JPH02292298A - 全血またはｐｂｍｃ画分由来の核酸の抽出、増幅および測定方法 - Google Patents

全血またはｐｂｍｃ画分由来の核酸の抽出、増幅および測定方法

Info

Publication number
JPH02292298A
JPH02292298A JP2097789A JP9778990A JPH02292298A JP H02292298 A JPH02292298 A JP H02292298A JP 2097789 A JP2097789 A JP 2097789A JP 9778990 A JP9778990 A JP 9778990A JP H02292298 A JPH02292298 A JP H02292298A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acids
nucleic acid
sample
cells
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2097789A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH072120B2 (ja
Inventor
Brent Arthur Burdick
ブレント　アーサー　バーディック
Tobias D Ekeze
トバイアス　デイブィス　イークゼ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eastman Kodak Co
Original Assignee
Eastman Kodak Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eastman Kodak Co filed Critical Eastman Kodak Co
Publication of JPH02292298A publication Critical patent/JPH02292298A/ja
Publication of JPH072120B2 publication Critical patent/JPH072120B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/803—Physical recovery methods, e.g. chromatography, grinding
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、全血またはそれらの末梢血単核細胞画分のい
ずれかに由来するＤＮＡのような核酸を迅速に抽出する
方法に関する。本発明はまた、診断の目的で抽出された
核酸を増幅または検出するための方法にも関する。
〔従来の技術〕
生物学的診断分野の研究および分析方法では、生物学的
被検体、例えば全血またはその両分に由来する核酸の調
査が必要である。このような試験管内法では、第一段階
として核酸の単離が必要である。例えば、遺伝子疾患に
ついての試験を実施するにはゲノムＤＮＡの相当純粋な
試料が必要であり、組換え技術はベクターＤ　Ｎ　Ａと
クローン化されるＤＮＡとの単離が必要である。細菌お
よびウイルス感染細胞のような感染体の検出によるＤＮ
Ａ診断法では、一般に細胞を溶解し、次いで放出された
ＩＩＪΔを検出することが必要である。
一般的に、ＤＮＡは細胞内で遊離の分子として存在しな
いで、むしろＤＮＡ，　ＲＮＡおよびタンパク質の会合
複合体として存在する。このことは、遺伝情報のキャリ
ャーとしての役割の重要さならびにその機能におけるＲ
ＮＡおよび各種タンパク質との関連性にある。
被検体における他の物質とＤＮＡのこの複雑な会合性の
ために、効率的なＤＮＡ抽出では、ＤＮＡが破砕された
細胞壁および細胞膜から放出され、ＤＮＡ一タンパク質
複合体が変性またはタンパク質分解によって解離され、
そして他の高分子からＤＮＡが分離されることを必要と
する。当該技術分野では多様な手段が使用され、これら
の結果の１以上が達成されている。細胞溶解は、例えば
、凍結一解氷、超音波手段、剪断および他の機械的技法
によって達成されるか、あるいは酵素、界面活性剤また
はキレート剤による処理によって達成されている。プロ
テアーゼおよびその他の加水分解性試薬を使用して、タ
ンパク質からＤＮＡを解離することができる。残存する
タンパク質や他の高分子は、フェノールまたは他のアル
コール類のような各種溶媒を用いて抽出することができ
る。
いくつかのＤＮＡ単離方法は、例えば、ヨーロッパ特許
公開第１４５３５６号、同２４０１９１号および同２４
５９４５号公報に記載されており、これらの全ては、特
定の調製段階でアルコールと酵素的タンパク質分解剤を
使用する。一般的に、これらの手順はウイルスＤＮＡの
抽出に向けられており、人手可能なＤＮＡのすべてを得
るには精確に実施されねばならない。従って、殆どの既
知方法は労働集約的であり、好ましくない溶媒の使用を
要し、さらに簡単に自動化されない。
目的の核酸の単離または抽出には、ポリメラーゼ連鎖反
応を使用する核酸の増幅および検出についての最近の開
発の長所を取り入れることが必要である。米国特許第４
．　６８３，　１９５号および同４，　６８３．　２０
２号明細書は、ポリメラーゼを使用する多様な生物学的
被検体で見い出される核酸のための利用可能な増幅方法
や検出方法を記載する。標準的な核酸抽出法は、Ｍａｎ
ｉａｔｉｓらの、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏｎｌｎｇ
　　：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋ　：　Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｌｎｇＨａｒｂ
ｏｒ　Ｌａｂｏ（ａｔｏｒｙ，　１９８２）、２８０〜
２８１ページの参照文献に記載されている。この文献は
、細胞溶解にプロテアーゼの使用とフェノール／クロロ
ホルム抽出を含む標準的な抽出方法に向けられており、
全工程を行うには一般に長時間かかり、危険な有機溶媒
の使用を伴う。また、それは、Ｎｕｎｂｅｒｇら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，　　７５
（１１）．　　５５５３〜５５５６ページ（１９７８）
によればハムスターの卵巣細胞から、Ｓａｉｋｉ　　ら
、Ｂｉｏ　／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　３−．　　１０
０８　〜１０１２ページ（１９８５）によれば全血被検
体のバツフイーコートから、そしてＢｅｌｌら、Ｐｒｏ
ｃ，　Ｎａｔｌ，　Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ，　７Ｂ
（９）　、５７５９〜５７６３ページ（１９８１）によ
れば全血からＤＮＡを抽出するためにも使用されている
。
商業的に実施可能である診断試験では、さらに経済的な
競争性をも有するものでなければならない。このことは
、手順の各態様が単純であり、使用が容易である程度自
動化されねばならないことを意味する。被検体からのＤ
ＮＡの抽出は、被検体由来の最大量のＤＮＡを得、なら
びに経済的な利益を得るために慎重な開発を必要とずる
１態様である。さらに、診断結果が早急に必要とされる
状況下では、抽出法は迅速であらねばならない。
従って、前述の冗長で時間のかかる工程と有機溶媒の使
用を必要としない改良ＤＮＡ抽出方法を開発するために
相当な研究がなされてきた。こうして、Ｋｏｇａｎ　　
らの、Ｎ，Ｅｎｇ，Ｊ，Ｍｅｄ．．　　３１７（１６）
、９８５〜９９０ページ（１９８７）は、遠心によって
全血から採取された細胞を煮沸することで遺伝子疾患を
検出するための抽出を記載する。次に、抽出されたＤＮ
Ａが増幅されている。
同様に、Ｓａｉｋｉ　らの、Ｎａｔｕｒｅ，　３２４．
　１６３　〜１．６６ページ（１９８６）は、全血のバ
ッフィーコート　（末梢血単核細胞と穎粒球を含む）を
煮沸してβ−グロビンＤＮＡを増幅することを記載する
。ヨーロ・ノバ公開２３７３６２号公報で鎌状赤血球お
よびＨＬＡ　ＯＮ八の検出に関して、同様な仕事が示さ
れている。いくつかのケースでは、バツフイーコートの
細胞が加熱段階に先立って鉱油で上塗りされている。
〔発明が解決しようとする課題〕
これらの方法は、前述の冗長なフェノール／クロロホル
ノ、抽出を避け明らかに迅速（数分で行える）であるが
、全血試料中に多量に存在するＤＮＡ、例えばＨＬＡま
たはβ−グロビンＤＮＡの抽出に非常に有用であるにす
ぎない。多くの感染体く例えば、ウイルス〉が存在する
ケースのように目的のＤＮＡが非常に少量存在する場合
には、全血またはバッフィーコート画分からの抽出でさ
らなる改良が好感度検出にとって必要である。さらに、
増幅に先立って全血から除去することが必要でもあるポ
リメラーゼ活性に対する多くの妨害物質も存在する。
最近では、冗長なフェノール／クロロホルム法の欠点が
非イオン溶菌性洗剤とタンパク質分解酵素を含有する組
成物の使用によって取り除かれている。この方法の原理
的な長所の一つは、２時間未満にＤＮＡ抽出の時間が短
縮されていることである。
この改良は当該技術分野で歓迎されているとはいえ、依
然として、なお一層簡単なＤＮＡ抽出方法が、特に被検
体中にＤＮＡが非常に低濃度で存在する場合には必要で
ある。就中、全血やそれらの末梢血単核両分に由来する
ＨＩＶ−Ｉ　ＤＮＡの迅速かつ効率的な抽出方法に対す
る欲求が存在する。
〔諌題を解決するための手段〕
既知ＤＮＡ抽出方法の前述の課題は、末梢血単核細胞の
水性試料に由来する核酸の迅速抽出方法であって、 Ａ．感染体またはヒトゲノム由来の核酸を含有すること
が予測される末梢血単核細胞の水性試料を２〜１５分間
水の沸点またはその付近で熱にさらし、その試料中の細
胞を溶解してその細胞由来の核酸を放出する工程、およ
び Ｂ．前記加熱試料からその核酸を回収する工程、を含ん
でなる方法によって解決される。
さらに、前述の課題は次の方法によって解決される： ポリメラーゼ連鎖反応を使用する所定の核酸の増幅方法
であって、 Ａ，（１）感染体またはヒトゲノム由来の核酸を含有す
ることが予測される末梢血単核細胞の水性試料を２〜１
５分間水の沸点またはその付近で熱にさらし、その試料
中の細胞を溶解してその細胞由来の核酸を放出する工程
、および （２）前記加熱試料からその核酸を回収する工程、なら
びに Ｂ．ボリメラ・−ゼ連鎖反応を使用して回収した核酸を
増幅する工程、を含んでなる方法。
また、２つの相補的鎖を有する核酸の検出方法であって
、 Ａ．（１）感染体またはヒトゲノム由来の核酸を含有す
ることが予測される末梢血単核細胞の水性試料を２〜１
５分間水の沸点またはその付近で熱にさらし、その試料
中の細胞を溶解してその細胞由来の核酸を放出する工程
、および （２）前記加熱試料からその核酸を回収する工程、から
なる抽出−工程、 Ｂ．その回収された変性核酸をその核酸の分離された鎖
に相補的である第一プライマーおよび第二プライマーと
接触させて、これらのプライマーと相補的鎮のハイブリ
ッド生成物を形成する工程、Ｃ．ハイブリッド生成物に
おける前記プライマーの第一および第二エクステンショ
ン生成物が、それらの相補体から分離された場合にこれ
らのプライマーのエクステンション生成物の合成用鋳型
として機能しうるそれらのエクステンション生成物を形
成する工程、 Ｄ．これらのプライマーエクステンション生成物が合成
された鋳型からそれらを分離する工程、Ｅ．分離された
抽出生成物および所定の核酸を追加の第一プライマーお
よび第二プライマーと接触させ、相補的生成物を形成す
るために前記核酸の増幅をもたらす工程、 Ｆ．工程Ｅで形成された相補的生成物からそれらのプラ
イマーエクステンション生成物を分離する工程、ならび
に Ｇ．水性試料における核酸存在の指標として増幅された
核酸を検出する工程、を含んでなる方法。
さらにまた、全血被検体に由来する核酸の迅速抽出方法
であって、 Ａ，全血被検体を１種以上の多糖類を含む塩溶液と接触
させる工程、 Ｂ．工程八で得られた混合物を２〜１５分間水の沸点ま
たは少なくともその付近の温度で熱にさらし、混合物中
の細胞を溶解してその細胞から核酸を放出する工程、お
よび Ｃ．その加熱混合物から前記核酸を回収する工程、を含
んでなる方法。
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明は、全血またはその末梢血単核細胞画分（ＰＢＭ
Ｃ）のいずれかに由来する１種以上の所定のくすなわち
、標的）核酸の抽出、増幅または検出に向けられる。本
発明の主な目的は診断であるが、抽出されたＤＮＡは各
種研究および医療調査分野でＤＮＡもしくはメッセンジ
ャーＲＮＡのクローニングまたはゲノムＤＮＡの配列決
定にも使用することができる。抽出されたＤＮＡの他の
用途は、当業者にとって容易に明らかであろう。
Ｄ　Ｎ　Ａは、ヒトまたは動物の血液から抽出すること
ができ、ゲノムＤＮＡであるかまたは細菌、ウイルスも
しくは酵母のような感染体によって生ずる細胞もしくは
体液中のものであってもよい。
処理される被検体が全血である場合には、抽出される核
酸は一般にゲノムＤＮＡである。しかしながら、この発
明は感染体（最も好ましくは、ヘルペス、サイトメガロ
ウイルス、エプスタインーパールウイルス、肝炎ウイル
スおよび風疹ウイルスのようなウイルスならびにＨＩＶ
−　Ｉ　，　　ＨＩＶ−　ＩＩおよびＨＴＬＶ−　Ｉの
ようなレトロウィルス）に侵された細胞由来のＤＮＡの
抽出および検出に特に有用である。好ましくは、サイト
メガロウイルス、エプスタインーパールウイルスおよび
旧Ｖ−１ウイルスＤＮＡが本発明によって抽出されそし
て検出され、ＨＩＶ−　ＩウイルスＤＮＡの抽出および
検出が最も好ましいものである。
好ましい態様では、ポリメラーゼ連鎖反応（より詳細は
後述する）を使用して抽出された核酸が増幅または検出
される。
末梢血単核細胞画分（ＰＢＭＣ）は、標準的な方法を使
用する遠心によって全血からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ
（商品名）のクッション上に得られる。それは、卓球お
よびリンパ球よりなるものと信じられている。
Ｐ　Ｂ　ｌ，｛　Ｃが実用される場合、この発明の抽出
方法における重要な工程は、試料中のタンパク質を崩解
せしめそして全細胞を溶解せしめるに十分な時間、水の
沸点またはその付近の熱に細胞の水性試料をさらすこと
である。この試料は媒体として緩衝剤を含んでよいが、
幾つかの例における媒体は単に水だけである。この工程
の温度は、大気圧、煮沸時間および他の環境要因に応じ
て変化しろる。一般的に、海面レベルで、加熱温度は約
１００℃であるが、８０℃程の低温でも１２０℃程の高
温であってもよい。
前記温度で試料を維持する時間は、試料中のタンパク質
を変性し、細胞を溶解してＤＮＡを放出するのに必要な
時間である。これは加熱工程中で試料の一部を採取し、
全タンパク質が残存するが否かを測定することによって
容易に決定することができる。この時間は、使用される
温度によっても変化し、すなわち、より低温ではより長
い加熱時間となる。一般に、最低２分間で１５分間まで
の望ましい温度に試料は加熱され、好ましくは４〜１２
分、最適には１０分間加熱される。
加熱は、試料を保持するのに十分なサイズを有し、加熱
処理に耐えうるいずれかの適当な容器で行うことができ
る。例えば、フラスコ、試験管、遠心管、毛細管、ビー
カー、キニベットおよび他の標準的な実験室備品で加熱
を行うことができる。
好ましくは、加熱および化学反応を含む多様な処理を目
的に設計される自蔵式の反応容器でそれが行われる。多
くのこのような容器は当該技術分野で既知である。好ま
しい自蔵式容器は、同時係属中の特許出願明細書（Ｓｃ
ｈｎｉｐｅｌｓｋｙらによって１９８９年４月１４日付
で出願された米国特許出願第３３９，　９２３号明細書
に対応する）に記載されている。
試料中のＰ　Ｂ　），ｌ　Ｃを溶解するために加熱した
後、放出された核酸（一般に、ＤＮＡ）は適当な方法で
回収される。細胞質およびすべての凝集砕片は、濾過、
遠心、デカントおよびサイフォン処理を含むいずれか適
当な手段によって可溶性Ｄ　Ｎ　Ａ分子を含有する流体
から分離される。濾過は、標準的な濾過装置，または濾
過膜を有する装置を使用して実施することができる。特
に有用な濾過手役は、ポリアミド膜ＣＬｏｐｒｏｄｙｎ
ｅ　（商品名）ｔたはＢｉｏｄｙｎｅ（商品名）膜〕の
ような微孔質濾過膜である。それらは、被覆しないか、
あるいは分析手順を促進する界面活性剤または他の材料
で予め被覆して使用することができる。
これらの膜は、アッセイの他の工程を実施するための適
当な容器と共に分離支持体として使用することができる
。しかしながら、試験装置の一部として固定されている
ことが好ましい。各種の試験装置が、米国特許第３，　
８２５．　４１０号、Ｒ３，　８８８，　６２９号、同
３，　９７０．　４２９号および同４，　４４６，　２
３２号明細書に記載されるものを含む当該技術分野で既
知である。特に有用な装置は、同時係属中の特願昭６３
−２３４６９２号（１９８８年９月１８日出願）明細書
に記載されている。
全血が処理されて核酸が抽出されるこの発明の一の態様
では、加熱前に、希釈水性塩溶液中１種以上の多糖類を
含む溶液で全血試料が希釈される。
多糖類は、希釈剤として使用し、そして望ましくない細
胞砕片やヘモグロビンから抽出ＤＮＡの分離に究極的に
役立つであろう。場合により、ポリオキシエチレンエー
テノベポリオキシェチレンソルビクン誘導体またはポリ
グリコー．ルエーテルのような非イオン界面活性剤を１
ｏＭ量％未漢の量でこの溶液に含めることができる。他
の有用な界面活性剤は、特に、界面活性剤についての標
準的な文献、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ　Ｅｍｕｌｓｉ
ｆｉｅｒｓ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，１９８６
，　Ｎｏｒｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，
　　（ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎＤｉｖｉｓｉｏｎ　Ｐｕｂ
ｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ）を参照した後はとく
に、当業者に容易に明らかとなるであろう。特に有用な
界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ　（商品名）Ｘ−１
００やＮｏｎｉｄｅｔ（商品名）ＮＰ−４０およびＢｒ
ｉｊ　（商品名）３５のような市販のその他のものが挙
げられる。
多糖頚の量は変動しうるが、一般に、全血試料を基準に
１〜１０重量％を提供する量で使用される。
３〜５重量％が好ましい。
有用な多糖類は、一般に単一糖分子を少なくとも３個含
有する水溶性または水分散性炭水化物である。限定され
るものでないが、これらにはセルロースおよびセルロー
ス誘導体、カルボキシメチル化多糖類、リボ多糖類、デ
キストラン、デキストリンおよび殿粉が包含される。特
に有用な物質は、主としてα一Ｄ　（１−６）結合した
Ｄ−グルコース構造単位の主鎮を有し、少なくとも１０
００の分子量を有するデキストランとして既知のもので
ある。代表的なデキストランは、ＪｅａｎｅｓらのＪ．
Ａ，Ｃ．Ｓ．．　７６．　５０４１〜５０５２ページ（
１９５４）およびＢａｎｋｅｒｔらのＪ，Ｉｍｍｕｎ．
１２３（６）．　２４６６〜２４７４ページ（１９７９
）に記載されている。殆どのデキストランは市販されて
いる。
前記塩溶液は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リ
チウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、クエン酸
ナトリウムおよび全血中の細胞からＤＮＡの抽出および
単離を妨害しない他の塩のような簡単な塩１種以上を含
む。原則的に、塩溶液は多糖類の溶解や等張液を提供す
るのに役立つ。
この溶液中の塩の量は、一般に０．５〜１．５重量％で
ある。
この水性塩溶液は、生物学的被検体に適合するような緩
衝剤をも含むことができる。限定されるものでないが、
有用な緩衝剤としては、リン酸塩、ホウ酸塩、トリス（
ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｎ一トリス（ヒドロ
キシメチル）メチルアミノエタンスルホン酸および当該
技術分野で既知の他のものが挙げられる。
この発明の加熱工程前に、全血試料を１種以上の緩衝液
と接触させることは必須でないが、幾かの例では望まし
い。有用な緩衝液は、以下「ＴＥ」緩衝液と称され、そ
の組成は後述する。ＴＥ緩衝液は、一般に核酸、特にＤ
ＮＡを溶解するために使用される。いずれかの重金属イ
オンをキレー卜するためにエチレンジアミン四酢酸がそ
れに含められる。
プローブまたは核酸断片が検出されるものであるプライ
マーと関連して本明細書で使用される場合の「オリゴヌ
クレオチド」の語は、２以上のデオキシヌクレオチドま
たはりボヌクレオチドを、そして好ましくは３より大き
いものからなる分子をいう。正確なサイズは限定されな
いが、オリゴヌクレオチドの究極的な使用または機能を
含む多くの要因に左右される。オリゴヌクレオチドは合
成的またはクローニングによって誘導されうる。
「プライマー」の語は、天然由来かまたは合成的に生成
されたオリゴヌクレオチドであって、ある核酸鎖に相補
的なプライマーエクステンション生成物合成が誘導され
る条件下に置かれたときに合成開始点として機能しうる
ちのをいう。このような条件には、ヌクレオチド（例え
ば、４種の標準的なデオキシリボヌクレオシド三リン酸
）およびＤＮＡポリメラーゼのような重合用試薬の存在
、ならびに適当な温度およびｐＨを包含する。
この発明の実施に際して、プライマー、プローブおよび
断片は、全血またはＰ　Ｂ　Ｍ　Ｃから抽出された標的
核酸の特異的な核酸配列に実質的に相補的である。「実
質的に相補的」とは、ハイブリダイゼーションが起こり
つるようにマッチするのに十分な数の塩基が相補体上に
存在することを意味する。
しかしながら、全ての塩基対がマッチしうろことを意味
しない。
この発明の増幅および検出方法で利用可能なプライマー
は、各種起源から人手するかあるいは、例えば、ＡＢＩ
　ＤＮＡシンセサイダー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ−ｓ
ｙｓｔｅｍより入手可）またはＢｉｏｓｅａｒｃｈ　８
６００シリーズもしくは８８００シリーズのシンセサイ
ダー（Ｍｉｌｌｉ−ｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，　Ｉ
ｎｃ．より人手可）およびこれらの使用についての既知
の方法を含む、既知の方法および装置を使用して調製す
ることができる。生物源から単離された天然由来のブラ
イマ−（制限エンドヌクレアーゼ消化物のような）も利
用可能である。
ある態様では、この検出方法においてプライマ−（また
はそのセット）少なくとも１つが特異的にパインディン
グするリガンドで標識される。
「標識される」の語は、リガンドが容易に脱離しないよ
うな状態でこのプライマーに付着されていることをいう
。特異的にバインドするリガンドとしては、ビオチンも
しくはその誘導体、アビジン、ストレプトアビジンもし
くはその誘導体、レクチン、糖、タンパク質、ハプテン
、薬剤または抗体もしくは抗原性物質のような免疫種が
挙げられる。
この発明は、２つの相補的鎖を有する標的核酸の増幅ま
たは検出に有用である。多くの目的とする核酸配列は、
ＤＮＡに見い出されるもののごとく既に二本鎖である。
しかしながら、ｍＲＮＡのように一本鎖の核酸配列も同
様に増幅されそして検出されうる。
特異的な核酸配列は、鋳型としてその配列を含有する核
酸を使用して調製されている。核酸が二本の鎖を含む場
合には、分離工程としてかまたはプライマーエクステン
ション生成物の形成と同時にそれらの鎖を分離すること
（いわゆる変性）が必要である。変性は、従来技術文献
に記載されているようないずれか適当な物理的、化学的
または酵素的手段を使用して行うことができる。適当な
温度まで加熱することが好ましい手段である。全血また
はＰ　Ｂ　１，ＩＣ試料を加熱してＤＮＡを抽出する場
合には変性が起こりうる。
分離された鎖が使用可能になったならば、一般にｐＨ７
〜９に緩衝化された水溶液中で２つ以上のブライマ−（
標識または未標識）を使用して追加の核酸鎖の合成を実
施することができる。好ましくは、１モル過剰の２つの
プライマーが緩衝液に添加され、具体的な量は従来技術
（例えば、米国特許第４，　６８３，　２０２号明細書
）に教示されている。
新に合成された鎖とそれらの個々のプライマーを含んで
なる新に形成されたプライマーエクステンション生成物
は、この方法の次の工程で使用される最初の標的鎖と二
本鎖分子を形成する。次に、前述のようにこれらの鎮を
変性で分離して一本鎖分子を提供し、前述のようにこれ
によって新な核酸を合成する。
場合によって追加の試薬が増幅工程の進行を持続するた
めに必要であるかも知れない。この工程後、殆どのエク
ステンション生成物は２つのプライマーによって結合さ
れた特異的な核酸配列（すなわち、相補的生成物）から
成るであろう。
鎖の分離とエクステンション生成物合成工程は、必要に
よって繰り返えされて、使用、例えば検出に必要な目的
量の特異的な核酸を生成することができる。一般的に、
一連の工程は最低１度は繰り返えされ、好ましくは最低
１０〜５０回繰り返えされる。
サザーンプロット、ゲル電気泳動、染色および当該技術
分野で既知の他の方法を包含する各種検出手段を使用し
て検出可能なハイブリッドの存在を測定することができ
る。
少なくとも１個のプライマーエクステンション生成物が
生じた後、この発明の方法のいずれかの時点でその生成
物は検出可能に標識されたブローブ（後述）とハイブッ
ド化されうる。
特に好ましい態様では、前記標識がベルオキシダーゼで
あり、アッセイのある時点で過酸化水素と適当な色素生
成組成物が添加されて検出可能な色素を提供する。例え
ば、脊用な色素生成試薬とシテハ、テトラメチルベンジ
ジンやその誘導体、ならびに米国特許第４，　０８９，
　７４７号明細書に記載されるトリアリールイミダゾー
ルロイコ染料のようなロイコ染料またはベルオキシダー
ゼと過酸化水素の存在下で反応して色累を供給する他の
化合物が挙げられる。特に有用な色素生成組成物は、国
際公開Ｗ０８ｇ　／０２８０６および同８ｇ／０２８０
７号公報および特開平１　−１００４５３号公報に記載
されている。
相補的生成物中に存在するプローブの存在の検出は、適
切かつ既知の検出装置および手順を使用して達成するこ
とができる。特定のブローブは検出器を使用することな
く目視可能である。
プローブが相補的生成物中で検出されるには、反応媒体
中の他の物質から相補的生成物を分離することがしばし
ば重要となる。これは、適当な不溶化手段、例えば本発
明の方法のある時点で固体素材に結合するかまたは結合
可能となるプライマーまたはブローブを使用することに
よって行うことができる。得られる不溶化複合体は、濾
過、遠心または他の適当な分離手段によって未複合化物
質から分離することができる。
特に有用な分離手段は、Ｐａｉｌ　Ｃｏｒｐによって販
売されているポリアミド膜（前述）のような微孔質濾過
膜である。これらの膜は、アッセイの他の工程を実施す
るのに適する容器と共に分離支持体として使用すること
ができる。しかしながら、好ましくは、前述したように
試験装置の一部としてそれらが固定される。
本明細書で開示される方法を使用して、生物学的被検体
で見い出されるガンのような細胞疾患、感染症または遺
伝子疾患に関連する特異的な核酸配列の検出または特性
付けを行うことができる。
それはまた、法医学上の研究、ＤＮＡの類別化および細
胞の類別化にも使用されるかも知れない。
この発明の目的とする遺伝子疾患としては、鎌状赤血球
貧血、嚢胞性線維症、α−サラセミア、β−サラセミア
および当業者に容易に明らかとなる他の疾患のような、
いずれかの生物体に由来するヒトのゲノムＤＮＡの特異
的な欠損または変異が挙げられる。各種感染症は、生物
体（それが酵母、細菌またはウイルスであるかどうかに
かかわらず）を特性付ける少量の特異的なＤＮＡ配列を
有する細胞の存在によって診断することができる。この
ような検出されうる細菌としては、限定されるものでな
いが、サルモネラ（Ｓａ　ｌｍｏｎｅ　Ｉ　Ｉａ）、ク
ラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）　、ゴノｏ　−　工（
Ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）　、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）
およびリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）が挙げられる。
検出可能なウィルスとしては、限定されるものでないが
、ヘルペス、サイトメガロウイルス、エプスタインーバ
ールウィルス、肝炎ウィルスならびにＨＴＬＶ−　１お
よびＨＩＶ−　Ｉのようなレトロウイルスが挙げられる
。原生動物寄生体、酵母およびカビもまた検出可能であ
る。他の検出可能な種は、当業者にとって容易に明らか
であろう。
この発明の方法を使用して旧Ｖ−１の存在にっいて新生
児の検査をすることもできる。新生児に由来する全血を
採取し、濾紙または他の適当な多孔質支持体上にスポッ
トし次いで乾燥させる。次に、乾燥血試料を有する支持
体部分を切り出し、水（２５０ｄ）中デキストラン（ま
たは他の適当な多糖、３重量％）　、Ｔｒｉｔｏｎ　（
商品名）Ｘ−１００　（または他の適当な非イオン界面
活性剤、１０重量％）および塩化ナトリウム（または他
の適当な塩、０．９重量％）を含有する溶液に入れる。
次に、この混合物を５分間１１８℃で加熱してＤＮＡを
抽出する。
次に、抽出されたＤＮＡはポリメラーゼ連鎖反応を使用
して増幅され、先に記載されているように検出される。
〔実施例〕
以下の例は、この発明の実施を具体的に説明するための
ものであって、この発明をいずれかの方法に限定するこ
とを意味しない。
これらの例で使用した材料は以下のとおりである： ｒ　．Ｔ　Ｅ　Ｊ緩衝剤は、トリス（ヒドロキシメチル
）アミノメタン塩酸緩衝剤（１０ミ！７モル濃度）およ
びエチレンジアミン四酢酸（１ミリモル濃度）から成り
、塩酸を使用してｐＨ８に調整した。
電気泳動に使用する「移動緩衝剤」は、トリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン（８９ミリモル濃度）、ホウ
酸（８９ミ＋Ｊモル濃度）およびエチレンジアミン四酢
酸（２ミリモル濃度）からなっていた。
ハンクス液はＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ，よ
り人手した。
例　１：全血（７）ＰＢＭＣ画分からＨＩＶ−Ｉ　ＤＮ
Ａ（７）抽出この例は、全血のＰ　Ｂ　Ｍ　Ｃ画分から
核酸どのように抽出するかを具体的に説明する。ＰＢＭ
Ｃ画分を得るための標準的方法を示し、次いでこの発明
の抽出、増幅および検出方法を具体的に示す。
下記方法を使用してＨＩＶ−　Ｉを保有することが予測
される患者の全血試料から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）
を得た： ヘパリン試験管に集めた全血（１０ｍｆ！）を遠心管に
入れ、１０分間１２０Ｏｒｐｍ．で遠心した。血漿層約
０．５ｍｊ’を除いてすべての層を除去した。赤血球を
できるだけ多くあとに残し、バッフィーコートを可能な
限り多く採取して１５ｒｎ！の遠心管に移した。
次に、このバッフィーコート細胞にハンクス液（［イＢ
ＳＳ，５ｍｌ）を加え、次いでこれらにＦｉｃｏｌｌ　
−Ｐａｑｕｅ　（商品名）（３．５４）で下層を形成し
た。得られた混合物を１６分間１９００ｒｐｍで遠心し
、フイコール（ｆｉｃｏｌｌ）層上のＰ　Ｂ　！，（　
Ｃのバンドを採取し、別の１５ｍｌ遠心管に移した。Ｈ
ＢＳＳ（３ｒｄ）を加え、次いで混合物を１０分間１２
０Ｏｒｐｍで遠心した。ＰＢｌ４Ｃ　２５０　〜３００
μ！等価を含有する得られたベレットを２ｍｌのスクリ
ューキャップ付微量管に移し、−７０℃で保存した。
約２〜３×１０１′Ｃｅ１１／ｒｄ含有のＰＢＭＣ試料
（１−）をエッペンドルフ（ｌｔ遠心管に入れ、１０分
間１４，　０００ｒｐｍで遠心した。上澄を廃棄し、ベ
レットをｒＴＥＪ緩衝液（１ｍｌ）に懸濁させた。この
試料を１０分間１００℃で加熱し、次いで２秒間１４，
　（１００ｒｐｍで遠心した。上澄試料（５０Ｉｌ１）
・を下記のポリメラーゼ連鎖反応混合物１００ｍｌと混
ぜた。増幅は下記のように行った。
ポリメラーゼ連鎖反応混合物は次のものを含んでいた：
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸緩衝剤（
ｐＨ８、１０ミリモル濃度）、塩化カリウム（５０ミリ
モル濃度）、塩化マグネシウム（１０ミリモル濃度）、
ゼラチン（１００ｘ／ｒｒ＋ｊ’）　、デオキシリボヌ
クレオシド三リン酸類（ｄＮＴＰ，各０．１７ミリモル
濃度）およびサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕ
ｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から単離されたＤＮＡポリメ
ラーゼ（７，５単位）。使用したプライマー類（各１マ
イクロモル濃度）は次の核酸配列を有していた： ５′−＾ＴＡＡＴＣＣＡＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧＴＡＧＧ
ＡＧＡＡＡＴ−　３　’５’　　−Ｘ　　−ＴＴＴＧＧ
ＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＡＴＧＴＣＣＡＧＡ八ＴＧＣ−３
’上式中、Ｘは、国際公開ＷＯ８９／０２９３１　号公
報ｉ：記載されるような核酸配列に結合しｍ製されたビ
オチンテトラエチレングリコール◆スペーサーを表す。
反応混合物とＰ　Ｂ　ｊＪ　Ｃ画分を混合し、次いで３
５サイクルのポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させた
〔繰り返しサイクルは、０．５分間９７℃（変性）、０
．５分間５５℃（ハイブッド化）および１分間７０℃（
プライマーエクステンション生成物の形成）〕。
アリコー｝（６μ７）を抜き取り、ＦＭＡ　Ｂｉｏ　Ｐ
ｒｏ−ｄｕｃｔｓ由来の４％アガロースゲル〔３％Ｎｕ
Ｓ　ｉｅｖｅ（商品名）および１％Ｓｅａｋｅｍ　（商
品名）〕にかけた。このゲルは、水中エチジウムブロミ
ド溶液（１０ｍｇ／ｄ）　　４μｌで予め染色した。ゲ
ルを１時間１２０ボルトで電気泳動し、次いで写真をと
りバンドを可視化した。結果は、ＰＢｓＩＣ画分からの
旧Ｖ一Ｉ　ＤＮＡの単離と増幅を表す強いバンドを示し
た。
１１１Ｖ−　Ｉ　ＤＮＡを含まない既知の対照溶液から
は全くバンドが見られなかった。
例　２：全血由来のヒトβ−グロビンＤＮＡの抽出およ
び検出 この例は、患者から得られ、次いで濾紙上にスポットし
そして乾燥された全血由来のヒトβ−グロビンＤ　Ｎ　
Ａの抽出および検出を具体的に説明する。
新生児から全血試料（５０，，７）を得て、標準的な濾
紙上にスポットし、次いで４時間室温で空気乾燥した。
乾燥した血液の円形スポットを紙支持体が付着したまま
切り出し、次いで塩化ナ｝　ＩＪウム（０。９重量％）
溶液中デキストラン（３重量％）およびＴｒｉｔｏｎ　
（商品名）Ｘ−１００　（１０重塁％）溶液に加えた。
得られた混合物を１０秒間渦巻き撹拌し、次いで５分間
１１８℃で加熱した。加熱混合物を０．４５ｌｌｍのフ
ィルターを介して濾過し、濾液（１０〜２Ｏｄ部）をポ
リメラーゼ連鎖反応増幅処理に使用した。
ポリメラーゼ連鎖反応混合物は次のものを含む；塩化カ
リウム（０、０５モル濃度）、塩化マグネシウム（２．
５ミリモル濃度）、ゼラチン（１００ｘ／ｒｄ！）、ト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩ｌ（ｐＨ　８
　、０．０１モル濃度）、デオキシリボヌクレオシド類
（ｄＮＴＰ，各０．１７５ミ’ｌＪモル濃度）およびサ
ーマス・アクアティカスから単離されたＤＮＡポリメラ
ーゼ（８単位）。プライマー類（各０．２マイクロモル
濃度）は次のヌクレオチド配列を有する： ５’　−ＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣ−
３’５’　−Ｃ’ＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡ
ＣＣ’−３’前記反応混合物（９４４）を抽出した全血
溶液ク１０〜２０Ｉ）と混合し、増幅は３０サイクル行
った〔繰り返しサイクル：０．５分間９５℃（変性）、
０．５分間５５℃（ハイブッド化）および１分間７０℃
（プライマーエクステンション生成物の形成）〕。
アリコー｝（５ｄ）を抜き取り、ゲル電気泳劾を使用し
てアッセイし、次いでエチジウムブロミドで染色した。
試験結果は、新生児試料から得られたＤＮＡが成功裏に
単離および増幅することを表す強いバンドを示した。ヒ
トβ−グロビンＤＮＡを含まない既知の負対照はバンド
を示さなかった。
例　３：全血由来のヒト白血球抗原ＤＮＡの抽出および
検出 この例は、本発明の方法を使用する全血に由来するヒト
白血球抗原ＤＮＡの抽出を具体的に説明する。
患者由来の全血試Ｉｔ（１００ｐ！）を１．５ｍＪｌ！
のエッペンドルフ管に置き、次いでデヰストラン（３重
量％）および塩化ナトリウム（０、９重量％〉を含有す
る溶液（２５０ｍ）を加え、引き続きこれらの管を反転
させることによって十分撹拌した。次に、５分間沸騰水
で加熱した後、１０秒間遠心した。上澄を採取し、清浄
な１．５ｍｌ！のエッベンドルフ管に入れた。アリコー
トを採取し、下記のポリメラーゼ反応混合物と混合し、
下記のように増幅させた。
ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、塩化カリウム（０．０
５モル濃度）、塩化マグネシウム（２．５ミリモル濃度
）、ゼラチン（１００屑／ｍｌ）、トリス（ヒドロキシ
メチル》アミノメタン緩衝剤（ｐＨ８、０．０１モル濃
度）、デオキシリボヌクレオシド三リン酸類（ｄＮＴＰ
，各０．　１７５ミリモル濃度）、サーマス・アクアテ
ィカスから単離されたＤＮＡポリメラーゼ（８単位）を
含めた。プライマー類（２４！ｉ、各１０マイクロモル
濃度）は下北のようなヌクレオチド配列を有していた： ５’　　−ＧＴＧＣＴＧＣ八ＧＧＴＧＴＡＡＡＣＴＴＧ
ＴＡＣＣＡＧ−３　’５’　　−ＣＡＣＧＧＡＴＣＣＧ
ＧＴＡＧＣＡＧＣＧＧＴＡＧＡＧＴＴＧ−３’前記反応
混合物（９４ｄ）を抽出した全血溶液（１０μ！）と混
合し、増幅反応は３０サイクル行った〔次のサイクルが
繰り返えされた＝０８５分間９０℃（変性）、０．５分
間５５℃（ハイブッド化）および１分間７０℃（プライ
マーエクステンション生成物の形成）〕。
アリコー｝（５ｐ！）を抜き取り、ゲル電気泳動および
エチジウムブロミド染色を使用してアッセイした。結果
は、試料からヒト白血球抗原ＤＮＡが成功裏に抽出およ
び増幅することを表す試料に対する強いバンドを示した
。このようなＤＮＡを含まない既知の対照は全くバンド
を示さなかった。
〔発明の効果〕
この発明の抽出方法は、全血または、特にそれらから得
られる末梢血単核細胞画分（ＰＢＭＣ）からＤＮＡを抽
出することが迅速であり、かつ有効である。この方法は
、当該技術分野で既知の冗長で複雉なコストのかかる手
順を避けて数分で実施することができる。さらに、望ま
しくない有機溶媒を必要とせず、この方法は、例えばあ
るタイプの一体となった容器で自動化しやすい。高価な
溶解酵素（例えば、ブロテイナーゼＫ）の使用も不要で
ある。・この発明の実施は、たとえＡＩＤＳや他のウイ
ルス感染症のような感染症のごとく核酸が非常に少量存
在する場合であっても、その核酸を得ることを可能にす
ることが明らかである。
これらの利点は、単に、少なくとも２分間そして一般に
は１５分間未満水の沸点またはその付近でＰＢＭＣ画分
を加熱することによって達成される。この簡単な工程は
、ＤＮＡを含むことが最も適する細胞物質からＤＮＡを
抽出する上で望ましい効果を奏し、しかも後の増幅また
は検出に向けられる相補的鎮を変性する。抽出されたＤ
ＮＡは、適当な方法を使用して被検体から分離すること
ができる。ヘモグロビン（増幅を妨害する可能性がある
）や増幅試薬と不適合な全血成分はこの方法で除去され
る。
また、この発明は、煮沸しヘモグロビンや他の不要な全
血成分を除去した後でさえも検出可能である量でＤＮＡ
が存在するような場合には、全血由来のＤＮＡを抽出す
る手段も提供する。全血被検体は、煮沸工程前に塩と多
糖類を含む希釈組成物と混合される。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、末梢血単核細胞の水性試料に由来する核酸の迅速抽
    出方法であって、 Ａ、感染体またはヒトゲノム由来の核酸を含有すること
    が予測される末梢血単核細胞の水性試料を２〜１５分間
    水の沸点またはその付近で熱にさらし、その試料中の細
    胞を溶解してその細胞由来の核酸を放出する工程、およ
    び Ｂ、前記加熱試料からその核酸を回収する工程、を含ん
    でなる方法。 ２、ポリメラーゼ連鎖反応を使用する所定の核酸の増幅
    方法であって、 Ａ、（１）感染体またはヒトゲノム由来の核酸を含有す
    ることが予測される末梢血単核細胞の水性試料を２〜１
    ５分間水の沸点またはその付近で熱にさらし、その試料
    中の細胞を溶解してその細胞由来の核酸を放出する工程
    、および （２）前記加熱試料からその核酸を回収する行程、なら
    びに Ｂ、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して回収した核酸を増
    幅する工程、を含んでなる方法。 ３、２つの相補的鎖を有する核酸の検出方法であって、 Ａ、（１）感染体またはヒトゲノム由来の核酸を含有す
    ることが予測される末梢血単核細胞の水性試料を２〜１
    ５分間水の沸点またはその付近で熱にさらし、その試料
    中の細胞を溶解してその細胞由来の核酸を放出する工程
    、および （２）前記加熱試料からその核酸を回収する工程、から
    なる抽出工程、 Ｂ、その回収された変性核酸をその核酸の分離された鎖
    に相補的である第一プライマーおよび第二プライマーと
    接触させて、これらのプライマーと相補的鎖のハイブリ
    ッド生成物を形成する工程、Ｃ、ハイブリッド生成物に
    おける前記プライマーの第一および第二エクステンショ
    ン生成物が、それらの相補体から分離された場合にこれ
    らのプライマーのエクステンション生成物の合成用鋳型
    として機能しうるそれらのエクステンション生成物を形
    成する工程、 Ｄ、これらのプライマーエクステンション生成物が合成
    された鋳型からそれらを分離する工程、Ｅ、分離された
    抽出生成物および所定の核酸を追加の第一プライマーお
    よび第二プライマーと接触させ、相補的生成物を形成す
    るために前記核酸の増幅をもたらす工程、 Ｆ、工程Ｅで形成された相補的生成物からそれらのプラ
    イマーエクステンション生成物を分離する工程、ならび
    に Ｇ、水性試料における核酸存在の指標として増幅された
    核酸を検出する工程、を含んでなる方法。 ４、全血被検体に由来する核酸の迅速抽出方法であって
    、 Ａ、全血被検体を１種以上の多糖類を含む塩溶液と接触
    させる工程、 Ｂ、工程Ａで得られた混合物を２〜１５分間水の沸点ま
    たは少なくともその付近の温度で熱にさらし、混合物中
    の細胞を溶解してその細胞から核酸を放出する工程、お
    よび Ｃ、その加熱混合物から前記核酸を回収する工程、を含
    んでなる方法。
JP2097789A 1989-04-17 1990-04-16 全血またはｐｂｍｃ画分由来の核酸の抽出、増幅および測定方法 Expired - Lifetime JPH072120B2 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33943789A 1989-04-17 1989-04-17
US07/406,222 US5334499A (en) 1989-04-17 1989-09-12 Methods of extracting, amplifying and detecting a nucleic acid from whole blood or PBMC fraction
US406222 1989-09-12
US339437 1989-09-12

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH02292298A true JPH02292298A (ja) 1990-12-03
JPH072120B2 JPH072120B2 (ja) 1995-01-18

Family

ID=26991623

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2097789A Expired - Lifetime JPH072120B2 (ja) 1989-04-17 1990-04-16 全血またはｐｂｍｃ画分由来の核酸の抽出、増幅および測定方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5334499A (ja)
EP (2) EP0393744B1 (ja)
JP (1) JPH072120B2 (ja)
KR (1) KR900016463A (ja)
AT (2) ATE162222T1 (ja)
CA (1) CA2013316A1 (ja)
DE (2) DE69031957T2 (ja)
DK (1) DK0620282T3 (ja)
FI (1) FI901917A0 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05192199A (ja) * 1991-09-23 1993-08-03 Pfizer Inc 細胞中の特異的ｍＲＮＡおよびＤＮＡの検出法
JP2006166712A (ja) * 2004-12-13 2006-06-29 Okayama Univ 核酸修飾前の検体の前処理方法
JP2012157265A (ja) * 2011-01-31 2012-08-23 Yokogawa Electric Corp 核酸抽出方法

Families Citing this family (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5231015A (en) * 1989-10-18 1993-07-27 Eastman Kodak Company Methods of extracting nucleic acids and pcr amplification without using a proteolytic enzyme
ATE147792T1 (de) * 1989-11-30 1997-02-15 Pharmacia Biotech Ab Neues verfahren zum nachweis einer spezifischen nukleinsäuresequenz in einer zellprobe
CA2065719A1 (en) 1991-04-30 1992-10-31 John B. Findlay Nucleic acid amplification and detection methods using rapid polymerase chain reaction cycle
AU664050B2 (en) * 1991-12-18 1995-11-02 Becton Dickinson & Company Process for lysing mycobacteria
US5686238A (en) * 1992-02-10 1997-11-11 Baxter International Inc. Method and device for testing blood units for viral contamination
US5837453A (en) * 1992-05-13 1998-11-17 Geron Corporation Telomerase activity assays
US5629154A (en) * 1993-11-12 1997-05-13 Geron Corporation Telomerase activity assays
EP0590327B1 (en) * 1992-09-11 2003-04-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Detection of nucleic acids in blood
IL110463A0 (en) * 1993-08-13 1994-10-21 Du Pont In situ extraction of microbial DNA
JP3451667B2 (ja) * 1993-08-24 2003-09-29 東ソー株式会社 核酸抽出及び特定核酸配列の検出方法
US6043032A (en) * 1993-09-22 2000-03-28 Tosoh Corporation Method of extracting nucleic acids and method of detecting specified nucleic acid sequences
GB2282138B (en) * 1993-09-28 1997-09-03 Tosoh Corp Method of extracting nucleic acids and method of detecting specified nucleic acid sequences
GB9323305D0 (en) * 1993-11-11 1994-01-05 Medinnova Sf Isoaltion of nucleic acid
US5804380A (en) * 1993-11-12 1998-09-08 Geron Corporation Telomerase activity assays
US5863726A (en) * 1993-11-12 1999-01-26 Geron Corporation Telomerase activity assays
US5622822A (en) 1994-09-13 1997-04-22 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Methods for capture and selective release of nucleic acids using polyethyleneimine and an anionic phosphate ester surfactant and amplification of same
US5705366A (en) 1994-09-15 1998-01-06 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Coamplification of target nucleic acids using volume exclusion agent in reaction composition, test kit and test device useful therefor
US5582988A (en) 1994-09-15 1996-12-10 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Methods for capture and selective release of nucleic acids using weakly basic polymer and amplification of same
GB9425138D0 (en) 1994-12-12 1995-02-08 Dynal As Isolation of nucleic acid
DE19530132C2 (de) * 1995-08-16 1998-07-16 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur Reinigung, Stabilisierung oder Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischen Materialien
EP0904409A1 (de) * 1996-05-03 1999-03-31 Institut für Medizinische Molekulardiagnostik GbRmbH Verfahren zur dns-analytik von blut und mittel zur durchführung des verfahrens
AU7404498A (en) * 1996-11-27 1998-06-22 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The A rapid method for diagnosing the various forms of thalassemia
US5922288A (en) * 1997-05-29 1999-07-13 Herst; C. V. Taylor Device for isolating a component of a physiological sample
ES2301581T3 (es) * 1997-12-06 2008-07-01 Invitrogen Corporation Aislamiento de acidos nucleicos.
US6914137B2 (en) 1997-12-06 2005-07-05 Dna Research Innovations Limited Isolation of nucleic acids
JPH11332562A (ja) * 1998-04-28 1999-12-07 Ortho Clinical Diagnostics Inc 組織試料およびパラフィン包埋組織から核酸を抽出するための改良方法
EP1147226B1 (en) * 1999-01-27 2013-01-23 Folim G. Halaka Materials and methods for the purification of polyelectrolytes
AU3377500A (en) 1999-02-26 2000-09-14 Myriad Genetics, Inc. Method for extracting dna from dried specimens
US6469159B1 (en) 1999-04-26 2002-10-22 Robert T. Belly Methods for extracting nucleic acids from tissue samples and paraffin-embedded tissues
DK1206571T3 (da) * 1999-05-04 2004-12-06 Ortho Clinical Diagnostics Inc Hurtig og effektiv indfangning af DNA fra pröve uden anvendelse af cellelyseringsreagens
US7262006B1 (en) 2000-05-01 2007-08-28 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Rapid and efficient capture of DNA from sample without using cell lysing reagent
FR2822477B1 (fr) * 2001-03-23 2003-08-08 Inst Nat Sante Rech Med Methode de genotypage sans extraction de l'adn
US20040106109A1 (en) * 2001-10-02 2004-06-03 Belly Robert T Detection of ras mutations
JP2005538929A (ja) 2002-01-16 2005-12-22 ダイナル バイオテック エイエスエイ 単一サンプルからの核酸及びタンパク質の単離方法
US20040014097A1 (en) * 2002-05-06 2004-01-22 Mcglennen Ronald C. Genetic test apparatus and method
US20060278242A1 (en) * 2005-03-23 2006-12-14 Mcglennen Ronald C Apparatus and methods for medical testing
US8594948B2 (en) * 2002-09-18 2013-11-26 Ronald C. McGlennen Apparatus and methods for medical testing
JPWO2004094634A1 (ja) * 2003-04-22 2006-07-13 アークレイ株式会社 核酸の単離方法ならびに核酸単離用のキット及び装置
WO2005011867A2 (en) 2003-07-31 2005-02-10 Handylab, Inc. Processing particle-containing samples
US8852862B2 (en) 2004-05-03 2014-10-07 Handylab, Inc. Method for processing polynucleotide-containing samples
WO2006004611A2 (en) * 2004-06-25 2006-01-12 Invitrogen Corporation Separation of nucleic acid
US20080118926A1 (en) * 2004-12-13 2008-05-22 National University Corporation Okayama University Method For Detecting Methylation In Genes And Method For Examining Neoplasm Through Detecting Methylation In Genes
US9505846B2 (en) 2005-01-28 2016-11-29 Life Technologies Corporation Multi-component inhibitors of nucleic acid polymerases
US20060264714A1 (en) * 2005-03-23 2006-11-23 Mcglennen Ronald C Apparatus and methods for medical testing
US8628918B2 (en) * 2005-05-09 2014-01-14 Affymetrix, Inc. Multiplex capture of nucleic acids
US8632970B2 (en) 2005-05-09 2014-01-21 Affymetrix, Inc. Multiplex capture of nucleic acids
WO2006124771A2 (en) 2005-05-12 2006-11-23 Panomics, Inc. Multiplex branched-chain dna assays
CN104673905B (zh) * 2005-06-20 2016-09-07 领先细胞医疗诊断有限公司 检测单个细胞中的核酸和鉴定异质大细胞群中罕见细胞的方法
US7927798B2 (en) * 2005-10-05 2011-04-19 Panomics, Inc. Detection of nucleic acids from whole blood
ES2276630B1 (es) * 2005-12-13 2008-06-16 Universitat Autonoma De Barcelona Metodo y kit para genotipificacion de hla-b basados en la pcr en tiempo real.
US10900066B2 (en) 2006-03-24 2021-01-26 Handylab, Inc. Microfluidic system for amplifying and detecting polynucleotides in parallel
US8883490B2 (en) 2006-03-24 2014-11-11 Handylab, Inc. Fluorescence detector for microfluidic diagnostic system
EP3088083B1 (en) 2006-03-24 2018-08-01 Handylab, Inc. Method of performing pcr with a mult-ilane cartridge
US7998708B2 (en) 2006-03-24 2011-08-16 Handylab, Inc. Microfluidic system for amplifying and detecting polynucleotides in parallel
US11806718B2 (en) 2006-03-24 2023-11-07 Handylab, Inc. Fluorescence detector for microfluidic diagnostic system
US8039234B1 (en) * 2006-05-22 2011-10-18 Applied Biosystems, Llc Methods, panels of identification markers, and kits for identifying forensic samples
KR100785017B1 (ko) * 2006-06-05 2007-12-12 삼성전자주식회사 혈액으로부터 핵산을 증폭하는 방법
JP2009541759A (ja) * 2006-07-03 2009-11-26 ゼボ ゲゼルシャフト ミット ベシユレンクテル ハフツング 分析物測定用生物流体加工方法および装置
JP2008167722A (ja) 2007-01-15 2008-07-24 Konica Minolta Medical & Graphic Inc 磁性支持体上での加熱による核酸単離方法
US9186677B2 (en) 2007-07-13 2015-11-17 Handylab, Inc. Integrated apparatus for performing nucleic acid extraction and diagnostic testing on multiple biological samples
US8287820B2 (en) 2007-07-13 2012-10-16 Handylab, Inc. Automated pipetting apparatus having a combined liquid pump and pipette head system
US8105783B2 (en) 2007-07-13 2012-01-31 Handylab, Inc. Microfluidic cartridge
US8182763B2 (en) 2007-07-13 2012-05-22 Handylab, Inc. Rack for sample tubes and reagent holders
EP3741869A1 (en) 2007-07-13 2020-11-25 Handylab, Inc. Polynucleotide capture materials and methods of using same
US8895240B2 (en) * 2008-05-19 2014-11-25 E I Du Pont De Nemours And Company Method, kit and system for collecting and processing samples for DNA and RNA detection
WO2012039422A1 (ja) 2010-09-22 2012-03-29 株式会社カネカ 核酸の検出方法及びデバイス、キット
US8658361B2 (en) 2010-10-21 2014-02-25 Advanced Cell Diagnostics, Inc. Ultra sensitive method for in situ detection of nucleic acids
CN103597358B (zh) 2011-04-15 2016-08-17 贝克顿·迪金森公司 扫描实时微流体热循环仪和用于同步的热循环和扫描光学检测的方法
WO2013067202A1 (en) 2011-11-04 2013-05-10 Handylab, Inc. Polynucleotide sample preparation device
US10260111B1 (en) 2014-01-20 2019-04-16 Brett Eric Etchebarne Method of detecting sepsis-related microorganisms and detecting antibiotic-resistant sepsis-related microorganisms in a fluid sample
US20180135108A1 (en) * 2014-01-20 2018-05-17 Board Of Trustees Of Michigan State University Method for detecting bacterial and fungal pathogens
DK3362462T3 (da) 2015-10-12 2021-10-11 Advanced Cell Diagnostics Inc In situ-detektion af nukleotidvarianter i prøver med højt støjniveau, og sammensætninger og fremgangsmåder relateret dertil
BR102018003245A2 (pt) 2018-02-20 2019-09-10 Fundação Oswaldo Cruz oligonucleotídeo, conjunto de oligonucleotídeos, método para detecção simultânea de neisseria meningitidis, streptococcus pneumoniae e haemophilus influenzae, e, kit.
WO2021061797A1 (en) * 2019-09-24 2021-04-01 Genepath Diagnostics Inc. Composition and method for improving detection of biomolecules in biofluid samples
CN112458051A (zh) * 2020-11-11 2021-03-09 海南优尼科尔生物科技有限公司 一种外周血单个核细胞的提取收集方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1202743B (de) * 1960-12-28 1965-10-14 Toyo Boseki Verfahren zur Extraktion von Ribonucleinsaeure aus Hefe
US4515890A (en) * 1982-11-08 1985-05-07 Abbott Laboratories Immunoassay of terminal deoxynucleotidyl transferase
GB8331071D0 (en) * 1983-11-22 1983-12-29 Karayiannis P Assay for dna/rna
US4750982A (en) * 1985-03-21 1988-06-14 Lifecodes Corp. Process and apparatus for purifying and concentrating DNA from crude mixtures containing DNA
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
EP0240191A3 (en) * 1986-03-13 1989-10-25 Seiko Instruments Inc. Method of isolating dna contained in a virus or cell
CA1284931C (en) * 1986-03-13 1991-06-18 Henry A. Erlich Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids
DE3788082T2 (de) * 1986-04-11 1994-06-09 Applied Biosystems Automatisches Gerät zum Extrahieren von Nukleinsäuren.

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05192199A (ja) * 1991-09-23 1993-08-03 Pfizer Inc 細胞中の特異的ｍＲＮＡおよびＤＮＡの検出法
JP2006166712A (ja) * 2004-12-13 2006-06-29 Okayama Univ 核酸修飾前の検体の前処理方法
JP2012157265A (ja) * 2011-01-31 2012-08-23 Yokogawa Electric Corp 核酸抽出方法
US8877918B2 (en) 2011-01-31 2014-11-04 Tokyo University Of Agriculture And Technology Nucleic acid extraction method

Also Published As

Publication number Publication date
DK0620282T3 (da) 1998-09-14
US5334499A (en) 1994-08-02
EP0393744B1 (en) 1995-01-18
EP0393744A1 (en) 1990-10-24
DE69031957T2 (de) 1998-06-10
ATE117377T1 (de) 1995-02-15
DE69016079T2 (de) 1995-09-14
DE69031957D1 (de) 1998-02-19
FI901917A0 (fi) 1990-04-17
CA2013316A1 (en) 1990-10-17
EP0620282A1 (en) 1994-10-19
EP0620282B1 (en) 1998-01-14
ATE162222T1 (de) 1998-01-15
JPH072120B2 (ja) 1995-01-18
DE69016079D1 (de) 1995-03-02
KR900016463A (ko) 1990-11-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH02292298A (ja) 全血またはｐｂｍｃ画分由来の核酸の抽出、増幅および測定方法
JP2533969B2 (ja) タンパク質分解酵素を用いない核酸の抽出およびｐｃｒ増幅方法
JP2552691B2 (ja) 生物学的試料中の核酸評価のためのカオトロピック方法
US5935825A (en) Process and reagent for amplifying nucleic acid sequences
US5482834A (en) Evaluation of nucleic acids in a biological sample hybridization in a solution of chaotrophic salt solubilized cells
CA2199337C (en) Whole blood sample preparation for polymerase chain reaction using ammonium chloride and a carboxylic acid or metal carboxylate for selective red blood cell lysis
EP0393743A2 (en) Diagnostic kit, primer composition and their use for replication or detection of nucleic acids
CA2065719A1 (en) Nucleic acid amplification and detection methods using rapid polymerase chain reaction cycle
JP3452717B2 (ja) 核酸合成法
EP0751226B1 (en) Process for amplifying nucleic acid sequences
CA2297547C (en) An improved method for preparing dna from serum and plasma
KR920007664B1 (ko) 핵산의 정제, 증폭 및 검사방법
JP4186270B2 (ja) 核酸合成法
JPH1080279A (ja) 核酸合成法
JPH07298897A (ja) ２つの標識プライマーを用いた標的核酸の生成、増幅及び検出方法並びにそれらを含有するｐｃｒキット
CA2024978A1 (en) Nucleic acid detection method using unequal primer concentrations in polymerase chain reaction
JP2001008685A (ja) 核酸合成法
JP2005508192A (ja) 安定な複合試薬配合物を含む反応チャンバーならびに病原性微生物核酸の検出および単離用の検査キット
WO1996031623A1 (fr) Polynucleotides permettant de deceler des leishmanies et procede de detection du protozoaire de la leishmanie
Erasmus et al. Basics of molecular biology and its applications-III. Polymerase chain reaction and in situ hybridization

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080118

Year of fee payment: 13

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090118

Year of fee payment: 14

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090118

Year of fee payment: 14

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100118

Year of fee payment: 15

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110118

Year of fee payment: 16

EXPY Cancellation because of completion of term
FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110118

Year of fee payment: 16