JP2004105009A

JP2004105009A - テトラフェニルホウ素化合物から成る核酸分離用試薬とそれを用いる核酸分離方法

Info

Publication number: JP2004105009A
Application number: JP2002267859A
Authority: JP
Inventors: Yuka Takeda; 武田　由香; Munetaka Ishiyama; 石山　宗孝; Masanobu Shiga; 志賀　匡宣
Original assignee: Dojindo Laboratory and Co Ltd
Current assignee: Dojindo Laboratory and Co Ltd
Priority date: 2002-09-13
Filing date: 2002-09-13
Publication date: 2004-04-08

Abstract

【課題】フェノール／クロロホルムを使用することなく、各種の生体試料から核酸を高回収量で高純度に単離・精製することのできる核酸分離技術を提供する。
【解決手段】下記の一般式（Ｉ）で表わされるテトラフェニルホウ素化合物から成る核酸分離用試薬。式中、ｎは、０，１または２の整数を示し、ｎが１または２の場合、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４は、互いに同一または別異の置換基であって、ハロゲン原子、または炭素数１〜４のアルキル基もしくはエーテル基（炭素原子の一部がハロゲン原子で置換されているものを含む）を示し、Ｍはアルカリ金属またはアルカリ土類金属を示す。対象とする生体試料を溶解緩衝液に溶解した後、この核酸分離用試薬の存在下に、無機塩または有機塩を添加することにより、目的の核酸以外の生体試料成分を沈殿させて、当該核酸を回収することができる。
【化１】

【選択図】　　　なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、各種の生体試料から核酸を単離・精製するための核酸分離用試薬とそれを用いる核酸分離方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ゲノム解析や遺伝子操作が飛躍的な進展を遂げ、今や分子生物学分野では核酸の取り扱いは必要不可欠となっている。取り扱う核酸は、動植物あるいは大腸菌のような細菌など各種の供給源から抽出され、その際、核酸の高分子量を維持し、かつ酵素反応を阻害しない高純度の核酸の単離が要求される。特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）やサザン解析法等の用途には、高純度の核酸を使用することが好ましい。この目的のために、多種多様な核酸の単離精製技術が報告され、また簡便なキットとして市販されている。核酸の単離精製とは、目的の核酸以外の共存成分、特にタンパクを可及的に除去する技術を如何に構築するかということである。
【０００３】
フェノール／クロロホルムと試料サンプルを混合し、核酸からタンパクを変性除去する古典的な方法が、確実に高純度の核酸が得られるため今なお用いられている。しかし、この方法には、フェノールやクロロホルムの人体（取扱者）に対する影響や、使用後のその廃棄に特殊な処理が必要である等の問題があった。
【０００４】
近年、フェノール／クロロホルムを使用しない方法として、以下の手法が報告されている。
（１）　グアニジン塩もしくはヨウ素塩を試料サンプルに添加し、核酸からタンパクを変性除去する方法。
（２）　高濃度の過塩素酸塩を試料サンプルに添加し、核酸からタンパクを塩析除去する方法。
（３）　アニオン交換樹脂に試料サンプル中の核酸を結合させ、タンパクを除去する方法。
（４）　シリカゲルメンブランに試料サンプル中の核酸を結合させ、タンパクを除去する方法。
これらは、いずれもフェノール／クロロホルムを使用しない点では優れた方法であるが、（１）では完全にタンパクを変性できないため、精製後の核酸にタンパクがまだ混入している、（２）では塩析する際、核酸も一緒に塩析される、（３）および（４）では核酸の回収量が低いといった問題があり、完全な核酸の精製方法とは言い難い。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、フェノール／クロロホルムを使用することなく、各種の生体試料から核酸を高回収量で高純度に単離・精製することのできる新しい核酸分離技術を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の目的を達成するために検討を重ねた結果、特定のホウ素化合物の存在下に、生体試料水溶液に無機塩または有機塩を加えると、タンパク質や糖などは沈殿するが、目的の核酸は上澄み液中に選択的に存在し得ることを見出し、本発明を導き出したものである。
【０００７】
かくして、本発明に従えば、下記の一般式（Ｉ）で表わされるテトラフェニルホウ素化合物から成ることを特徴とする核酸分離用試薬が提供される。
【０００８】
【化３】

【０００９】
但し、式（Ｉ）中、ｎは、０，１または２の整数を示し、ｎが１または２の場合、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４は、互いに同一または別異の置換基であって、ハロゲン原子、または炭素数１〜４のアルキル基もしくはエーテル基（炭素原子の一部がハロゲン原子で置換されているものを含む）を示し、Ｍはアルカリ金属またはアルカリ土類金属を示す。
【００１０】
本発明に従えば、さらに、生体試料から核酸を分離する方法であって、対象とする生体試料を溶解緩衝液に溶解した後、上記の核酸分離用試薬の存在下に、無機塩または有機塩を添加することにより、目的の核酸以外の生体試料成分を沈殿させて、当該核酸を回収する工程を含むことを特徴とする方法が提供される。
【００１１】
【発明の実施の形態】
式（Ｉ）に包含される化合物の一部は、これまで、特定のイオンに対する沈殿試薬等として知られているが、式（Ｉ）で表わされるテトラフェニルホウ素化合物が核酸分離用試薬として利用され得ることは全く知られていなかった。
【００１２】
既述したように、式（Ｉ）において、ｎは、０，１または２の整数を示す。すなわち、ホウ素原子（Ｂ）に結合する４個のフェニル基のそれぞれは無置換（ｎ＝０の場合）または２つの置換基を有する（ｎ＝１または２の場合）。ｎが１または２の場合、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４は互いに同一または別異の置換基を表わすが、一般的には同一の置換基を示す。そして、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４を構成する置換基は、ハロゲン原子または炭素数１〜４のアルキル基もしくはエーテル基であるが、ここで、炭素数１〜４のアルキル基またはエーテル基は、その炭素原子の一部がハロゲン原子で置換されていてもよい。Ｍはアルカリ金属またはアルカリ土類金属を示すが、好ましいのは、ナトリウムまたはリチウムであり、ナトリウムが特に好ましい。
【００１３】
かくして、本発明に従う核酸分離用試薬として用いられ式（Ｉ）で表わされるテトラフェニルホウ素化合物の特に好ましいものは下記の式（ＩＩ）で表わされるテトラフェニルホウ酸のナトリウム塩（ｔｅｔｒａｐｈｅｎｙｌｂｏｒａｔｅ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ）である。
【００１４】
【化４】

【００１５】
この他に、本発明の核酸分離用試薬として用いられるのに好ましい式（Ｉ）に包含されるテトラフェニルホウ素化合物のテトラフェニルボロン酸部位の化学構造式としては、下記の式（ＩＩＩ）〜（ＶＩ）で示されているものを例示することができる。
【００１６】
【化５】

【００１７】
【化６】

【００１８】
【化７】

【００１９】
【化８】

【００２０】
本発明に従えば、以上のようなテトラフェニルホウ素化合物の存在下に、生体試料の水溶液に無機塩または有機塩を添加することにより、分離しようとする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）以外の成分、すなわち、タンパク質、糖類、非分離対象の核酸の溶解分等が沈殿するが、目的の核酸は上澄液に残存するので、これを回収した後、適当な処理剤（核酸共沈液）を用いて沈殿させることにより単離することができる。このようにして核酸の単離・精製が可能となる詳細なメカニズムは未だ分からないが、式（Ｉ）で表わされるテトラフェニルホウ素化合物がＤＮＡやＲＮＡの特定の構造部分を介して核酸と選択的に相互作用することにより、塩によるタンパク質等の非分離対象成分に対する塩析効果が促進されるためと考えられる。
【００２１】
対象とする生体試料の種類、用いるテトラフェニルホウ素化合物や塩の種類等によるが、一般に、テトラフェニルホウ素化合物の濃度は、０．１〜１Ｍ、また、塩の濃度は、１〜１０Ｍ程度の高濃度とすべきである。核酸分離用試薬となるテトラフェニルホウ素化合物の添加の態様は、状況に応じて変えることができる。例えば、生体試料の溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ）中に予めテトラフェニルホウ素化合物を添加しておいてもよく、別の態様として、塩の添加による沈殿操作のときにテトラフェニルホウ素化合物を添加してもよい。
【００２２】
本発明においてタンパク質等を沈殿させるのに用いられる塩（無機塩または有機塩）としては、水中で、電離するものであれば、基本的には、使用可能である。しかし、特に高い収率で高純度の核酸の分離を行なうためには、生体試料に応じて好適な塩が見出されている。例えば、アガロースゲルから成る生体試料から核酸としてＤＮＡを分離する場合の好適な塩は酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ）であり、動物組織から成る生体試料から核酸としてＤＮＡを分離する場合の好適な塩はグアニジンチオシアネート（ｇｕａｎｉｄｉｎｅ　ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）であり、また、培養細胞から成る生体試料から核酸としてＲＮＡを分離する場合の好適な塩は塩化ナトリウムであることが見出されている。
【００２３】
以上のようにして、本発明の核酸分離用試薬および核酸分離方法は、動植物の組織や細胞、哺乳動物の血液、培養組織や細胞、アガロースゲルなどの各種の生体試料から核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を高収率且つ高純度に単離精製するのに適用することができる。
【００２４】
【実施例】
以下に、本発明の特徴をさらに具体的に示すため実施例を記述するが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。
下記の実施例のうち、実施例１〜実施例３は、本発明に従い各種の生体試料から核酸を単離精製する具体的方法を例示するものであり、また、実施例４〜実施例７は、本発明に従えば、高収率且つ高純度に核酸を単離精製できることを示すものである。
【００２５】
実施例１：アガロースゲルからＤＮＡの単離精製
試薬調製
（１）ゲル溶解緩衝液：０．１〜１Ｍのテトラフェニルホウ酸のナトリウム塩〔式（ＩＩ）の化合物〕および１〜１０％スクロースをＴＥ　ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭトリスＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）にて調製する。
（２）沈殿液：１〜１０Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）水溶液を調製する。
（３）ＤＮＡ共沈液：２０ｍｇ／ｍｌのグリコーゲン溶液を滅菌水にて調製する。
【００２６】
操作概要
ＥｔＢｒ等で染色したアガロースゲルから目的のバンドを切り出し、切り出したゲルにゲル溶解緩衝液を加える。ゲルが完全に溶解した後、沈殿液を加え、目的のＤＮＡ以外の成分を沈殿させる。遠心分離した後、上澄み液にＤＮＡ共沈用液を加え、更にエタノールを加え振盪する。遠心分離、上澄み液除去およびエタノール添加を２〜３回繰り返すことによりＤＮＡが単離精製される。
【００２７】
実施例２：動物組織からのＤＮＡの単離精製
試薬調製
（１）溶解緩衝液：１〜２０ｍＭのトリス、１〜２００ｍＭのＥＤＴＡ・２ＮＡおよび０．１〜１％のドデシル硫酸ナトリウム（ｐＨを７．０〜８．０）を調製する。
（２）プロテイナーゼＫ溶液：予め準備した溶解液（１０Ｍのトリス、２０ｍＭのＣａＣｌ_２、５０％（ｖ／ｖ）のグリセロール（ｐＨ７．５）にて１〜４０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ溶液を調製する。
（３）ＲＮａｓｅ溶液：リボヌクレアーゼＡ　１０〜１００ｍｇ（Ｓｉｇｍａ，　Ｔｙｐｅ　Ｉ−Ａ、カタログ番号：Ｒ　４８７５）を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）０．９ｍｌに溶解し、１００℃、１５分間加熱する。室温放置後、１Ｍのトリス（ｐＨ７．４）０．１ｍｌを加える。
（４）沈殿液Ｉ：０．１〜１Ｍのテトラフェニルボロン酸のナトリウム塩をＴＥ　ｂｕｆｆｅｒ　（１０ｍＭのトリス１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で調製する。
（５）沈殿液ＩＩ：１〜１０Ｍのグアニジンチオシアネート溶液を純水にて調製する。
【００２８】
操作概要
対象とする動物組織に、溶解緩衝液とプロテイナーゼＫ溶液を添加し組織を完全に溶解させる。さらにＲＮａｓｅ溶液を加えてＲＮＡを分解させる。次いで、先ず沈殿液Ｉを加えて混和させた後、沈殿液ＩＩを加え混和させる。遠心分離し、上澄み液にエタノールを加える。この操作を２〜３回繰り返すことにより所望のＤＮＡを単離精製することができる。
【００２９】
実施例３：培養細胞からＴｏｔａｌ　ＲＮＡ（全ＲＮＡ）の単離精製
試薬調製
（１）溶解緩衝液：１〜１０Ｍのグアニジンチオシアネート、１０〜３０ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび０．１〜１％ラウロイルサルコシン酸をＤＥＰＣ処理水にて調製する。
（２）ＤＮａｓｅ溶液：Ｍａｃａｌｏｉｄ　ｃｌａｙ懸濁液を用いてＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ　ＤＮａｓｅを調製する。
（３）ＤＮａｓｅ稀釈液：５０ｍＭのトリス１０ｍＭのＭｇＣｌ_２を純水にて調製する。
（４）沈殿液Ｉ：０．１〜１Ｍのテトラフェニルボロン酸のナトリウム塩をＴＥ　ｂｕｆｆｅｒ　（１０ｍＭのトリス１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で調製する。
（５）沈殿液ＩＩ：１〜１０ＭのＮａＣｌ溶液を純水にて調製する。
【００３０】
操作概要
細胞数が例えば３×１０^６〜１×１０^７ｃｅｌｌｓになるように細胞懸濁液を入れ、培地を除去した後、細胞ペレットをＰＢＳで懸濁洗浄し、遠心する。上澄みを除いた後、溶解緩衝液β−メルカプトエタノールを加えて細胞を完全に溶解する。沈殿液Ｉを加えて、混和した後、遠心分離する。上澄み液にエタノールを加え遠心分離し上澄みを除く残った沈殿物に２０倍稀釈ＤＮａｓｅ溶液を加える。その後、先ず沈殿液Ｉを加え、次いで沈殿液ＩＩを加える。遠心分離し、その上澄み液へのエタノールを添加する操作を２〜３回繰り返すことにより、所望のＲＮＡを単離精製できる。
【００３１】
実施例５：単離ゲノムＤＮＡのＵＶスペクトル
単離したゲノムＤＮＡの回収量および純度を調べた。実施例２に記述したような方法に従い、マウス肝臓等の各種生体試料から単離したＤＮＡをサンプルとして用いた。得られたＤＮＡペレットを５００μｌのＴＥ　ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭトリス、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶解し、ＴＥ　ｂｕｆｆｅｒをレファレンスとして分光光度計の２００〜７００ｎｍにおけるスペクトルを測定した。核酸に特異的な２６０ｎｍの吸収が見られた。マウス肝臓由来のＤＮＡのスペクトルを図１に示す。また、ＯＤ値とＤＮＡ量には１ＯＤ（２本鎖ＤＮＡの２６０ｎｍにおける値）＝５０μｇ／ｍｌの関係があることが確立されており、これに基づき、ＯＤ値によりＤＮＡ量を換算した。
さらに、タンパク質に特異的な吸収２８０ｎｍを測定し、そのＯＤ_{２６０／２８０}値を算出することで核酸の純度の目安が得られ、核酸の純度が高い場合、ＤＮＡでＯＤ_{２６０／２８０}値が約１．８となることも知られている。これらに基づき、各試料から得られるゲノムＤＮＡの回収量とその純度を表１に示す。このように本発明の方法によって単離精製されたゲノムＤＮＡは高純度であることが確認された。
【００３２】
【表１】

【００３３】
実施例５：制限酵素反応
本発明の方法により単離精製したゲノムＤＮＡをエンドヌクレアーゼ処理し、酵素阻害能を調べた。実施例２に記述した方法に従い、マウス肝臓から単離したＤＮＡをサンプルとして用いた。またＢａｍＨ１をエンドヌクレアーゼとして使用した。
操作
（１）５０ｕｇ／ｍｌ濃度の単離ＤＮＡ８８ｕｌに、１００ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ＭのＮａＣｌを含む５００ｍＭのトリスｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）１０ｕｌを加えた。
（２）１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ濃度のエンドヌクレアーゼ２ｕｌを加え、３７℃、１時間インキュベーションした。
（３）反応液４０ｕｌを０．６％アガロースにロードし、電気泳動分析した。
結果
単離ＤＮＡは３０〜５０Ｋｂｐ付近に単一のバンドを示した。また、酵素反応によりいずれのＤＮＡも消化され、スメアなバンドになっていることを確認した（図２）。細胞、組織および血液のいずれのサンプルでも同様の結果が得られた。したがって、本発明の方法で単離精製したＤＮＡは酵素阻害を起こさない高純度のものであることが判明した。
【００３４】
実施例６：単離ｔｏｔａｌ　ＲＮＡのＵＶスペクトル
本発明に従い単離精製したトータルＲＮＡの回収量および純度を調べた。実施例３に記述したような方法により、ＨｅＬａ細胞から単離したＲＮＡをサンプルとして用いた。
操作
（１）得られたＲＮＡペレットを５００ｕｌのＤＥＰＣ処理水（ジエチルピロカーボネート処理水）に溶解した。また、ＵＶスペクトル測定の際に、ＴＥ　ｂｕｆｆｅｒにて適当な濃度に稀釈した。
（２）ＴＥ　ｂｕｆｆｅｒをレファレンスとして分光光度計の２００〜７００ｎｍにおけるスペクトルを測定した。
結果
核酸に特異的な２６０ｎｍの吸収（図３参照）がみられた。また、よく知られた１ＯＤ（２６０ｎｍにおける１本鎖ＲＮＡの値）＝４０μｇ／ｍｌという関係から、ＯＤ値によりトータルＲＮＡ量を換算した。また、タンパク質に特異的な吸収が２８０ｎｍにあり、そのＯＤ_{２６０／２８０}値を測定することで核酸の純度の目安となり、核酸の純度が高い場合、ＲＮＡではＯＤ_{２６０／２８０}値が２．０前後となることが知られている。これらに基づき各試料から得られるｔｏｔａｌＲＮＡの回収量とその純度を表２に示す。したがって、本発明の方法によって単離精製されるｔｏｔａｌＲＮＡは高純度であることが確認された。
【００３５】
【表２】

【００３６】
実施例７：ＲＴ−ＰＣＲ反応
得られたＴｏｔａｌＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ反応を行ない、ｃＤＮＡの増幅能を調べることにより、その純度を確認した。ＨｅＬａ細胞から単離したＤＮＡをサンプルとし、ヒトβ−アクチン（Ｈｕｍａｎ　β−ａｃｔｉｎ）を特異的に認識するプライマーを用いた。
操作
（１）得られたＲＮＡをＤＥＰＣ処理水で溶解し、予め１ｕｇ／ｕｌに稀釈しておく。
（２）ＰＣＲ用マイクロチューブＲＴ／Ｐｌａｔｉｎｕｍ　Ｔａｑ　Ｍｉｘ　１ｕｌ、２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｘ（ａ　ｂｕｆｆｅｒ　ｃｏｎｔｅｉｎｉｎｇ　０．４ｍＭ　ｏｆ　ｅａｃｈ　ｄＮＴＰ，　２．４ｍＭ　ＭｇＳＯ_４）２５ｕｌ、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘ　１ｕｌおよびＤＥＰＣ処理水を２２ｕｌ入れ混合した（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃａｔ．　Ｎｏ．１０９２８−０３４）。
（３）（１）で調製したＲＮＡを１ｕｌ加え、ＲＴ−ＰＣＲ反応をスタートした。
（４）ＲＴ−ＰＣＲプログラム終了後、エタノール沈殿にてＲＴ−ＰＣＲ産物を回収した。
（５）回収したＲＴ−ＰＣＲ産物はＴＥ　ｂｕｆｆｅｒに溶解し、アガロースゲル電気泳動にて回収物の分析を行なった。
結果
結果を図４の電気泳動図に示す。得られたＲＴ−ＰＣＲ産物は、目的ｃＤＮＡサイズである３５３ｂｐにバンドとして確認された。したがって、本発明の方法による回収ＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲ反応を阻害することなくｃＤＮＡ増幅に寄与している高純度のものであることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によって単離精製されたゲノムＤＮＡの１例の紫外吸収スペクトルを示す。
【図２】本発明によって単離精製されたゲノムＤＮＡが酵素阻害を起こさないことを示す電気泳動図である。
【図３】本発明によって単離精製された全ＲＮＡの１例の紫外吸収スペクトルを示す。
【図４】本発明によって単離精製された全ＲＮＡがＲＴ−ＰＣＲ反応を阻害しないことを示す電気泳動図である。

Claims

下記の一般式（Ｉ）で表わされるテトラフェニルホウ素化合物から成ることを特徴とする核酸分離用試薬。

〔式（Ｉ）中、ｎは、０，１または２の整数を示し、ｎが１または２の場合、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４は、互いに同一または別異の置換基であって、ハロゲン原子、または炭素数１〜４のアルキル基もしくはエーテル基（炭素原子の一部がハロゲン原子で置換されているものを含む）を示し、Ｍはアルカリ金属またはアルカリ土類金属を示す。〕
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４が互いに同一の置換基を示す請求項１に記載の核酸分離用試薬。
Ｍがナトリウムまたはリチウムであることを特徴とする請求項２に記載の核酸分離用試薬。
テトラフェニルホウ素化合物が下記の式（ＩＩ）で表わされるテトラフェニルホウ酸のナトリウム塩であることを特徴とする請求項３に記載の核酸分離用試薬。
生体試料から核酸を分離する方法であって、対象とする生体試料を溶解緩衝液に溶解した後、請求項１〜４のいずれかに記載の核酸分離用試薬の存在下に、無機塩または有機塩を添加することにより、目的の核酸以外の生体試料成分を沈殿させて、当該核酸を回収する工程を含むことを特徴とする方法。
有機塩として酢酸ナトリウムを用い、アガロースゲルから成る生体試料から核酸としてＤＮＡを分離することを特徴とする請求項５に記載の核酸分離方法。
有機塩としてグアニジンチオシアネートを用い、動物組織から成る生体試料から核酸としてＤＮＡを分離することを特徴とする請求項５に記載の核酸分離方法。
無機塩として塩化ナトリウムを用い、培養細胞から成る生体試料から核酸としてＲＮＡを分離することを特徴とする請求項５に記載の核酸分離方法。