血球
は、結合状態のままでプロテアーゼで分解し、これによ
りたんぱくは分解され、白血球中のＤＮＡが遊離され
る。 ４．試験管内容物は、プロテアーゼ残査を不活性化する
ため加熱し、冷却後白血球由来の遊離ＤＮＡを含む溶液
を得て、この溶液はそのまま次のＰＣＲに使用される。
【０００７】一方、ＲＮＡ−ＰＣＲは、目的ＲＮＡを検
出したり、その塩基配列の研究に使用され、従って、診
断の他にも医学用途、産業用途、環境用途等に利用され
る。例えば、ＲＮＡ−ＰＣＲは、肝炎の原因となるＣ型
肝炎ウィルス（ＨＣＶ）や後天性免疫不全症候群の原因
となるＨＩＶウィルスの検出に使われる。
出したり、その塩基配列の研究に使用され、従って、診
断の他にも医学用途、産業用途、環境用途等に利用され
る。例えば、ＲＮＡ−ＰＣＲは、肝炎の原因となるＣ型
肝炎ウィルス（ＨＣＶ）や後天性免疫不全症候群の原因
となるＨＩＶウィルスの検出に使われる。
【０００８】ＲＮＡ−ＰＣＲ法では、まず逆転写酵素の
存在下で目的ＲＮＡを鋳型にして相補的なＤＮＡ（ｃＤ
ＮＡ）が合成される。そして、このｃＤＮＡがＰＣＲで
増幅される。従来の技術では、試料中のＲＮＡをＲＮＡ
−ＰＣＲ法で取り扱う場合には、ＲＮＡの精製処理は必
須である。基本的にＲＮＡは、ＤＮＡ精製法と同様な方
法により精製される。
存在下で目的ＲＮＡを鋳型にして相補的なＤＮＡ（ｃＤ
ＮＡ）が合成される。そして、このｃＤＮＡがＰＣＲで
増幅される。従来の技術では、試料中のＲＮＡをＲＮＡ
−ＰＣＲ法で取り扱う場合には、ＲＮＡの精製処理は必
須である。基本的にＲＮＡは、ＤＮＡ精製法と同様な方
法により精製される。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの方法
を用いて試料中のＤＮＡやＲＮＡの精製を行っても、不
純物の完全な除去は困難であり、かつ、試料中の核酸の
回収量が一定しない場合も多く、このため引き続く核酸
合成が、とりわけ試料中の目的とする核酸の含量が少な
い場合には、うまくできない場合もある。また、これら
精製法は操作が煩雑で時間を要し、また操作中のコンタ
ミネーションの機会が高い。従って、これらの問題点を
解決するためには、より簡便で、かつ効果的な試料前処
理法が望まれる。
を用いて試料中のＤＮＡやＲＮＡの精製を行っても、不
純物の完全な除去は困難であり、かつ、試料中の核酸の
回収量が一定しない場合も多く、このため引き続く核酸
合成が、とりわけ試料中の目的とする核酸の含量が少な
い場合には、うまくできない場合もある。また、これら
精製法は操作が煩雑で時間を要し、また操作中のコンタ
ミネーションの機会が高い。従って、これらの問題点を
解決するためには、より簡便で、かつ効果的な試料前処
理法が望まれる。
【００１０】そこで、本発明は、生体由来試料中の目的
とする遺伝子を直接増幅出来る核酸合成法を提供するこ
とを目的とする。言い換えれば、生体由来試料、特に動
物体液由来試料もしくは試料中に含まれる遺伝子包含体
の反応系への直接添加によってもＰＣＲが可能な反応法
および反応試薬を提供することにある。
とする遺伝子を直接増幅出来る核酸合成法を提供するこ
とを目的とする。言い換えれば、生体由来試料、特に動
物体液由来試料もしくは試料中に含まれる遺伝子包含体
の反応系への直接添加によってもＰＣＲが可能な反応法
および反応試薬を提供することにある。
【００１１】さらに本発明の他の目的は、上記の目的に
適した試薬キットを提供することにある。要約すれば本
発明の目的は、動植物組織、体液および排泄物中に存在
する遺伝子、とりわけＤＮＡの増幅に適したＰＣＲ改良
法およびＰＣＲ反応試薬を提供することにある。
適した試薬キットを提供することにある。要約すれば本
発明の目的は、動植物組織、体液および排泄物中に存在
する遺伝子、とりわけＤＮＡの増幅に適したＰＣＲ改良
法およびＰＣＲ反応試薬を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本件発明者は、鋭意検討
した結果、ＰＣＲ反応液のｐＨを通常用いる場合より高
くすることで、生体由来の夾雑物が多量に存在しても、
さらには血液や唾液のような体液をＰＣＲ反応液に直接
添加しても、ＰＣＲが可能になることを見いだし、本発
明をなすに至ったのである。
した結果、ＰＣＲ反応液のｐＨを通常用いる場合より高
くすることで、生体由来の夾雑物が多量に存在しても、
さらには血液や唾液のような体液をＰＣＲ反応液に直接
添加しても、ＰＣＲが可能になることを見いだし、本発
明をなすに至ったのである。
【００１３】すなわち、本発明は、生体由来試料中の遺
伝子包含体もしくは生体由来試料そのものと遺伝子増幅
反応液を混合し反応させる核酸合成法において、２５℃
における前記反応液のｐＨを８．５〜９．５にしたこと
を特徴とする。
伝子包含体もしくは生体由来試料そのものと遺伝子増幅
反応液を混合し反応させる核酸合成法において、２５℃
における前記反応液のｐＨを８．５〜９．５にしたこと
を特徴とする。
【００１４】本発明において、生体由来試料とは、動植
物組織、体液、排泄物等をいい、遺伝子包含体とは細
胞、細菌、ウイルス等をいう。体液には血液や唾液が含
まれ、細胞には血液から分離した白血球が含まれるが、
これらに限定されるものではない。
物組織、体液、排泄物等をいい、遺伝子包含体とは細
胞、細菌、ウイルス等をいう。体液には血液や唾液が含
まれ、細胞には血液から分離した白血球が含まれるが、
これらに限定されるものではない。
【００１５】遺伝子増幅反応液は、通常、ｐＨ緩衝液並
びにＭｇＣｌ2 、ＫＣｌ等の塩類、プライマー、デオキ
シリボヌクレオチド類及び合成酵素を含むものである。
また、上記の塩類は適宜他の塩類に変更して使用されて
いる。また、ノニデットＰ−４０、ポリオキシエチレン
ソルビタン類等の界面活性剤、ゼラチン、アルブミン等
の蛋白、ジメチルスルホキシド等種々の物質が添加され
る場合がある。
びにＭｇＣｌ2 、ＫＣｌ等の塩類、プライマー、デオキ
シリボヌクレオチド類及び合成酵素を含むものである。
また、上記の塩類は適宜他の塩類に変更して使用されて
いる。また、ノニデットＰ−４０、ポリオキシエチレン
ソルビタン類等の界面活性剤、ゼラチン、アルブミン等
の蛋白、ジメチルスルホキシド等種々の物質が添加され
る場合がある。
【００１６】本発明に使用することが望ましいｐＨ緩衝
液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと塩
酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組合せであり、鉱酸の中で望
ましいものは塩酸である。また、ＣＡＰＳＯ(3-N-Cyclo
hexylamino-2-hydroxypropanesulfonic acid) あるいは
ＣＨＥＳ(2-(Cyclohexylamino)ethanesulfonic acid)と
苛性ソーダ、苛性カリとの組み合せによるｐＨ緩衝液等
種々のｐＨ緩衝液が使用され得る。ｐＨ調整された緩衝
液は、ＰＣＲ反応液の中で１０ｍＭから１００ｍＭの間
の濃度で使用される。
液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと塩
酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組合せであり、鉱酸の中で望
ましいものは塩酸である。また、ＣＡＰＳＯ(3-N-Cyclo
hexylamino-2-hydroxypropanesulfonic acid) あるいは
ＣＨＥＳ(2-(Cyclohexylamino)ethanesulfonic acid)と
苛性ソーダ、苛性カリとの組み合せによるｐＨ緩衝液等
種々のｐＨ緩衝液が使用され得る。ｐＨ調整された緩衝
液は、ＰＣＲ反応液の中で１０ｍＭから１００ｍＭの間
の濃度で使用される。
【００１７】本明細書中でプライマーは、核酸と重合用
試薬等の存在下に合成の開始点として働くオリゴヌクレ
オチドをいう。プライマーは一本鎖であることが望まし
いが、二本鎖も使用できる。もし、プライマーが二本鎖
の場合には、増幅反応に先立って一本鎖状にすることが
望ましい。プライマーは、公知の方法により合成するこ
とができるし、また、生物界から単離することもでき
る。本明細書中で核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡの一本鎖、二
本鎖およびＤＮＡとＲＮＡよりなる二本鎖を意味する。
核酸は種々の遺伝子包含体より入手できる。両端の一定
個数以上のプライマーが準備できれば、核酸は本発明に
より増幅することができる。
試薬等の存在下に合成の開始点として働くオリゴヌクレ
オチドをいう。プライマーは一本鎖であることが望まし
いが、二本鎖も使用できる。もし、プライマーが二本鎖
の場合には、増幅反応に先立って一本鎖状にすることが
望ましい。プライマーは、公知の方法により合成するこ
とができるし、また、生物界から単離することもでき
る。本明細書中で核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡの一本鎖、二
本鎖およびＤＮＡとＲＮＡよりなる二本鎖を意味する。
核酸は種々の遺伝子包含体より入手できる。両端の一定
個数以上のプライマーが準備できれば、核酸は本発明に
より増幅することができる。
【００１８】また、“合成酵素”は、プライマー付加に
よる核酸を合成する酵素あるいは、かような化学合成系
を意味する。適切な合成酵素としては、Ｅ．coliのＤＮ
ＡポリメラーゼＩ、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼのク
レノーフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ．litoralis ＤＮＡポリメラー
ゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラ
ーゼそして逆転写酵素などがあるが、これらにのみ限定
されるものではない。さらに、本明細書中で使用してい
る“熱安定性”は、高温下好ましくは、６５〜９５℃で
もその活性を保持する化合物の性質を意味する。
よる核酸を合成する酵素あるいは、かような化学合成系
を意味する。適切な合成酵素としては、Ｅ．coliのＤＮ
ＡポリメラーゼＩ、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼのク
レノーフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ．litoralis ＤＮＡポリメラー
ゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラ
ーゼそして逆転写酵素などがあるが、これらにのみ限定
されるものではない。さらに、本明細書中で使用してい
る“熱安定性”は、高温下好ましくは、６５〜９５℃で
もその活性を保持する化合物の性質を意味する。
【００１９】反応液のｐＨ値は、例えばＨＬＡ typing
や遺伝子異常の検査等のgenomic ＤＮＡの解析に適し
た、血液を直接ＰＣＲ反応液に添加する系（血液直接Ｐ
ＣＲ）においては、反応液のｐＨは８．５以上の範囲、
好ましくは８．５〜９．０の範囲である。特に、ｐＨ
８．８付近の至適なｐＨのＰＣＲ反応液を用いることに
より、最大血液を２．５％含有したＰＣＲ反応液より、
ＰＣＲ産物を得ることができる。
や遺伝子異常の検査等のgenomic ＤＮＡの解析に適し
た、血液を直接ＰＣＲ反応液に添加する系（血液直接Ｐ
ＣＲ）においては、反応液のｐＨは８．５以上の範囲、
好ましくは８．５〜９．０の範囲である。特に、ｐＨ
８．８付近の至適なｐＨのＰＣＲ反応液を用いることに
より、最大血液を２．５％含有したＰＣＲ反応液より、
ＰＣＲ産物を得ることができる。
【００２０】また、ＨＩＶ provirus 等の末梢血白血球
中に少量混在するＤＮＡを検出するのに適した、採集し
た白血球に直接ＰＣＲ反応液を添加する系（溶血ＰＣ
Ｒ）においては、反応液のｐＨは８．５以上の範囲、好
ましくは８．５〜９．２の範囲に調整することにより、
ＰＣＲにより、１万個の白血球由来ＤＮＡに混入した１
００個以下のＨＩＶ ＤＮＡを検出することができる。
特に、ｐＨ９．０付近の至適なｐＨのＰＣＲ反応液を用
いることにより、１０個のＨＩＶ ＤＮＡも充分検出す
ることが可能である。
中に少量混在するＤＮＡを検出するのに適した、採集し
た白血球に直接ＰＣＲ反応液を添加する系（溶血ＰＣ
Ｒ）においては、反応液のｐＨは８．５以上の範囲、好
ましくは８．５〜９．２の範囲に調整することにより、
ＰＣＲにより、１万個の白血球由来ＤＮＡに混入した１
００個以下のＨＩＶ ＤＮＡを検出することができる。
特に、ｐＨ９．０付近の至適なｐＨのＰＣＲ反応液を用
いることにより、１０個のＨＩＶ ＤＮＡも充分検出す
ることが可能である。
【００２１】また、唾液を直接ＰＣＲ反応液に添加した
場合（唾液直接ＰＣＲ）は、反応液のｐＨは８．５以上
の範囲、好ましくはｐＨを８．８以上にすることによ
り、唾液中の細胞ＤＮＡ由来ＰＣＲ産物を安定に得るこ
とができる。特に、ＰＣＲ反応液のｐＨを９．４まで上
げることにより、８％の唾液を含有したＰＣＲ反応液か
らも十分な量のＰＣＲ産物を得ることができる。
場合（唾液直接ＰＣＲ）は、反応液のｐＨは８．５以上
の範囲、好ましくはｐＨを８．８以上にすることによ
り、唾液中の細胞ＤＮＡ由来ＰＣＲ産物を安定に得るこ
とができる。特に、ＰＣＲ反応液のｐＨを９．４まで上
げることにより、８％の唾液を含有したＰＣＲ反応液か
らも十分な量のＰＣＲ産物を得ることができる。
【００２２】なお、本発明はＰＣＲ実施者が自身で反応
液を調整して実施することもできるし、またこれらの反
応液を構成する全部あるいは一部を試薬キットにして提
供すれば、本発明の実施がより確実、容易になる。
液を調整して実施することもできるし、またこれらの反
応液を構成する全部あるいは一部を試薬キットにして提
供すれば、本発明の実施がより確実、容易になる。
【００２３】試薬キットは、ｐＨ緩衝液並びにプライマ
ー、デオキシリボヌクレオチド類及び熱安定性ポリメラ
ーゼを含み試料中の目的とする遺伝子を増幅する核酸合
成法に用いる試薬キットにおいて、当該ｐＨ緩衝液が、
当該キットを使用するＰＣＲ反応液のｐＨが２５℃の温
度条件下で８．５〜９．５となるｐＨ緩衝能力を有する
ｐＨ緩衝液としたことを特徴とする。
ー、デオキシリボヌクレオチド類及び熱安定性ポリメラ
ーゼを含み試料中の目的とする遺伝子を増幅する核酸合
成法に用いる試薬キットにおいて、当該ｐＨ緩衝液が、
当該キットを使用するＰＣＲ反応液のｐＨが２５℃の温
度条件下で８．５〜９．５となるｐＨ緩衝能力を有する
ｐＨ緩衝液としたことを特徴とする。
【００２４】本発明によれば、生体由来試料、特に動物
体液由来の試料の反応系への直接添加によってもＤＮＡ
増幅が可能となる。つまり、動物体液由来の試料、例え
ば、全血、血漿、血清又はダ液はそのまま増幅反応用の
試薬類と混合されＰＣＲサイクルが行われる。
体液由来の試料の反応系への直接添加によってもＤＮＡ
増幅が可能となる。つまり、動物体液由来の試料、例え
ば、全血、血漿、血清又はダ液はそのまま増幅反応用の
試薬類と混合されＰＣＲサイクルが行われる。
【００２５】上述のいずれの試料を用いた場合も、ＰＣ
Ｒの一工程としてＰＣＲ反応液がＤＮＡの変性の目的で
高温条件にさらされたときに、遺伝子包含体は破壊され
ＤＮＡが遊離される結果、プライマー等のＰＣＲに必要
な試薬がＤＮＡに接触可能となる。この際、ＰＣＲ反応
液中に血液成分やダ液成分等が存在するが、それにもか
かわらず、この改良されたＰＣＲ法によればＤＮＡ増幅
が生ずる。
Ｒの一工程としてＰＣＲ反応液がＤＮＡの変性の目的で
高温条件にさらされたときに、遺伝子包含体は破壊され
ＤＮＡが遊離される結果、プライマー等のＰＣＲに必要
な試薬がＤＮＡに接触可能となる。この際、ＰＣＲ反応
液中に血液成分やダ液成分等が存在するが、それにもか
かわらず、この改良されたＰＣＲ法によればＤＮＡ増幅
が生ずる。
【００２６】
［実験例１：ＰＣＲ反応液中のｐＨの測定］本例はＰＣ
Ｒ反応液中のｐＨの測定を行った実験である。表１に
は、ＰＣＲ反応液を作製するために用意した１Ｍ Tris-
HCl のｐＨ、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液（100mM Tris
-HCl,500mM KCl,15mM MgCl2 ）のｐＨ、及びＰＣＲ時に
実際使用するＰＣＲ反応液（10mM Tris-HCl,50mM KCl,
1.5mM MgCl2 ,200μM のdATP,dCTP,dGTP及びdTTP,1.0μ
M のprimer,2.5units/100 μl のTaq DNA ポリメラーゼ
（TaKaRa Taq: Takara shuzo,Kyoto,Japan) のｐＨを示
している。なお、ＰＣＲのプライマーはヒトbeta-globi
n coding region 内に位置するplus鎖の塩基配列を持つ
オリゴヌクレオチド（Ｐ１）及び minus鎖の塩基配列を
持つオリゴヌクレオチド（Ｐ２）であり、ＰＣＲにより
408bpの増幅産物を得ることができる（Saiki,R.K.,Gel
fand,D.H.,,Stoffel,S.,Scharf,S.J.,Higuchi,R.,Horn,
G.T.,Mullis,K.B. and Erlich,H.A.(1988) Science 23
9,487-491.)。
Ｒ反応液中のｐＨの測定を行った実験である。表１に
は、ＰＣＲ反応液を作製するために用意した１Ｍ Tris-
HCl のｐＨ、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液（100mM Tris
-HCl,500mM KCl,15mM MgCl2 ）のｐＨ、及びＰＣＲ時に
実際使用するＰＣＲ反応液（10mM Tris-HCl,50mM KCl,
1.5mM MgCl2 ,200μM のdATP,dCTP,dGTP及びdTTP,1.0μ
M のprimer,2.5units/100 μl のTaq DNA ポリメラーゼ
（TaKaRa Taq: Takara shuzo,Kyoto,Japan) のｐＨを示
している。なお、ＰＣＲのプライマーはヒトbeta-globi
n coding region 内に位置するplus鎖の塩基配列を持つ
オリゴヌクレオチド（Ｐ１）及び minus鎖の塩基配列を
持つオリゴヌクレオチド（Ｐ２）であり、ＰＣＲにより
408bpの増幅産物を得ることができる（Saiki,R.K.,Gel
fand,D.H.,,Stoffel,S.,Scharf,S.J.,Higuchi,R.,Horn,
G.T.,Mullis,K.B. and Erlich,H.A.(1988) Science 23
9,487-491.)。
【００２７】 Ｐ１：５′ＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＴＡＣ
３′ Ｐ２：５′ＧＧＡＡＡＡＴＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＧＣＡ
Ｇ３′ 表１から通常ＰＣＲ反応液に用いられているｐＨ８．３
の Tris-HCl を緩衝液として、１０倍濃度のＰＣＲ用緩
衝液を作製した時のｐＨは８．３であるが、ＰＣＲ時に
実際に使用するＰＣＲ反応液のｐＨとしては、８．１ま
で低下している。同様にｐＨ８．５からｐＨ１０．０の
ｐＨ範囲の Tris-HCl を緩衝液として使用した場合、１
０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液のｐＨは、用いた Tris-HCl
のｐＨとほぼ同じであるが、ＰＣＲ時に実際に使用する
ＰＣＲ反応液のｐＨは、０．２〜０．８の範囲で低下が
見られた。また、ＨＣｌを添加しない１Ｍ Tris のｐＨ
は、１１であるが、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液を作製
した時のｐＨは、１０．２、ＰＣＲ反応液を作製した時
のｐＨは９．４まで低下した。
３′ Ｐ２：５′ＧＧＡＡＡＡＴＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＧＣＡ
Ｇ３′ 表１から通常ＰＣＲ反応液に用いられているｐＨ８．３
の Tris-HCl を緩衝液として、１０倍濃度のＰＣＲ用緩
衝液を作製した時のｐＨは８．３であるが、ＰＣＲ時に
実際に使用するＰＣＲ反応液のｐＨとしては、８．１ま
で低下している。同様にｐＨ８．５からｐＨ１０．０の
ｐＨ範囲の Tris-HCl を緩衝液として使用した場合、１
０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液のｐＨは、用いた Tris-HCl
のｐＨとほぼ同じであるが、ＰＣＲ時に実際に使用する
ＰＣＲ反応液のｐＨは、０．２〜０．８の範囲で低下が
見られた。また、ＨＣｌを添加しない１Ｍ Tris のｐＨ
は、１１であるが、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液を作製
した時のｐＨは、１０．２、ＰＣＲ反応液を作製した時
のｐＨは９．４まで低下した。
【００２８】そこで、次に、ＰＣＲ反応液のｐＨを８．
１〜９．４のあいだで、０．２〜０．３づつ変化させた
ＰＣＲ反応液を作製し、血液または唾液を直接添加し、
それらの体液中に含まれている細胞中のＤＮＡをターゲ
ットとして、ＰＣＲを試みた。
１〜９．４のあいだで、０．２〜０．３づつ変化させた
ＰＣＲ反応液を作製し、血液または唾液を直接添加し、
それらの体液中に含まれている細胞中のＤＮＡをターゲ
ットとして、ＰＣＲを試みた。
【００２９】
【表１】 ［実験例２：血液直接ＰＣＲ］ヒト血液を試料として用
いた。種々のｐＨのＰＣＲ反応液に、ヒト血液を１０〜
０．６３μｌを添加し（全 100μｌ）、ＰＣＲを行っ
た。ＰＣＲ反応液は、実験例１で作製したものを使用し
た。ＰＣＲは、９４℃、２分のプレヒーティングの後、
９４℃ １分間、５５℃１分間、７２℃ １分間の条件
で４０サイクル、最後に７２℃ ７分間のポリメライゼ
ーションを行った。ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを用い
て、３％アガロースを含む、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチ
ジウム添加ＴＡＥ（40mM Tris-acetate,1mM EDTA,pH8.
0) 液中で電気泳動を行い検出した。
いた。種々のｐＨのＰＣＲ反応液に、ヒト血液を１０〜
０．６３μｌを添加し（全 100μｌ）、ＰＣＲを行っ
た。ＰＣＲ反応液は、実験例１で作製したものを使用し
た。ＰＣＲは、９４℃、２分のプレヒーティングの後、
９４℃ １分間、５５℃１分間、７２℃ １分間の条件
で４０サイクル、最後に７２℃ ７分間のポリメライゼ
ーションを行った。ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを用い
て、３％アガロースを含む、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチ
ジウム添加ＴＡＥ（40mM Tris-acetate,1mM EDTA,pH8.
0) 液中で電気泳動を行い検出した。
【００３０】本実験の電気泳動図を図１に示す。図中Ｍ
は分子量マーカー（制限酵素HincIIで切断した 250ngの
φＸ174RFDNA）、１はヒト血液１０μｌ添加、２は５μ
ｌ添加、３は２．５μｌ添加、４は１．２５μｌ添加、
５は０．６３μｌ添加、６は０μｌの泳動レーンを示
す。
は分子量マーカー（制限酵素HincIIで切断した 250ngの
φＸ174RFDNA）、１はヒト血液１０μｌ添加、２は５μ
ｌ添加、３は２．５μｌ添加、４は１．２５μｌ添加、
５は０．６３μｌ添加、６は０μｌの泳動レーンを示
す。
【００３１】ｐＨ８．３の１Ｍ Tris-HCl を用いて作製
した標準的なＰＣＲ反応液（ｐＨ８．１）を用いてＰＣ
Ｒを行った場合、添加したいずれの量の血液からも、be
ta-globin 特異的なＰＣＲ産物を得ることができなかっ
た（図１中Ａ）。さらに、それよりｐＨが０．２高いＰ
ＣＲ反応液を用いた場合も、いずれの添加量の血液から
も特異的なＰＣＲ産物を得ることができなかった（図１
中Ｂ）。しかし、ｐＨ８．５のＰＣＲ反応液を使用する
ことにより、２．５μｌおよび１．２５μｌの血液を添
加した場合に、特異的なＰＣＲ産物を得ることができた
（図１中Ｃ）。さらにｐＨ８．８およびｐＨ９．０のＰ
ＣＲ反応液を使用することにより、それぞれ２．５〜
０．６３μｌ（図１中Ｄ），１．２５〜０．６３μｌ
（図１中Ｅ）の範囲の血液を添加した場合に、特異的な
ＰＣＲ産物を得ることができた。
した標準的なＰＣＲ反応液（ｐＨ８．１）を用いてＰＣ
Ｒを行った場合、添加したいずれの量の血液からも、be
ta-globin 特異的なＰＣＲ産物を得ることができなかっ
た（図１中Ａ）。さらに、それよりｐＨが０．２高いＰ
ＣＲ反応液を用いた場合も、いずれの添加量の血液から
も特異的なＰＣＲ産物を得ることができなかった（図１
中Ｂ）。しかし、ｐＨ８．５のＰＣＲ反応液を使用する
ことにより、２．５μｌおよび１．２５μｌの血液を添
加した場合に、特異的なＰＣＲ産物を得ることができた
（図１中Ｃ）。さらにｐＨ８．８およびｐＨ９．０のＰ
ＣＲ反応液を使用することにより、それぞれ２．５〜
０．６３μｌ（図１中Ｄ），１．２５〜０．６３μｌ
（図１中Ｅ）の範囲の血液を添加した場合に、特異的な
ＰＣＲ産物を得ることができた。
【００３２】以上の結果は、ＰＣＲ反応液を通常使用さ
れているｐＨの範囲を超えて調整することにより、ＰＣ
Ｒ反応液に直接血液を添加しても、ＰＣＲによる増幅が
可能となる事を示している。さらにその場合の反応液の
至適ｐＨは８．８付近であることが同時に示される。
れているｐＨの範囲を超えて調整することにより、ＰＣ
Ｒ反応液に直接血液を添加しても、ＰＣＲによる増幅が
可能となる事を示している。さらにその場合の反応液の
至適ｐＨは８．８付近であることが同時に示される。
【００３３】［実験例３：溶血ＰＣＲ］ヒト血液２３．
７μｌ（１．４×１０5 ＷＢＣ）を溶血した後、遠心
し、上清を取り除き、白血球を回収した。回収した白血
球に、ＨＩＶ ＤＮＡ（1000,100,10 ,0）および種々の
ｐＨのＰＣＲ反応液を添加し（全 100μｌ）、ＰＣＲを
行った。ＰＣＲ反応液は、プライマーをＨＩＶ pol reg
ion 内に位置するplus鎖の塩基配列を持つオリゴヌクレ
オチド（Ｐ３）及び minus鎖の塩基配列を持つオリゴヌ
クレオチド（Ｐ４）に代えた以外は、実験例１で作製し
たものを使用し、ＰＣＲ及び検出は実験例２と同様に行
った。
７μｌ（１．４×１０5 ＷＢＣ）を溶血した後、遠心
し、上清を取り除き、白血球を回収した。回収した白血
球に、ＨＩＶ ＤＮＡ（1000,100,10 ,0）および種々の
ｐＨのＰＣＲ反応液を添加し（全 100μｌ）、ＰＣＲを
行った。ＰＣＲ反応液は、プライマーをＨＩＶ pol reg
ion 内に位置するplus鎖の塩基配列を持つオリゴヌクレ
オチド（Ｐ３）及び minus鎖の塩基配列を持つオリゴヌ
クレオチド（Ｐ４）に代えた以外は、実験例１で作製し
たものを使用し、ＰＣＲ及び検出は実験例２と同様に行
った。
【００３４】 Ｐ３：５´ＣＡＴＧＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＣＡＣＡＡＡ
ＧＧ３´ Ｐ４：５´ＴＣＴＡＣＴＴＧＴＣＣＡＴＧＣＡＴＧＧＣ
ＴＴＣ３´ なお、これらのプライマーを用いることにより、ＰＣＲ
により 244bpの増幅産物を得ることができる（Simmond
s,P.et.al.(1990) J.Virol.64,864-872）。実験結果は
図２に示した通りである。図中Ｍは分子量マーカー（実
験例２と同様のもの）、１はHIV DNA 1000 copies,２は
100 copies, ３は10 copies,４は0 copiesを添加した泳
動レーンである。
ＧＧ３´ Ｐ４：５´ＴＣＴＡＣＴＴＧＴＣＣＡＴＧＣＡＴＧＧＣ
ＴＴＣ３´ なお、これらのプライマーを用いることにより、ＰＣＲ
により 244bpの増幅産物を得ることができる（Simmond
s,P.et.al.(1990) J.Virol.64,864-872）。実験結果は
図２に示した通りである。図中Ｍは分子量マーカー（実
験例２と同様のもの）、１はHIV DNA 1000 copies,２は
100 copies, ３は10 copies,４は0 copiesを添加した泳
動レーンである。
【００３５】図２より、ｐＨ８．３の１Ｍ Tris-HCl を
用いて作製した標準的なＰＣＲ反応液（ｐＨ８．１）を
用いてＰＣＲを行った場合、添加したいずれの量のＨＩ
ＶＤＮＡからも特異的なＰＣＲ産物を得ることができな
かった（図２中Ａ）。さらに、それよりｐＨが０．２高
いＰＣＲ反応液を用いた場合、1000 copies のＨＩＶ
ＤＮＡを添加したときのみ、特異的なＰＣＲ産物を得る
ことができた（図２中Ｂ）。さらに高いｐＨの反応液を
用いた場合、ｐＨ９．０までの範囲内において、ｐＨの
上昇にともない感度の上昇が認められた。すなわち、ｐ
Ｈ８．５のＰＣＲ反応液を使用することにより、100 co
piesまでの（図２中Ｃ）、ｐＨ８．８およびｐＨ９．０
のＰＣＲ反応液を使用することにより、10 copies まで
の（図２中Ｄ，Ｅ）、ＨＩＶ ＤＮＡをＰＣＲ後の電気
泳動により検出できた。
用いて作製した標準的なＰＣＲ反応液（ｐＨ８．１）を
用いてＰＣＲを行った場合、添加したいずれの量のＨＩ
ＶＤＮＡからも特異的なＰＣＲ産物を得ることができな
かった（図２中Ａ）。さらに、それよりｐＨが０．２高
いＰＣＲ反応液を用いた場合、1000 copies のＨＩＶ
ＤＮＡを添加したときのみ、特異的なＰＣＲ産物を得る
ことができた（図２中Ｂ）。さらに高いｐＨの反応液を
用いた場合、ｐＨ９．０までの範囲内において、ｐＨの
上昇にともない感度の上昇が認められた。すなわち、ｐ
Ｈ８．５のＰＣＲ反応液を使用することにより、100 co
piesまでの（図２中Ｃ）、ｐＨ８．８およびｐＨ９．０
のＰＣＲ反応液を使用することにより、10 copies まで
の（図２中Ｄ，Ｅ）、ＨＩＶ ＤＮＡをＰＣＲ後の電気
泳動により検出できた。
【００３６】また、ｐＨ８．８およびｐＨ９．０のＰＣ
Ｒ反応液を使用した時のＰＣＲ産物の量を増幅バンドの
濃さで比較すると、ｐＨ９．０反応液使用時の方が多か
った。さらにＰＣＲ反応液のｐＨを９．２まで上げる
と、ＤＮＡ 1000 copies添加時においては濃い増幅バン
ドが得られたが、100 copies添加時の増幅バンドの濃さ
は極めて薄かった。
Ｒ反応液を使用した時のＰＣＲ産物の量を増幅バンドの
濃さで比較すると、ｐＨ９．０反応液使用時の方が多か
った。さらにＰＣＲ反応液のｐＨを９．２まで上げる
と、ＤＮＡ 1000 copies添加時においては濃い増幅バン
ドが得られたが、100 copies添加時の増幅バンドの濃さ
は極めて薄かった。
【００３７】以上の結果は、ＰＣＲ反応液を通常使用さ
れているｐＨの範囲を超えて調整することにより、回収
した末梢血白血球にＰＣＲ反応液を直接添加しても、Ｐ
ＣＲによる増幅が可能となる事を示している。さらにそ
の場合の反応液の至適ｐＨは９．０付近であることが同
時に示される。
れているｐＨの範囲を超えて調整することにより、回収
した末梢血白血球にＰＣＲ反応液を直接添加しても、Ｐ
ＣＲによる増幅が可能となる事を示している。さらにそ
の場合の反応液の至適ｐＨは９．０付近であることが同
時に示される。
【００３８】［実験例４：ヒト唾液ＰＣＲ］ヒト唾液を
試料として用いた。種々のｐＨのＰＣＲ反応液に、ヒト
唾液を４〜０．５μｌ添加し（全５０μｌ）、ＰＣＲを
行った。ＰＣＲ反応液は、実験例１で作製したものを使
用した。また、ＰＣＲおよび検出は実験例２と同様に行
った。実験結果は図３に示した通りである。図中Ｍは分
子量マーカー（実験例２と同様のもの）、１はヒト唾液
を４μｌ添加、２は２μｌ添加、３は１μｌ添加、４は
０．５μｌ添加、５は０μｌの泳動レーンを示す。
試料として用いた。種々のｐＨのＰＣＲ反応液に、ヒト
唾液を４〜０．５μｌ添加し（全５０μｌ）、ＰＣＲを
行った。ＰＣＲ反応液は、実験例１で作製したものを使
用した。また、ＰＣＲおよび検出は実験例２と同様に行
った。実験結果は図３に示した通りである。図中Ｍは分
子量マーカー（実験例２と同様のもの）、１はヒト唾液
を４μｌ添加、２は２μｌ添加、３は１μｌ添加、４は
０．５μｌ添加、５は０μｌの泳動レーンを示す。
【００３９】ｐＨ８．３の１Ｍ Tris-HCl 用いて作製し
た標準的なＰＣＲ反応液（ｐＨ８．１）を用いてＰＣＲ
を行った場合、添加したいずれの量の唾液からも、beta
-globin 特異的なＰＣＲ産物を得ることができなかった
（図３中Ａ）。さらに、ｐＨ８．３のＰＣＲ反応液を用
いた場合、０．５μｌの唾液を添加した場合のみ特異的
なＰＣＲ産物を得ることができた（図１中Ｂ）が、ｐＨ
８．５のＰＣＲ反応液を用いた場合、再びＰＣＲ産物を
検出することができなくなった（図１中Ｃ）。しかし、
ｐＨ８．８以上のＰＣＲ反応液を使用した場合、ｐＨの
上昇にともなって、ＰＣＲ産物が広い添加量の範囲で、
検出できるようになった。すなわち、ｐＨ８．８および
９．０のＰＣＲ反応液を使用した場合、０．５μｌ唾液
添加時のみならず、それ以上の量の唾液添加時において
も、検出可能な量のＰＣＲ産物が生成された（図１中
Ｄ、Ｅ）。さらにＰＣＲ反応液のｐＨを上昇させるとと
もに、生成されるＰＣＲ産物量は増大し、ＨＣｌを添加
しない１Ｍ Tris を用いて作成したＰＣＲ反応液（ｐＨ
９．４）を用いてＰＣＲを行った場合、いずれの添加量
の唾液においても、電気泳動により検出するのに十分な
量のＰＣＲ産物が生成できた（図１中Ｇ）。
た標準的なＰＣＲ反応液（ｐＨ８．１）を用いてＰＣＲ
を行った場合、添加したいずれの量の唾液からも、beta
-globin 特異的なＰＣＲ産物を得ることができなかった
（図３中Ａ）。さらに、ｐＨ８．３のＰＣＲ反応液を用
いた場合、０．５μｌの唾液を添加した場合のみ特異的
なＰＣＲ産物を得ることができた（図１中Ｂ）が、ｐＨ
８．５のＰＣＲ反応液を用いた場合、再びＰＣＲ産物を
検出することができなくなった（図１中Ｃ）。しかし、
ｐＨ８．８以上のＰＣＲ反応液を使用した場合、ｐＨの
上昇にともなって、ＰＣＲ産物が広い添加量の範囲で、
検出できるようになった。すなわち、ｐＨ８．８および
９．０のＰＣＲ反応液を使用した場合、０．５μｌ唾液
添加時のみならず、それ以上の量の唾液添加時において
も、検出可能な量のＰＣＲ産物が生成された（図１中
Ｄ、Ｅ）。さらにＰＣＲ反応液のｐＨを上昇させるとと
もに、生成されるＰＣＲ産物量は増大し、ＨＣｌを添加
しない１Ｍ Tris を用いて作成したＰＣＲ反応液（ｐＨ
９．４）を用いてＰＣＲを行った場合、いずれの添加量
の唾液においても、電気泳動により検出するのに十分な
量のＰＣＲ産物が生成できた（図１中Ｇ）。
【００４０】以上の結果は、唾液においても、ＰＣＲ反
応液を通常使用されているｐＨの範囲を超えて調整する
ことにより、ＰＣＲ反応液に直接唾液を添加しても、Ｐ
ＣＲによる増幅が可能となる事を示している。さらにそ
の場合の反応液の至適ｐＨは９．４以上であることが同
時に示される。
応液を通常使用されているｐＨの範囲を超えて調整する
ことにより、ＰＣＲ反応液に直接唾液を添加しても、Ｐ
ＣＲによる増幅が可能となる事を示している。さらにそ
の場合の反応液の至適ｐＨは９．４以上であることが同
時に示される。
【００４１】
【発明の効果】本発明により、生体由来の試料から粗分
離した遺伝子包含体を核酸合成用反応液系に直接添加し
ても、効率良く、目的の遺伝子を合成することが可能と
なる。従って、核酸合成の際の核酸を含む試料の前処理
が簡便、迅速におこなえるようになる。特に血液試料の
前処理が簡便、迅速におこなえるようになる。
離した遺伝子包含体を核酸合成用反応液系に直接添加し
ても、効率良く、目的の遺伝子を合成することが可能と
なる。従って、核酸合成の際の核酸を含む試料の前処理
が簡便、迅速におこなえるようになる。特に血液試料の
前処理が簡便、迅速におこなえるようになる。
【００４２】また、本発明により、遺伝子包含体を含有
する生体由来試料を直接核酸合成用反応液系に添加し
て、目的の遺伝子を効率良く合成することが可能とな
る。
する生体由来試料を直接核酸合成用反応液系に添加し
て、目的の遺伝子を効率良く合成することが可能とな
る。
【００４３】更に、上述の試薬キットを使用すれば、本
発明にかかる改良ＰＣＲ法が容易に実施される結果、本
発明の効果である前処理の簡略化とあいまって、ＰＣＲ
法が簡便に行なえるようになる。
発明にかかる改良ＰＣＲ法が容易に実施される結果、本
発明の効果である前処理の簡略化とあいまって、ＰＣＲ
法が簡便に行なえるようになる。
【００４４】
配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列： ＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＴＡＣ
【００４５】配列番号：２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列： ＧＧＡＡＡＡＴＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＧＣＡＧ
【００４６】配列番号：３ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列： ＣＡＴＧＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＣＡＣＡＡＡＧＧ
【００４７】配列番号：４ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列： ＴＣＴＡＣＴＴＧＴＣＣＡＴＧＣＡＴＧＧＣＴＴＣ
【図１】図１は、実験例２で増幅されたＤＮＡを検出す
るために用いたゲル電気泳動の泳動図である。
るために用いたゲル電気泳動の泳動図である。
【図２】図２は、実験例３で増幅されたＤＮＡを検出す
るために用いたゲル電気泳動の泳動図である。
るために用いたゲル電気泳動の泳動図である。
【図３】図３は、実験例４で増幅されたＤＮＡを検出す
るために用いたゲル電気泳動の泳動図である。
るために用いたゲル電気泳動の泳動図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｑ 1/70 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/70 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ Ｇ Ｆ
Claims (2)
- 【請求項１】 生体由来試料中の遺伝子包含体もしくは
生体由来試料そのものと遺伝子増幅反応液を混合し反応
させる核酸合成法において、２５℃における前記反応液
のｐＨを８．５〜９．５にしたことを特徴とする核酸合
成法。 - 【請求項２】 ｐＨ緩衝液並びにプライマー、デオキシ
リボヌクレオチド類及び熱安定性ポリメラーゼを含み試
料中の目的とする遺伝子を増幅する核酸合成法に用いる
試薬キットにおいて、当該ｐＨ緩衝液が、当該キットを
使用する遺伝子増幅反応液のｐＨが２５℃の温度条件下
で８．５〜９．５となるｐＨ緩衝能力を有するｐＨ緩衝
液としたことを特徴とする核酸合成法に用いる試薬キッ
ト。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05157396A JP3452717B2 (ja) | 1996-03-08 | 1996-03-08 | 核酸合成法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05157396A JP3452717B2 (ja) | 1996-03-08 | 1996-03-08 | 核酸合成法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09238687A true JPH09238687A (ja) | 1997-09-16 |
| JP3452717B2 JP3452717B2 (ja) | 2003-09-29 |
Family
ID=12890705
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP05157396A Expired - Lifetime JP3452717B2 (ja) | 1996-03-08 | 1996-03-08 | 核酸合成法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3452717B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004104196A1 (ja) * | 2003-05-20 | 2004-12-02 | G & G Science Co., Ltd. | 緩衝剤組成物 |
| WO2006054690A1 (ja) * | 2004-11-19 | 2006-05-26 | Shimadzu Corporation | 遺伝子多型検出方法、診断方法、並びにそのための装置及び検査試薬キット |
| JPWO2004104196A1 (ja) * | 2003-05-20 | 2006-07-20 | Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社 | 緩衝剤組成物 |
| US8168135B2 (en) | 2006-11-01 | 2012-05-01 | Shimadzu Corporation | Reaction container plate and its reaction processing equipment |
| US8293521B2 (en) | 2005-03-30 | 2012-10-23 | Shimadzu Corporation | Method of dispensing nonvolatile liquid in reaction vessel and reaction vessel processing apparatus |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1944364B1 (en) | 2005-11-02 | 2012-09-12 | Shimadzu Corporation | Rna extraction method and rna detection method |
| US9550184B2 (en) | 2007-02-05 | 2017-01-24 | Shimadzu Corporation | Reactor plate and reaction processing method |
| WO2008108027A1 (ja) | 2007-03-02 | 2008-09-12 | Shimadzu Corporation | 反応容器プレート及び反応処理装置 |
| WO2008132871A1 (ja) | 2007-04-13 | 2008-11-06 | Shimadzu Corporation | 反応容器プレート及び反応処理方法 |
| US8076129B2 (en) | 2007-07-26 | 2011-12-13 | Shimadzu Corporation | Reactor plate and reaction processing method |
| JP4872921B2 (ja) * | 2008-01-07 | 2012-02-08 | 株式会社島津製作所 | 反応容器 |
| JP4872922B2 (ja) * | 2008-01-07 | 2012-02-08 | 株式会社島津製作所 | 反応容器 |
| JP4872923B2 (ja) * | 2008-01-07 | 2012-02-08 | 株式会社島津製作所 | 反応容器 |
| JP4946918B2 (ja) * | 2008-02-28 | 2012-06-06 | 株式会社島津製作所 | 反応容器プレート及び反応処理方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06277062A (ja) * | 1992-09-11 | 1994-10-04 | F Hoffmann La Roche Ag | 血液試料中の核酸の増幅および検出 |
| JPH099967A (ja) * | 1995-06-28 | 1997-01-14 | Shimadzu Corp | 核酸合成法 |
-
1996
- 1996-03-08 JP JP05157396A patent/JP3452717B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06277062A (ja) * | 1992-09-11 | 1994-10-04 | F Hoffmann La Roche Ag | 血液試料中の核酸の増幅および検出 |
| JPH099967A (ja) * | 1995-06-28 | 1997-01-14 | Shimadzu Corp | 核酸合成法 |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004104196A1 (ja) * | 2003-05-20 | 2004-12-02 | G & G Science Co., Ltd. | 緩衝剤組成物 |
| JPWO2004104196A1 (ja) * | 2003-05-20 | 2006-07-20 | Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社 | 緩衝剤組成物 |
| WO2006054690A1 (ja) * | 2004-11-19 | 2006-05-26 | Shimadzu Corporation | 遺伝子多型検出方法、診断方法、並びにそのための装置及び検査試薬キット |
| JPWO2006054690A1 (ja) * | 2004-11-19 | 2008-06-05 | 株式会社島津製作所 | 遺伝子多型検出方法、診断方法、並びにそのための装置及び検査試薬キット |
| JP4742050B2 (ja) * | 2004-11-19 | 2011-08-10 | 株式会社島津製作所 | 検査試薬キットとそれを用いる遺伝子多型検出装置 |
| US8293521B2 (en) | 2005-03-30 | 2012-10-23 | Shimadzu Corporation | Method of dispensing nonvolatile liquid in reaction vessel and reaction vessel processing apparatus |
| US8168135B2 (en) | 2006-11-01 | 2012-05-01 | Shimadzu Corporation | Reaction container plate and its reaction processing equipment |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3452717B2 (ja) | 2003-09-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5543305A (en) | Methods of extracting deoxyribonucleic acids without using a proteolytic enzyme | |
| US5935825A (en) | Process and reagent for amplifying nucleic acid sequences | |
| JP5249581B2 (ja) | 核酸の単離および増幅方法 | |
| US8785130B2 (en) | Use of markers including nucleotide sequence based codes to monitor methods of detection and identification of genetic material | |
| Robertson et al. | An introduction to PCR primer design and optimization of amplification reactions | |
| JPH02292298A (ja) | 全血またはｐｂｍｃ画分由来の核酸の抽出、増幅および測定方法 | |
| JP2007537746A (ja) | ２つの異なるアニーリング温度を示すｐｃｒ時におけるアンプリコン混入の検出方法 | |
| JP3452717B2 (ja) | 核酸合成法 | |
| JP2021000138A (ja) | 診断方法及び組成物 | |
| CN100429307C (zh) | 核酸检测方法及其系统 | |
| US20020102660A1 (en) | Method for synthesis of nucleic acids | |
| EP0751226B1 (en) | Process for amplifying nucleic acid sequences | |
| JPH1080280A (ja) | 核酸合成法 | |
| JP4503712B2 (ja) | 核酸合成法 | |
| CA2297547C (en) | An improved method for preparing dna from serum and plasma | |
| JP4186269B2 (ja) | 核酸合成法 | |
| JP4186270B2 (ja) | 核酸合成法 | |
| CN109312397B (zh) | Penta E基因座多态性人体鉴定 | |
| JP4629167B2 (ja) | 核酸合成法 | |
| JP4130487B2 (ja) | 核酸の同時増幅方法 | |
| JP2001008685A (ja) | 核酸合成法 | |
| Hilborne et al. | Diagnostic applications of recombinant nucleic acid technology: basic techniques | |
| JPH09187277A (ja) | 鋳型として全血液を用いた核酸の直接的ｐｃｒ増幅法 | |
| RU2164532C1 (ru) | Способы и наборы реагентов для генамплификационной диагностики методами пцр и рнк-пцр | |
| JP4187057B2 (ja) | 核酸合成法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080718 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090718 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100718 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100718 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110718 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110718 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120718 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120718 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130718 Year of fee payment: 10 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |