JP2001299356A - 核酸合成法 - Google Patents

核酸合成法

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    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明は、生体由来試料中に存在する目的とす
る核酸を精製操作なしで直接増幅出来る核酸合成法を行
うのに有用な処理方法および保存方法を提供することを
目的とする。 【解決手段】本発明は、生体由来試料そのものと核酸増
幅反応液を混合し反応させる核酸合成法において、反応
前に試料を界面活性剤で処理し、核酸を含有する細胞・
菌体等の固形成分を破壊し、試料液中に均一に分散させ
ることを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は核酸合成法、特に、
ポリメラーゼ連鎖反応(Polymerase Chain Reaction :
以下PCRと略す)法による核酸合成法に関する。
【0002】
【従来の技術】PCR法は、DNA鎖の1本鎖への解
離、DNA鎖の特定の領域をはさんでプライマーの結
合、DNAポリメラーゼの作用によるDNA合成反応を
繰り返すことによって、目的のDNA断片を数十万倍に
も増幅できる方法である。PCR法は、マリス氏らの発
明である特開昭61−274697号に述べられてい
る。
【0003】PCR法は、種々の試料中の核酸の高感度
分析法として使用可能で、特に動物体液由来試料中の核
酸の分析法に使用できる。従って、PCR法は、感染症
や遺伝病やガンの診断・モニタリング等に利用される。
さらに、PCR法は移植や親子鑑定、個人の遺伝子情報
に基づいた医療等でのDNAタイピングの検査にも適し
た方法である。これらの場合末梢血液が検査対象に選ば
れる場合が多い。
【0004】PCR法の1つの欠点は色素、たんぱく、
糖類あるいは未知の夾雑物によって反応が阻害されるこ
とである。すなわち、代表的な耐熱性DNAポリメラー
ゼであるThermus aquaticus 由来のTaqDNAポリメ
ラーゼをはじめ、多くのDNAポリメラーゼは、微量の
生体由来の夾雑物がPCR反応液中に混在しても、PC
Rが強く阻害されることが広く知られている。 そこ
で、PCR法によるDNA増幅に先立つて被験物から細
胞、原虫、真菌、細菌、ウィルス等(以下、遺伝子包含
体と称する)を分離し、次に、その遺伝子包含体から核
酸を抽出する過程が必要となる。その方法としては、酵
素、界面活性剤、カオトロピック剤等により遺伝子包含
体を分解し、その後、フェノールあるいはフェノール・
クロロホルム等を用いて、遺伝子包含体の分解物から核
酸を抽出する方法が従来より使用されている。最近では
核酸抽出の過程において、イオン交換樹脂、ガラスフィ
ルターあるいはタンパク凝集作用を有する試薬が使用さ
れている。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの方法
を用いて試料中の核酸の精製を行っても、不純物の完全
な除去は困難であり、かつ、試料中の核酸の回収量が一
定しない場合も多く、このため引き続く核酸合成が、と
りわけ試料中の目的とする核酸の含量が少ない場合に
は、うまくできない場合もある。また、これら精製法は
操作が煩雑で時間を要し、また操作中のコンタミネーシ
ョンの機会が高い。従って、これらの問題点を解決する
ためには、より簡便で、かつ効果的な試料前処理法が望
まれる。
【0006】血液等の体液・尿等の液性の排泄物試料は
静置しておくとその細胞・菌体成分等の固形成分が沈降
し、目的とする核酸を含有する細胞・菌体等の不均一化
が起こる。そのためそれら試料を用いて直接核酸増幅す
る時には試料添加前にあらかじめ撹拌操作を行い試料中
の固形成分を均質に分布させる必要があった。
【0007】遺伝子検査のための検査材料としては、末
梢血液が用いられる場合が多い。我々は血液中の目的と
する核酸を直接増幅できる核酸合成法を提供する方法を
これまでに考案してきた。しかし、全血試料は放置して
おくと血球・菌体成分等が沈降し、目的とする遺伝子を
含有した血球・菌体等の不均一化が起こる。そのため血
液試料を直接PCRするときには添加操作前にあらかじめ
撹拌操作を行い均質に分布させる必要があった。 ま
た、体液および液性の排泄物試料を直接PCRに用いる時
も同様の操作が必要であった。
【0008】
【課題を解決するための手段】本件発明者は、界面活性
剤で試料を処理しそのまま核酸合成の鋳型として保存・
使用することを発明した。本発明は、特に血液等の体液
および尿等の液性の排泄物そのものと核酸増幅反応液を
混合し反応させる核酸合成法において、反応前に試料を
界面活性剤で処理し、たとえば核酸を含む固形成分を破
壊し、試料液中に均一に分散させる場合に有効である。
また、これによって殺菌・殺ウイルス等の効果が期待さ
れ、生体試料を取り扱う時に懸念される作業者の生体試
料からの感染の危険を低減することができる。すなわ
ち、本発明は、試料から目的の核酸を増幅する核酸合成
法において、生体由来試料を均質化した後、直接反応液
に添加して核酸を増幅することを特徴とする核酸合成法
である。ここで、「均質化」とは、核酸を試料液中に均
一に分散させることをいう。また、「直接」とは、均質
化以外の前処理が不要という意味である。
【0009】均質化には、界面活性剤を用いるのが好ま
しい。界面活性剤には陰イオン性界面活性剤・陽イオン
性界面活性剤・両性界面活性剤・非イオン性界面活性剤
がある。短時間内で核酸増幅に供する場合はこれらのど
れを用いてもよい。陰イオン性界面活性剤、非イオン性
界面活性剤の具体例は、後述するが、陽イオン性界面活
性剤としては、例えば、セチルトリメチルアンモニウム
ブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド
等、両性界面活性剤としては、例えば、CHAPS、レシチ
ン、リゾレシチン、ホスファチジルエタノールアミン、
N-ドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンス
ルフォネート等を用いることができる。
【0010】しかし、時間経過とともに凝集物が出現
し、核酸の試料液内での不均質化がおこる。それを解決
するためさらに鋭意検討したところ陰イオン性界面活性
剤を一定の濃度で使用することで凝集物が生じることを
回避する事が出来た。 例えば、血液試料をドデシル硫
酸塩(以下総称としてSDSという)やサルコシル、デオ
キシコール酸ナトリウム、コール酸ナトリウム等の陰イ
オン性界面活性剤で処理することによって均質化をはか
る。その際、試料を長期間安定的に均質状態で保存する
ためにはSDS・サルコシルの濃度は、試料液中に0.5%
以上、好ましくは2%程度混入するのがよい。
【0011】しかし、イオン性界面活性剤で処理した試
料を通常使用されている標準的な反応液に直接添加して
PCRを行っても、強い反応阻害が認められる。そこで
さらに、この反応阻害を抑制する方法を鋭意検討したと
ころ非イオン性の界面活性剤を反応に使用することによ
りこの反応阻害を抑制できることを見出した。非イオン
性の界面活性剤としてはNonidet P40、Tween20、ジギト
ニン、n-ドデシルマルトシド、オクチルグリコシド、オ
クチルチオグリコシド、Triton X-100、ラウリル酸シュ
クロース、Tethit等が使用できるが、これに限定される
ものではない。使用するNonidet P40、Tween20は増幅反
応液中にそれぞれ0.5%以上、好ましくは1から5%
存在するのがよい。非イオン性界面活性剤はイオン性界
面活性剤で均質化した試料液と混合してから反応液に添
加してもあらかじめ反応液に添加しておいてもよく、特
に添加の順序を規定しない。
【0012】また、本発明による試料の均質化を行え
ば、試料の長期保存が可能となる。したがって、本発明
は、生体由来試料を均質化して保存することを特徴とす
る試料の保存法をも提供する。保存期間は、試料の種
類、均質化を行う界面活性剤の種類、濃度、保存条件な
どによっても変わるが、例えば、血液試料を陰イオン性
界面活性剤で処理する場合は、室温においても数年間の
保存が可能となる。
【0013】本発明において、試料は生体由来試料中の
遺伝子包含体もしくは生体由来試料そのものをいい、生
体由来試料とは、動植物組織、体液、排泄物等をいい、
遺伝子包含体とは、細胞、原虫、真菌、細菌、ウィルス
等をいう。体液には血液、髄液、乳、唾液が含まれ、排
泄物には糞便、尿、汗が含まれ、細胞には血液中の白血
球・血小板が含まれるが、これらに限定されるものでは
ない。
【0014】核酸増幅反応液は、通常、pH緩衝液並び
にMgCl2、KCl等の塩類、プライマー、デオキシ
リボヌクレオチド類及び核酸合成酵素を含むものであ
る。また、上記の塩類は適宜他の塩類に変更して使用さ
れている。また、ゼラチン、アルブミン等のタンパク、
ジメチルスルホキシド等種々の物質が添加される場合が
ある。pH緩衝液は、トリス(ヒドロキシメチル)アミ
ノメタンと塩酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組合せであり、
鉱酸の中で望ましいものは塩酸である。また、トリシ
ン、CAPSO(3ーNーCyclohexylamino −2 −hydrox
ypropanesulfonic acid)あるいはCHES(2ー(Cycl
ohexylamino )ethanesulfonic acid )と苛性ソーダ、
苛性カリとの組み合わせによるpH緩衝液等種々のpH
緩衝液が使用され得る。pH調整された緩衝液は、核酸
増幅反応液の中で10mMから100mMの間の濃度で
使用される。
【0015】プライマーは、核酸と増幅用試薬等の存在
下に合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをい
う。プライマーは一本鎖であることが望ましいが、二本
鎖も使用できる。もし、プライマーが二本鎖の場合に
は、増幅反応に先立って一本鎖にすることが望ましい。
プライマーは、公知の方法により合成することができる
し、また、生物界から単離することもできる。
【0016】核酸合成酵素は、デオキシリボヌクレオチ
ド類付加により核酸を合成する酵素、あるいはかような
化学合成系を意味する。適切な核酸合成酵素としては、
E.coliのDNAポリメラーゼI、E.coliのDNAポ
リメラーゼのクレノーフラグメント、T4DNAポリメ
ラーゼ、TaqDNAポリメラーゼ、T.litoralisDN
Aポリメラーゼ、TthDNAポリメラーゼ、PfuD
NAポリメラーゼそして逆転写酵素などがあるが、これ
らにのみ限定されるものではない。
【0017】また、本発明では核酸増幅反応液のpHを
調節することにより、相乗効果が得られる。例えば、p
Hは、25℃の温度条件下で8.1以上、好ましくは
8.5〜9.5である。また、本発明では、核酸増幅反
応液にポリアミンを添加してもよい。
【0018】
【実施例】[実験例1]本例は、血液試料を終濃度2%
のサルコシルで処理したものを直接添加PCRを行った
実験である。試料はクエン酸処理ヒト血液を用いた。種
々の血液濃度の溶解処理液2μlを直接PCR反応液に
添加し(全50μl)、PCRを行った。PCR反応液
は、10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2 , 各200μ
M のdATP,dCTP, dGTP及びdTTP, 2.5% Nonidet P40, 各
0.4μM のprimer, 1.25 units のTaq DNA ポリメラーゼ
(TaKaRa Taq: Takara shuzo,Kyoto,Japan) を用いた。
なお、PCRのプライマーはヒトbeta-globin coding r
egion 内に位置するplus鎖の塩基配列を持つオリゴヌク
レオチド(GH20:配列番号1)及び minus鎖の塩基
配列を持つオリゴヌクレオチド(GH21:配列番号
2)であり、PCRにより 408bpの増幅産物を得ること
ができる(Saiki,R.K., Gelfand,D.H., Stoffel,S., Sch
arf,S.J.,Higuchi,R.,Horn,G.T.,Mullis,K.B. and Erli
ch,H.A.(1988) Science 239,487-491.) 。 GH20:5′GAAGAGCCAAGGACAGGT
AC3′ GH21:5′GGAAAATAGACCAATAGG
CAG3′
【0019】PCRは、94℃、4.5分間のプレヒー
ティングの後、94℃ 1分間、55℃1分間、72℃
1分間の条件で40サイクル、最後に72℃ 7分間の
ポリメライゼーションを行った。PCR終了後、反応液
5μlを用いて、2.5%アガロースを含む、0.5μ
g/ml臭化エチジウム添加TAE(40mM Tris-acetat
e, 1mM EDTA, pH8.0) 液中で電気泳動を行い検出した。
【0020】溶解液で処理した試料を直接PCR反応液
に添加し、PCRを行った時のPCR産物の電気泳動図
を図1に示す。図中Mは分子量マーカー、1は処理液中
の血液含有量が1/2のもの、2は処理液中の血液含有量
が1/4のもの、以下同様に3〜12は血液量が2倍づつ
段階希釈された処理液を添加してPCRを行った結果を
示す。なおNは血液不含の2%のサルコシル液を添加し
たものである。図より、1〜12で安定的かつ高感度に
検出できることがわかる。
【0021】[実験例2]本例は、血液試料を終濃度2
%のサルコシルで処理したものを室温で10ヶ月間保存
した後、直接添加PCRを行った実験である。試料はク
エン酸処理ヒト血液を用いた。種々の血液濃度の溶解処
理液2μlを直接PCR反応液に添加し(全50μl)、
PCRを行った。 反応に用いたPCR反応液の組成、
PCRの条件、PCR後の電気泳動の条件は実験例1と
同様である。 電気泳動図を図2に示す。
【0022】図中Mは分子量マーカー、1は処理液中の
血液含有量が1/2のもの、2は処理液中の血液含有量が1
/4のもの、以下同様に3〜12は血液量が2倍づつ段階
希釈された処理液を添加してPCRを行った結果を示
す。なおNは血液不含の2%のサルコシル液を添加した
ものである。図より、溶解処理後、長期間保存した場合
でも図1の場合と同様に安定的かつ高感度にPCR産物
が検出できることがわかる。
【0023】なお、本実施例では非イオン性界面活性剤
を用いているが、血液溶解処理液のPCR反応液への添
加量を減らすことで非イオン性界面活性剤非存在下でも
安定的にPCRを行うことが可能であり必ずしも必須で
はない。
【0024】
【発明の効果】本発明によれば、反応前に試料を界面活
性剤で処理し、核酸を含有する細胞・菌体等の固形成分
を破壊し、試料液中に均一に分散させることができるの
で、試料をあらかじめ攪拌操作を行い試料中の固形成分
を均質に分布させる必要がない。また、本発明によれ
ば、試料の長期保存が可能となる。
【配列表】<110>shimadzu corp. <120>Method for synthesis of nucleic acids <130>K1000145 <160>2 <210>1 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>1 gaagagccaaggacaggtac <210>2 <211>21 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>2 ggaaaatagaccaataggcag
【図面の簡単な説明】
【図1】溶解液で処理した試料を直接PCR反応液に添
加して、PCRを行ったときの増幅産物の電気泳動図
【図2】溶解液で処理した試料を長期保存した後、直接
PCR反応液に添加して、PCRを行ったときの増幅産
物の電気泳動図

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 試料から目的の核酸を増幅する核酸合成
    法において、生体由来試料を均質化した後、直接反応液
    に添加して核酸を増幅することを特徴とする核酸合成
    法。
  2. 【請求項2】界面活性剤を用いて試料を均質化すること
    を特徴とする請求項1記載の核酸合成法。
  3. 【請求項3】界面活性剤がイオン性界面活性剤である請
    求項2記載の核酸合成法。
  4. 【請求項4】イオン性界面活性剤が陰イオン性界面活性
    剤である請求項3記載の核酸合成法。
  5. 【請求項5】陰イオン性界面活性剤がサルコシル、ドデ
    シル硫酸塩(SDS等)である請求項4記載の核酸合成
    法。
  6. 【請求項6】均質化した試料を非イオン性界面活性剤を
    含む反応液で核酸合成することを特徴とする請求項1記
    載の核酸合成法。
  7. 【請求項7】非イオン性界面活性剤としてTween20 及び
    /又は Nonidet P40を用いることを特徴とする請求項6
    記載の核酸合成法。
  8. 【請求項8】生体由来試料を均質化して保存することを
    特徴とする試料の保存法。
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JP2004105009A (ja) テトラフェニルホウ素化合物から成る核酸分離用試薬とそれを用いる核酸分離方法

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