JPH1080279A - 核酸合成法 - Google Patents
核酸合成法Info
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- JPH1080279A JPH1080279A JP8238112A JP23811296A JPH1080279A JP H1080279 A JPH1080279 A JP H1080279A JP 8238112 A JP8238112 A JP 8238112A JP 23811296 A JP23811296 A JP 23811296A JP H1080279 A JPH1080279 A JP H1080279A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、生体由来試料中の目的とする遺伝
子を前処理なしで直接増幅出来る核酸合成法を提供する
ことを目的とする。 【解決手段】 本発明は、生体由来試料中の遺伝子包含
体もしくは生体由来試料そのものと遺伝子増幅反応液を
混合し反応させる核酸合成法において、界面活性剤を添
加したことを特徴とする。例えばヒト血液を試料として
用い、ＰＣＲを行った結果、図３の電気泳動図に示す如
く，５％ Tween 20 を含有したＰＣＲ反応液を使用する
ことにより、１０％濃度となるように添加した血液から
も特異的なＰＣＲ産物を得ることができた。
子を前処理なしで直接増幅出来る核酸合成法を提供する
ことを目的とする。 【解決手段】 本発明は、生体由来試料中の遺伝子包含
体もしくは生体由来試料そのものと遺伝子増幅反応液を
混合し反応させる核酸合成法において、界面活性剤を添
加したことを特徴とする。例えばヒト血液を試料として
用い、ＰＣＲを行った結果、図３の電気泳動図に示す如
く，５％ Tween 20 を含有したＰＣＲ反応液を使用する
ことにより、１０％濃度となるように添加した血液から
も特異的なＰＣＲ産物を得ることができた。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は核酸合成法、特に、
ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction ：
以下ＰＣＲと略す）法による核酸合成法に関する。
ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction ：
以下ＰＣＲと略す）法による核酸合成法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＰＣＲ法は、ＤＮＡ鎖の中の特定の領域
をはさんで、プライマーを結合させ、ＤＮＡポリメラー
ゼを作用させて、ＤＮＡ合成反応を繰り返すことによっ
て、目的のＤＮＡ断片を数十万倍にも増幅できる方法で
ある。ＰＣＲ法は、マリス氏らの発明である特開昭６１
−２７４６９７号に述べられている。
をはさんで、プライマーを結合させ、ＤＮＡポリメラー
ゼを作用させて、ＤＮＡ合成反応を繰り返すことによっ
て、目的のＤＮＡ断片を数十万倍にも増幅できる方法で
ある。ＰＣＲ法は、マリス氏らの発明である特開昭６１
−２７４６９７号に述べられている。
【０００３】ＰＣＲ法は、種々の試料中の核酸の高感度
分析法として使用可能で、特に動物体液由来の試料中の
核酸の分析法に使用できる。従って、ＰＣＲ法は、感染
症や遺伝病やガンの診断等に利用される。さらに、ＰＣ
Ｒは移植や親子鑑定の際のＤＮＡタイピングの検査にも
適した方法である。これらの場合末梢血液が検査対象に
選ばれる場合が多い。
分析法として使用可能で、特に動物体液由来の試料中の
核酸の分析法に使用できる。従って、ＰＣＲ法は、感染
症や遺伝病やガンの診断等に利用される。さらに、ＰＣ
Ｒは移植や親子鑑定の際のＤＮＡタイピングの検査にも
適した方法である。これらの場合末梢血液が検査対象に
選ばれる場合が多い。
【０００４】ＰＣＲ法の１つの欠点は色素、たんぱく、
糖類あるいは未知の夾雑物が反応を阻害することであ
る。すなわち、代表的な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであ
るThermus aquaticus 由来のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
をはじめ、多くのＤＮＡポリメラーゼは、微量の体液由
来の夾雑物がＰＣＲ反応液中に混在しても、ＰＣＲが強
く阻害されることが良く知られている。通常、ＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼ用の反応液を作製するためには、あら
かじめ２５℃においてｐＨ８．３の１ＭTris-HCl等を用
いて、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液（100mM Tris-HCl,5
00mM KCl,10-40mMMgCl2 ）を作製しておく。そして、使
用時に、この緩衝液を１倍濃度に希釈したものに、dAT
P,dCTP,dGTP,dTTP をそれぞれ 200μＭ、必要なプライ
マーを0.2-1.0 μＭ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを2.5u
nits/100μl となるように添加し、さらに必要によって
は、ゼラチンやＢＳＡや界面活性剤等の添加物を加え、
鋳型ＤＮＡを加えてＰＣＲを行う。しかし、このような
反応液を用いた場合、微量の体液由来の夾雑物がＰＣＲ
反応液中に混在しても、ＰＣＲが強く阻害されることに
なる。
糖類あるいは未知の夾雑物が反応を阻害することであ
る。すなわち、代表的な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであ
るThermus aquaticus 由来のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
をはじめ、多くのＤＮＡポリメラーゼは、微量の体液由
来の夾雑物がＰＣＲ反応液中に混在しても、ＰＣＲが強
く阻害されることが良く知られている。通常、ＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼ用の反応液を作製するためには、あら
かじめ２５℃においてｐＨ８．３の１ＭTris-HCl等を用
いて、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液（100mM Tris-HCl,5
00mM KCl,10-40mMMgCl2 ）を作製しておく。そして、使
用時に、この緩衝液を１倍濃度に希釈したものに、dAT
P,dCTP,dGTP,dTTP をそれぞれ 200μＭ、必要なプライ
マーを0.2-1.0 μＭ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを2.5u
nits/100μl となるように添加し、さらに必要によって
は、ゼラチンやＢＳＡや界面活性剤等の添加物を加え、
鋳型ＤＮＡを加えてＰＣＲを行う。しかし、このような
反応液を用いた場合、微量の体液由来の夾雑物がＰＣＲ
反応液中に混在しても、ＰＣＲが強く阻害されることに
なる。
【０００５】そこで、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅に先立
つて被験物から細胞、細菌、ウィルス等（以下、遺伝子
包含体と称する）を分離し、そして、その遺伝子包含体
からのＤＮＡの抽出が必要である。阻害を除去するため
に、酵素、界面活性剤、カオトロピック剤等により遺伝
子包含体を分解し、その後、フェノールあるいはフェノ
ール・クロロホルム等を用いて、遺伝子包含体の分解物
からＤＮＡを抽出する方法が従来より使用されている。
最近ではＤＮＡ精製法として、イオン交換樹脂、ガラス
フィルターあるいはタンパク凝集作用を有する試薬が使
用されている。
つて被験物から細胞、細菌、ウィルス等（以下、遺伝子
包含体と称する）を分離し、そして、その遺伝子包含体
からのＤＮＡの抽出が必要である。阻害を除去するため
に、酵素、界面活性剤、カオトロピック剤等により遺伝
子包含体を分解し、その後、フェノールあるいはフェノ
ール・クロロホルム等を用いて、遺伝子包含体の分解物
からＤＮＡを抽出する方法が従来より使用されている。
最近ではＤＮＡ精製法として、イオン交換樹脂、ガラス
フィルターあるいはタンパク凝集作用を有する試薬が使
用されている。
【０００６】かような精製試薬キットの１つは「ＣＯＬ
ＬＥＣＴＡＧＥＮＥ」（ＡＭＲＡＤ社）の名で市販され
ている。この試薬キットを用いて試料は以下の手順で前
処理される。 １．抗凝固剤処理をした哺乳動物由来の全血を試験管中
で「マグネティクパーティクル」とよく混合し、これに
より白血球と「マグネティクパーティクル」を結合させ
る。 ２．「マグネティクパーティクル」に結合した白血球を
リン酸緩衝液で洗浄する。 ３．「マグネティクパーティクル」に結合した白血球
は、結合状態のままでプロテアーゼで分解し、これによ
りたんぱくは分解され、白血球中のＤＮＡが遊離され
る。 ４．試験管内容物は、プロテアーゼ残査を不活性化する
ため加熱し、冷却後白血球由来の遊離ＤＮＡを含む溶液
を得て、この溶液はそのまま次のＰＣＲに使用される。
ＬＥＣＴＡＧＥＮＥ」（ＡＭＲＡＤ社）の名で市販され
ている。この試薬キットを用いて試料は以下の手順で前
処理される。 １．抗凝固剤処理をした哺乳動物由来の全血を試験管中
で「マグネティクパーティクル」とよく混合し、これに
より白血球と「マグネティクパーティクル」を結合させ
る。 ２．「マグネティクパーティクル」に結合した白血球を
リン酸緩衝液で洗浄する。 ３．「マグネティクパーティクル」に結合した白血球
は、結合状態のままでプロテアーゼで分解し、これによ
りたんぱくは分解され、白血球中のＤＮＡが遊離され
る。 ４．試験管内容物は、プロテアーゼ残査を不活性化する
ため加熱し、冷却後白血球由来の遊離ＤＮＡを含む溶液
を得て、この溶液はそのまま次のＰＣＲに使用される。
【０００７】一方、ＲＮＡ−ＰＣＲは、目的ＲＮＡを検
出したり、その塩基配列の研究に使用され、従って、診
断の他にも医学用途、産業用途、環境用途等に利用され
る。例えば、ＲＮＡ−ＰＣＲは、肝炎の原因となるＣ型
肝炎ウィルス（ＨＣＶ）や後天性免疫不全症候群の原因
となるＨＩＶウィルスの検出に使われる。
出したり、その塩基配列の研究に使用され、従って、診
断の他にも医学用途、産業用途、環境用途等に利用され
る。例えば、ＲＮＡ−ＰＣＲは、肝炎の原因となるＣ型
肝炎ウィルス（ＨＣＶ）や後天性免疫不全症候群の原因
となるＨＩＶウィルスの検出に使われる。
【０００８】ＲＮＡ−ＰＣＲ法では、まず逆転写酵素の
存在下で目的ＲＮＡを鋳型にして相補的なＤＮＡ（ｃＤ
ＮＡ）が合成される。そして、このｃＤＮＡがＰＣＲで
増幅される。従来の技術では、試料中のＲＮＡをＲＮＡ
−ＰＣＲ法で取り扱う場合には、ＲＮＡの精製処理は必
須である。基本的にＲＮＡは、ＤＮＡ精製法と同様な方
法により精製される。
存在下で目的ＲＮＡを鋳型にして相補的なＤＮＡ（ｃＤ
ＮＡ）が合成される。そして、このｃＤＮＡがＰＣＲで
増幅される。従来の技術では、試料中のＲＮＡをＲＮＡ
−ＰＣＲ法で取り扱う場合には、ＲＮＡの精製処理は必
須である。基本的にＲＮＡは、ＤＮＡ精製法と同様な方
法により精製される。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの方法
を用いて試料中のＤＮＡやＲＮＡの精製を行っても、不
純物の完全な除去は困難であり、かつ、試料中の核酸の
回収量が一定しない場合も多く、このため引き続く核酸
合成が、とりわけ試料中の目的とする核酸の含量が少な
い場合には、うまくできない場合もある。また、これら
精製法は操作が煩雑で時間を要し、また操作中のコンタ
ミネーションの機会が高い。従って、これらの問題点を
解決するためには、より簡便で、かつ効果的な試料前処
理法が望まれる。
を用いて試料中のＤＮＡやＲＮＡの精製を行っても、不
純物の完全な除去は困難であり、かつ、試料中の核酸の
回収量が一定しない場合も多く、このため引き続く核酸
合成が、とりわけ試料中の目的とする核酸の含量が少な
い場合には、うまくできない場合もある。また、これら
精製法は操作が煩雑で時間を要し、また操作中のコンタ
ミネーションの機会が高い。従って、これらの問題点を
解決するためには、より簡便で、かつ効果的な試料前処
理法が望まれる。
【００１０】そこで、本発明は、生体由来試料中の目的
とする遺伝子を直接増幅出来る核酸合成法を提供するこ
とを目的とする。言い換えれば、生体由来試料、特に動
物体液由来試料もしくは試料中に含まれる遺伝子包含体
の反応系への直接添加によっても遺伝子増幅が可能な反
応法および反応試薬を提供することにある。
とする遺伝子を直接増幅出来る核酸合成法を提供するこ
とを目的とする。言い換えれば、生体由来試料、特に動
物体液由来試料もしくは試料中に含まれる遺伝子包含体
の反応系への直接添加によっても遺伝子増幅が可能な反
応法および反応試薬を提供することにある。
【００１１】さらに本発明の他の目的は、上記の目的に
適した試薬キットを提供することにある。要約すれば本
発明の目的は、動植物組織、体液および排泄物中に存在
する遺伝子、とりわけＤＮＡの増幅に適したＰＣＲ改良
法およびＰＣＲ反応試薬を提供することにある。
適した試薬キットを提供することにある。要約すれば本
発明の目的は、動植物組織、体液および排泄物中に存在
する遺伝子、とりわけＤＮＡの増幅に適したＰＣＲ改良
法およびＰＣＲ反応試薬を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本件発明者は、ＰＣＲ反
応液のｐＨを通常用いる場合より高くすることで、生体
由来の夾雑物が多量に存在しても、さらには血液や唾液
のような体液をＰＣＲ反応液に直接添加しても、ＰＣＲ
が可能になることを見いだしているが、更に本反応液中
に界面活性剤を添加することにより、ＰＣＲが容易にな
る事を見出し、本発明をなすに至ったのである。すなわ
ち、本発明は、生体由来試料中の遺伝子包含体もしくは
生体由来試料そのものと遺伝子増幅反応液を混合し反応
させる核酸合成法において、前記反応液中に界面活性剤
を含有させたことを特徴とする。
応液のｐＨを通常用いる場合より高くすることで、生体
由来の夾雑物が多量に存在しても、さらには血液や唾液
のような体液をＰＣＲ反応液に直接添加しても、ＰＣＲ
が可能になることを見いだしているが、更に本反応液中
に界面活性剤を添加することにより、ＰＣＲが容易にな
る事を見出し、本発明をなすに至ったのである。すなわ
ち、本発明は、生体由来試料中の遺伝子包含体もしくは
生体由来試料そのものと遺伝子増幅反応液を混合し反応
させる核酸合成法において、前記反応液中に界面活性剤
を含有させたことを特徴とする。
【００１３】本発明において、生体由来試料とは、動植
物組織、体液、排泄物等をいい、遺伝子包含体とは細
胞、細菌、ウイルス等をいう。体液には血液や唾液が含
まれ、細胞には血液から分離した白血球が含まれるが、
これらに限定されるものではない。
物組織、体液、排泄物等をいい、遺伝子包含体とは細
胞、細菌、ウイルス等をいう。体液には血液や唾液が含
まれ、細胞には血液から分離した白血球が含まれるが、
これらに限定されるものではない。
【００１４】遺伝子増幅反応液は、通常、ｐＨ緩衝液並
びにＭｇＣｌ2 、ＫＣｌ等の塩類、プライマー、デオキ
シリボヌクレオチド類及び合成酵素を含むものである。
また、上記の塩類は適宜他の塩類に変更して使用されて
いる。また、ゼラチン、アルブミン等の蛋白、ジメチル
スルホキシド等種々の物質が添加される場合がある。本
発明に使用することが望ましいｐＨ緩衝液は、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタンと塩酸、硝酸、硫酸
等の鉱酸の組合せであり、鉱酸の中で望ましいものは塩
酸である。また、トリシン、ＣＡＰＳＯ(3-N-Cyclohexy
lamino-2-hydroxypropanesulfonic acid) あるいはＣＨ
ＥＳ(2-(Cyclohexylamino)ethanesulfonic acid)と苛性
ソーダ、苛性カリとの組み合せによるｐＨ緩衝液等種々
のｐＨ緩衝液が使用され得る。ｐＨ調整された緩衝液
は、ＰＣＲ反応液の中で１０ｍＭから１００ｍＭの間の
濃度で使用される。
びにＭｇＣｌ2 、ＫＣｌ等の塩類、プライマー、デオキ
シリボヌクレオチド類及び合成酵素を含むものである。
また、上記の塩類は適宜他の塩類に変更して使用されて
いる。また、ゼラチン、アルブミン等の蛋白、ジメチル
スルホキシド等種々の物質が添加される場合がある。本
発明に使用することが望ましいｐＨ緩衝液は、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタンと塩酸、硝酸、硫酸
等の鉱酸の組合せであり、鉱酸の中で望ましいものは塩
酸である。また、トリシン、ＣＡＰＳＯ(3-N-Cyclohexy
lamino-2-hydroxypropanesulfonic acid) あるいはＣＨ
ＥＳ(2-(Cyclohexylamino)ethanesulfonic acid)と苛性
ソーダ、苛性カリとの組み合せによるｐＨ緩衝液等種々
のｐＨ緩衝液が使用され得る。ｐＨ調整された緩衝液
は、ＰＣＲ反応液の中で１０ｍＭから１００ｍＭの間の
濃度で使用される。
【００１５】本明細書中でプライマーは、核酸と重合用
試薬等の存在下に合成の開始点として働くオリゴヌクレ
オチドをいう。プライマーは一本鎖であることが望まし
いが、二本鎖も使用できる。もし、プライマーが二本鎖
の場合には、増幅反応に先立って一本鎖状にすることが
望ましい。プライマーは、公知の方法により合成するこ
とができるし、また、生物界から単離することもでき
る。本明細書中で核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡの一本鎖、二
本鎖およびＤＮＡとＲＮＡよりなる二本鎖を意味する。
核酸は種々の遺伝子包含体より入手できる。プライマー
が準備できれば、核酸は本発明により増幅することがで
きる。
試薬等の存在下に合成の開始点として働くオリゴヌクレ
オチドをいう。プライマーは一本鎖であることが望まし
いが、二本鎖も使用できる。もし、プライマーが二本鎖
の場合には、増幅反応に先立って一本鎖状にすることが
望ましい。プライマーは、公知の方法により合成するこ
とができるし、また、生物界から単離することもでき
る。本明細書中で核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡの一本鎖、二
本鎖およびＤＮＡとＲＮＡよりなる二本鎖を意味する。
核酸は種々の遺伝子包含体より入手できる。プライマー
が準備できれば、核酸は本発明により増幅することがで
きる。
【００１６】また、“合成酵素”は、プライマー付加に
よる核酸を合成する酵素あるいは、かような化学合成系
を意味する。適切な合成酵素としては、Ｅ．coliのＤＮ
ＡポリメラーゼＩ、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼのク
レノーフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ．litoralis ＤＮＡポリメラー
ゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラ
ーゼそして逆転写酵素などがあるが、これらにのみ限定
されるものではない。さらに、本明細書中で使用してい
る“熱安定性”は、高温下好ましくは、６５〜９５℃で
もその活性を保持する化合物の性質を意味する。
よる核酸を合成する酵素あるいは、かような化学合成系
を意味する。適切な合成酵素としては、Ｅ．coliのＤＮ
ＡポリメラーゼＩ、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼのク
レノーフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ．litoralis ＤＮＡポリメラー
ゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラ
ーゼそして逆転写酵素などがあるが、これらにのみ限定
されるものではない。さらに、本明細書中で使用してい
る“熱安定性”は、高温下好ましくは、６５〜９５℃で
もその活性を保持する化合物の性質を意味する。
【００１７】界面活性剤としては、Tween,NP40, Triton
×100 等種々のものが用いられる。反応液中の界面活性
剤の濃度としては、0.05% 以上、好ましくは 0.5% 以
上、さらに好ましくは５％以上である。特に５％のTwee
n 20を含有したＰＣＲ反応液を用いることにより、１０
％の血液を含有したＰＣＲ反応液からも十分な量のＰＣ
Ｒ産物を得ることができる。
×100 等種々のものが用いられる。反応液中の界面活性
剤の濃度としては、0.05% 以上、好ましくは 0.5% 以
上、さらに好ましくは５％以上である。特に５％のTwee
n 20を含有したＰＣＲ反応液を用いることにより、１０
％の血液を含有したＰＣＲ反応液からも十分な量のＰＣ
Ｒ産物を得ることができる。
【００１８】なお、本発明は遺伝子増幅反応実施者が自
身で反応液を調整して実施することもできるし、またこ
れらの反応液を構成する全部あるいは一部を試薬キット
にして提供すれば、本発明の実施がより確実、容易にな
る。
身で反応液を調整して実施することもできるし、またこ
れらの反応液を構成する全部あるいは一部を試薬キット
にして提供すれば、本発明の実施がより確実、容易にな
る。
【００１９】試薬キットは、ｐＨ緩衝液並びにプライマ
ー、デオキシリボヌクレオチド類及びポリメラーゼを含
み試料中の目的とする遺伝子を増幅する核酸合成法に用
いる試薬キットにおいて、界面活性剤を含有したことを
特徴とする。
ー、デオキシリボヌクレオチド類及びポリメラーゼを含
み試料中の目的とする遺伝子を増幅する核酸合成法に用
いる試薬キットにおいて、界面活性剤を含有したことを
特徴とする。
【００２０】本発明によれば、生体由来試料、特に動物
体液由来の試料の反応系への直接添加によっても遺伝子
増幅が可能となる。つまり、動物体液由来の試料、例え
ば、全血、血漿、血清又はダ液はそのまま増幅反応用の
試薬類と混合され遺伝子増幅反応が行われる。
体液由来の試料の反応系への直接添加によっても遺伝子
増幅が可能となる。つまり、動物体液由来の試料、例え
ば、全血、血漿、血清又はダ液はそのまま増幅反応用の
試薬類と混合され遺伝子増幅反応が行われる。
【００２１】本発明をＰＣＲに用いた場合、上述のいず
れの試料を用いた場合も、ＰＣＲの一工程としてＰＣＲ
反応液がＤＮＡの変性の目的で高温条件にさらされたと
きに、遺伝子包含体は破壊されＤＮＡが遊離される結
果、プライマー等のＰＣＲに必要な試薬がＤＮＡに接触
可能となる。この際、ＰＣＲ反応液中に血液成分やダ液
成分等が存在するが、それにもかかわらず、この改良さ
れたＰＣＲ法によればＤＮＡ増幅が生ずる。
れの試料を用いた場合も、ＰＣＲの一工程としてＰＣＲ
反応液がＤＮＡの変性の目的で高温条件にさらされたと
きに、遺伝子包含体は破壊されＤＮＡが遊離される結
果、プライマー等のＰＣＲに必要な試薬がＤＮＡに接触
可能となる。この際、ＰＣＲ反応液中に血液成分やダ液
成分等が存在するが、それにもかかわらず、この改良さ
れたＰＣＲ法によればＤＮＡ増幅が生ずる。
【００２２】
【実施例】本例は、血液を直接ＰＣＲ反応液に添加する
系において、界面活性剤添加の効果について検討したも
のである。試料はヒト血液を用いた。種々の濃度の界面
活性剤を添加したＰＣＲ反応液にヒト血液を 1.25 〜５
μｌ添加し（全50μｌ）、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応
液は、10mM Tris-HCl,50mM KCl, 1.5mM MgCl2 ,200μM
のdATP,dCTP,dGTP及びdTTP,1.0μM のprimer,2.5units/
100 μl のTaq DNA ポリメラーゼ（TaKaRa Taq: Takara
shuzo,Kyoto,Japan) を用い、界面活性剤添加後にｐＨ
８．８に調整した。なお、ＰＣＲのプライマーはヒトbe
ta-globin coding region 内に位置するplus鎖の塩基配
列を持つオリゴヌクレオチド（Ｐ１）及び minus鎖の塩
基配列を持つオリゴヌクレオチド（Ｐ２）であり、ＰＣ
Ｒにより 408bpの増幅産物を得ることができる（Saiki,
R.K.,Gelfand,D.H.,Stoffel,S.,Scharf,S.J.,Higuchi,
R.,Horn,G.T.,Mullis,K.B. and Erlich,H.A.(1988) Sci
ence 239,487-491.) 。
系において、界面活性剤添加の効果について検討したも
のである。試料はヒト血液を用いた。種々の濃度の界面
活性剤を添加したＰＣＲ反応液にヒト血液を 1.25 〜５
μｌ添加し（全50μｌ）、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応
液は、10mM Tris-HCl,50mM KCl, 1.5mM MgCl2 ,200μM
のdATP,dCTP,dGTP及びdTTP,1.0μM のprimer,2.5units/
100 μl のTaq DNA ポリメラーゼ（TaKaRa Taq: Takara
shuzo,Kyoto,Japan) を用い、界面活性剤添加後にｐＨ
８．８に調整した。なお、ＰＣＲのプライマーはヒトbe
ta-globin coding region 内に位置するplus鎖の塩基配
列を持つオリゴヌクレオチド（Ｐ１）及び minus鎖の塩
基配列を持つオリゴヌクレオチド（Ｐ２）であり、ＰＣ
Ｒにより 408bpの増幅産物を得ることができる（Saiki,
R.K.,Gelfand,D.H.,Stoffel,S.,Scharf,S.J.,Higuchi,
R.,Horn,G.T.,Mullis,K.B. and Erlich,H.A.(1988) Sci
ence 239,487-491.) 。
【００２３】 Ｐ１：５′ＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＴＡＣ３′ Ｐ２：５′ＧＧＡＡＡＡＴＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＧＣＡＧ３′ ＰＣＲは、９４℃、２分のプレヒーティングの後、９４
℃ １分間、５５℃１分間、７２℃ １分間の条件で４
０サイクル、最後に７２℃ ７分間のポリメライゼーシ
ョンを行った。ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを用いて、
３％アガロースを含む、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウ
ム添加ＴＡＥ（40mM Tris-acetate,1mM EDTA,pH8.0) 液
中で電気泳動を行い検出した。
℃ １分間、５５℃１分間、７２℃ １分間の条件で４
０サイクル、最後に７２℃ ７分間のポリメライゼーシ
ョンを行った。ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを用いて、
３％アガロースを含む、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウ
ム添加ＴＡＥ（40mM Tris-acetate,1mM EDTA,pH8.0) 液
中で電気泳動を行い検出した。
【００２４】抗血液凝固剤としてクエン酸ナトリウムま
たはＥＤＴＡ−２Ｋを用いて採血した血液を Tween 20
または NP40 を０．０５％含有したＰＣＲ反応液に添加
し、ＰＣＲを行った時の増幅産物の電気泳動図を図１に
示す。図中Ｍは分子量マーカー（制限酵素HincIIで切断
した 250ngのφＸ174RFDNA）、１はヒト血液１．２５μ
ｌ添加、２は２．５μｌ添加、３は５μｌ添加時のＰＣ
Ｒ産物の泳動レーンを示す。また、Ａは界面活性剤無添
加、Ｂは Tween 20 添加、Ｃは NP40 添加時の反応液を
用いてＰＣＲを行った時の結果を示している。
たはＥＤＴＡ−２Ｋを用いて採血した血液を Tween 20
または NP40 を０．０５％含有したＰＣＲ反応液に添加
し、ＰＣＲを行った時の増幅産物の電気泳動図を図１に
示す。図中Ｍは分子量マーカー（制限酵素HincIIで切断
した 250ngのφＸ174RFDNA）、１はヒト血液１．２５μ
ｌ添加、２は２．５μｌ添加、３は５μｌ添加時のＰＣ
Ｒ産物の泳動レーンを示す。また、Ａは界面活性剤無添
加、Ｂは Tween 20 添加、Ｃは NP40 添加時の反応液を
用いてＰＣＲを行った時の結果を示している。
【００２５】クエン酸ナトリウム含有血液を用いた場合
においては、反応液中の界面活性剤の有無にかかわら
ず、ＰＣＲ反応液中に２．５μｌの血液を添加するとＰ
ＣＲ産物が検出されなかった。一方、ＥＤＴＡ−２Ｋ含
有血液を用いた場合においては、界面活性剤を含有しな
い反応液を用いた時には、５μｌの血液添加でＰＣＲ産
物が検出できなかったのに対し、界面活性剤を含有した
反応液を用いた時には、５μｌの血液添加でもＰＣＲ産
物が検出できた。
においては、反応液中の界面活性剤の有無にかかわら
ず、ＰＣＲ反応液中に２．５μｌの血液を添加するとＰ
ＣＲ産物が検出されなかった。一方、ＥＤＴＡ−２Ｋ含
有血液を用いた場合においては、界面活性剤を含有しな
い反応液を用いた時には、５μｌの血液添加でＰＣＲ産
物が検出できなかったのに対し、界面活性剤を含有した
反応液を用いた時には、５μｌの血液添加でもＰＣＲ産
物が検出できた。
【００２６】次に、クエン酸ナトリウムを用いて採血し
た血液を０．５％ Tween 20 または５％ Tween 20 を含
有したＰＣＲ反応液に添加し、ＰＣＲを行った時の増幅
産物の電気泳動図を図２および図３に示す。なお、図中
の表示は、図１と同一である。図２において、界面活性
剤を含有しない反応液を用いた時には、２．５μｌの血
液添加でＰＣＲ産物が検出できなかったのに対し、０．
５％ Tween 20 を含有した反応液を用いた時には、２．
５μｌの血液添加でもＰＣＲ産物が検出できたことを示
している。
た血液を０．５％ Tween 20 または５％ Tween 20 を含
有したＰＣＲ反応液に添加し、ＰＣＲを行った時の増幅
産物の電気泳動図を図２および図３に示す。なお、図中
の表示は、図１と同一である。図２において、界面活性
剤を含有しない反応液を用いた時には、２．５μｌの血
液添加でＰＣＲ産物が検出できなかったのに対し、０．
５％ Tween 20 を含有した反応液を用いた時には、２．
５μｌの血液添加でもＰＣＲ産物が検出できたことを示
している。
【００２７】また、図３において、界面活性剤を含有し
ない反応液を用いた時には、５μｌの血液添加でＰＣＲ
産物が検出できなかったのに対し、５％ Tween 20 を含
有した反応液を用いた時には、５μｌの血液添加でもＰ
ＣＲ産物が検出できたことを示している。
ない反応液を用いた時には、５μｌの血液添加でＰＣＲ
産物が検出できなかったのに対し、５％ Tween 20 を含
有した反応液を用いた時には、５μｌの血液添加でもＰ
ＣＲ産物が検出できたことを示している。
【００２８】なお、図２、図３において、界面活性剤を
含有しない反応液を用いた時にＰＣＲ産物が検出できた
血液の量が異なるのは、異なったヒトの血液を用いたた
めに、ＰＣＲに対する阻害作用に差異が生じたためと考
えられる。
含有しない反応液を用いた時にＰＣＲ産物が検出できた
血液の量が異なるのは、異なったヒトの血液を用いたた
めに、ＰＣＲに対する阻害作用に差異が生じたためと考
えられる。
【００２９】
【発明の効果】本発明により、生体由来の試料から粗分
離した遺伝子包含体を核酸合成用反応液系に直接添加し
ても、効率良く、目的の遺伝子を合成することが可能と
なる。従って、核酸合成の際の核酸を含む試料の前処理
が簡便、迅速におこなえるようになる。特に血液試料の
前処理が簡便、迅速におこなえるようになる。また、本
発明により、遺伝子包含体を含有する生体由来試料を直
接核酸合成用反応液系に添加して、目的の遺伝子を効率
良く合成することが可能となる。
離した遺伝子包含体を核酸合成用反応液系に直接添加し
ても、効率良く、目的の遺伝子を合成することが可能と
なる。従って、核酸合成の際の核酸を含む試料の前処理
が簡便、迅速におこなえるようになる。特に血液試料の
前処理が簡便、迅速におこなえるようになる。また、本
発明により、遺伝子包含体を含有する生体由来試料を直
接核酸合成用反応液系に添加して、目的の遺伝子を効率
良く合成することが可能となる。
【００３０】更に、上述の試薬キットを使用すれば、本
発明にかかる改良遺伝子増幅法が容易に実施される結
果、本発明の効果である前処理の簡略化とあいまって、
遺伝子増幅法が簡便に行なえるようになる。
発明にかかる改良遺伝子増幅法が容易に実施される結
果、本発明の効果である前処理の簡略化とあいまって、
遺伝子増幅法が簡便に行なえるようになる。
【００３１】
配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列： ＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＴＡＣ
【００３２】配列番号：２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列： ＧＧＡＡＡＡＴＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＧＣＡＧ
【図１】０．０５％の Tween 20 または NP-40を含有し
た反応液を用いて、ＰＣＲを行った後の増幅産物のゲル
電気泳動の泳動図である。
た反応液を用いて、ＰＣＲを行った後の増幅産物のゲル
電気泳動の泳動図である。
【図２】０．５％の Tween 20 を含有した反応液を用い
て、ＰＣＲを行った後の増幅産物のゲル電気泳動の泳動
図である。
て、ＰＣＲを行った後の増幅産物のゲル電気泳動の泳動
図である。
【図３】５％の Tween 20 を含有した反応液を用いて、
ＰＣＲを行った後の増幅産物のゲル電気泳動の泳動図で
ある。
ＰＣＲを行った後の増幅産物のゲル電気泳動の泳動図で
ある。
Claims (2)
- 【請求項１】 生体由来試料中の遺伝子包含体もしくは
生体由来試料そのものと遺伝子増幅反応液を混合し反応
させる核酸合成法において、前記反応液中に界面活性剤
を含有させたことを特徴とする核酸合成法。 - 【請求項２】 ｐＨ緩衝液並びにプライマー、デオキシ
リボヌクレオチド類及びポリメラーゼを含み試料中の目
的とする遺伝子を増幅する核酸合成法に用いる試薬キッ
トにおいて、界面活性剤を含ませたことを特徴とする核
酸合成法に用いる試薬キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23811296A JP4503712B2 (ja) | 1996-09-09 | 1996-09-09 | 核酸合成法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23811296A JP4503712B2 (ja) | 1996-09-09 | 1996-09-09 | 核酸合成法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1080279A true JPH1080279A (ja) | 1998-03-31 |
| JP4503712B2 JP4503712B2 (ja) | 2010-07-14 |
Family
ID=17025361
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23811296A Expired - Lifetime JP4503712B2 (ja) | 1996-09-09 | 1996-09-09 | 核酸合成法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4503712B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004104196A1 (ja) * | 2003-05-20 | 2004-12-02 | G & G Science Co., Ltd. | 緩衝剤組成物 |
| JP2005192554A (ja) * | 2003-12-12 | 2005-07-21 | Dainippon Ink & Chem Inc | 核酸増幅方法 |
| JPWO2004104196A1 (ja) * | 2003-05-20 | 2006-07-20 | Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社 | 緩衝剤組成物 |
| WO2007052765A1 (ja) | 2005-11-02 | 2007-05-10 | Shimadzu Corporation | Rnaの抽出方法及びrnaの検出方法 |
| JP2016507242A (ja) * | 2013-02-25 | 2016-03-10 | バイオカーティス エヌ ヴイ | 核酸の単離 |
-
1996
- 1996-09-09 JP JP23811296A patent/JP4503712B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004104196A1 (ja) * | 2003-05-20 | 2004-12-02 | G & G Science Co., Ltd. | 緩衝剤組成物 |
| JPWO2004104196A1 (ja) * | 2003-05-20 | 2006-07-20 | Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社 | 緩衝剤組成物 |
| JP2005192554A (ja) * | 2003-12-12 | 2005-07-21 | Dainippon Ink & Chem Inc | 核酸増幅方法 |
| WO2007052765A1 (ja) | 2005-11-02 | 2007-05-10 | Shimadzu Corporation | Rnaの抽出方法及びrnaの検出方法 |
| JP2016507242A (ja) * | 2013-02-25 | 2016-03-10 | バイオカーティス エヌ ヴイ | 核酸の単離 |
| US10196673B2 (en) | 2013-02-25 | 2019-02-05 | Biocartis N.V. | Isolation of nucleic acids |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4503712B2 (ja) | 2010-07-14 |
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