JP2011505153A - Ｒｎａのバイサルファイト処理 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＲＮＡをバイサルファイト処理する方法であって、処理済みＲＮＡを形成するように、ＲＮＡを、バイサルファイト試薬と５０〜９０℃で５〜１８０分間反応させる工程と、処理済みＲＮＡを回収する工程とを含む方法に関する。

Description

本発明は、バイサルファイトを使用してＲＮＡを処理する方法に関する。

一本鎖ＤＮＡでは、亜硫酸水素ナトリウム（sodium bisulphite）は、５−メチルシトシンのチミンへの極めて遅い速度の脱アミノ化と比較して、優先的にシトシンをウラシルに脱アミノ化することが実証されている（Shapiro, R.、DiFate, V.およびWelcher, M、（1974）J. Am. Chem. Soc. 96: 906-912）。この知見は、Ｆｒｏｍｍｅｒら１９９２年のバイサルファイトゲノム配列決定プロトコールの開発の根拠として役立った［参照により本明細書に組み込まれる、Frommer M、McDonald LE、Millar DS、Collis CM、Watt F、Grigg GW、Molloy PLおよびPaul CL. PNAS 89: 1827-1831（1992）］。要約すれば、現在実施されているＦｒｏｍｍｅｒ法は、以下の一般的な工程：ＤＮＡのアルカリ変性；亜硫酸水素ナトリウムを使用する脱アミノ化；脱塩による脱スルホン化と、それに続くアルカリ処理および中和を含む。このような条件は、ＤＮＡのバイサルファイト処理には適しているが、ＲＮＡは、使用される厳しい条件によって完全に破壊されるであろう。したがって、これらの条件下でＲＮＡの亜硫酸水素ナトリウム処理を利用するどんなアッセイも、分解により、臨床環境では役に立たないであろう。

出発材料としてＤＮＡを使用した場合でさえも生じる、バイサルファイト修飾手順およびその確立された変法の主な不利点の１つは、この手順が、元の投入ＤＮＡの８４〜９６％の間の分解をもたらすことがわかっていることである（GrunauらNucleic Acids Research 29（13）e65（2001））。この手順に伴う高損失は、少数の細胞をそのメチル化状態についてうまく分析すること、またはＤＮＡがすでに部分的に分解された状態にある古い保存試料をうまく分析することが、事実上、極めて困難であることを意味する。さらに、現行法に伴う特有の分解のために、ＤＮＡが断片化され、その結果、膨大な数の配列中の「ギャップ」のために、それをクローニングし、配列決定し、なんらかの意味のある様式で組み立てることができないので、公共のヒトゲノムプロジェクト（International Human Genome Sequencing Consortium, 2001， Nature, 409, 860-921）または民間のＣＥＬＥＲＡ配列決定プロジェクト（J Craig Venterら2001, Science, 291, 1304-1351）によって成功裏に適用されたものと同じ方法で、生物の完全なゲノムを配列決定し、組み立て、そのゲノム全体のメチル化プロフィールを決定することができない。上記の知見から理解できるように、このような条件は、ＲＮＡの完全な分解を引き起こし、ひいては、検出のための任意の下流手順を妨げる。

現在実施されているバイサルファイト法に伴うさらなる不利点は、一般に、ＤＮＡの小さい断片しか増幅できないことである。経験的に、概して、約５００塩基対（bp）未満はうまく処理し、増幅できることがわかっている。この技術は、大きな領域の未処理ゲノムＤＮＡ、一般に、最大約５０ｋｂを増幅することを可能にしている長距離ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの新規分子生物学法に適用できない。目下のところ、哺乳類ゲノム中の多数の遺伝子は、長さ５０ｋｂを超えるので、無傷（intact）の遺伝子のメチル化状態を分析することはさらに可能でない。この場合もやはり、上記の事実によって、バイサルファイト処理済みＲＮＡの増幅の場合はさらに困難であろう。

比較的小さい遺伝子（<4kb）であっても、メチル化状態を見るには、ＰＣＲ反応は、注目する遺伝子領域にわたってスタッガード（staggered）でなくてはならなかった（D. S Millar、K. K Ow、C. L. Paul、P. J. Russell、P. L. Molloy、S. J. Clarke、1999, Oncogene, 18（6）:1313-24; Millar DS、Paul CL、Molloy PL、Clarke SJ.（2000）J Biol Chem; 275（32）: 24893-9）。バイサルファイトＤＮＡ処理のために現在使用される方法はまた、骨の折れ、時間のかかるものであった。標準法は、通常、複数の試験管交換、カラム精製、透析、ＤＮＡをアガロースビーズに包埋することまたはゲノムＤＮＡの特定の領域の非変換などの問題を低減しようとして反応に添加剤を付加することを必要とする。

上記の問題点のために、今日までに開発されたＲＮＡのバイサルファイト処理のための標準法はなかった。Ｓｈａｐｉｒｏら（Shapiro R、Cohen BIおよびServis RE, 1970， Nature, 227: 1047-8）は、ＲＮＡの構造および機能を研究するためのツールとして、ＲＮＡに対するバイサルファイトの使用を最初に記載した。しかし、極めて多量のＲＮＡが使用され（５ｍｇ）、バイサルファイト試薬とともに７日間インキュベーションした後でさえ、当該方法は９２％しか効果的ではなかった。その他の人も、ＲＮＡのバイサルファイト処理を利用して、ＲＮＡの三次構造を決定しようとしてきたが（Lowdenら、1976, Nucl. Acids. Res. 76: 3383-96; Goddardら、1978, 89: 531-47; Digweedら、1982, 127: 531-37）、これらの方法は、核酸内のシトシンの、ウラシルへの極めて少ない変換しかもたらさない。続いて、Ｍｅｌｌｏｒらは（Mellor EJC、Brown FおよびHarris TJR, 1985, J Gen Virol, 66: 1919-29）、ＲＮＡのバイサルファイト変換のための方法を記載したが、完了するのに少なくとも１２０時間かかり、２．５μｇの出発ＲＮＡを必要とする複雑な工程でシトシンの６０〜８０％しか修飾されなかった。

本発明者らは、核酸をバイサルファイト処理する方法を先に開発している。このような方法は、ＤＮＡのバイサルファイト処理を記載する米国特許第７２８８３７３号およびＷＯ２００４／０９６８２５に開示されており、Ｍｅｔｈｙｌｅａｓｙ（商標）のもと、キットの形で市販されている。

ＤＮＡをサルファイト処理するためのその他の市販のキットは、商品名メチルＳＥＱｒバイサルファイト変換キット（Applied Biosystems、カタログ番号４３７４９６０）、Ｍｅｔｈｙｌａｍｐ−９６ＤＮＡ修飾キット（Epigentek、カタログ番号Ｐ−１００８）、ＥｐｉＴｅｃｔバイサルファイトキット（Qiagen、カタログ番号５９１０４）およびＥＺ ＤＮＡメチル化ディレクトキット（Zymo Research、カタログ番号Ｄ５０２０）のもとで販売されている。

したがって、ＲＮＡのバイサルファイト処理を行うため、特に、少量の出発材料を探索するために、実質的にＲＮＡ分解が生じず、既知のＲＮＡ処理に伴う１つまたは複数の問題を克服、または少なくとも低減する、より信頼のおける方法が必要である。

本発明者らは、広範な調査および研究によって、ここで、ＲＮＡの最少の分解しかもたらさないか、全く分解をもたらさない、極めて少ないＲＮＡ試料のバイサルファイト処理、分析および回収を可能にする、ＲＮＡのバイサルファイト処理のためのロバストなアッセイを開発した。

本発明は、効率的であり、多数の異なる分子生物学的技術とともに使用するのに適応し、相当な分解を伴わずにＲＮＡの十分な回収を達成できる、ＲＮＡをバイサルファイト処理するための改善された方法に関する。

第１の態様では、本発明は、ＲＮＡをバイサルファイト処理する方法であって、
ＲＮＡを、処理済みＲＮＡを形成するように、約５０〜９０℃で約５〜１８０分間バイサルファイト試薬と反応させる工程と、
処理済みＲＮＡを回収する工程と
を含む方法を提供する。

本発明の一実施形態では、本方法は、回収されたＲＮＡの部分的または完全脱スルホン化を実施する工程をさらに含む。

本発明の別の実施形態では、本方法は、反応工程に先立って変性工程をさらに含む。

その他の実施形態では、本方法は、ＲＮＡが、磁性ビーズなどの固相と結合され得る捕捉工程を含み得る。ＲＮＡが、１または複数の工程のために固相と結合している場合は、本方法はまた、固相からＲＮＡを回収するための溶出工程を含み得る。

バイサルファイト試薬は、亜硫酸水素ナトリウムまたはメタ重亜硫酸ナトリウムであり得る。バイサルファイト試薬は、メタ重亜硫酸ナトリウムであることが好ましい。反応工程は、バイサルファイト試薬を約１Ｍ〜約６Ｍの濃度で使用して実施することが好ましい。濃度は、約２Ｍ〜約４Ｍであることがより好ましい。特に好ましい実施形態では、バイサルファイト試薬の濃度は、約３Ｍである。

バイサルファイト反応工程は、約５〜１８０分間実施することが好ましい。好ましい実施形態では、反応工程は、約５〜１５０分間実施する。別の実施形態では、反応工程は、約５〜１２０分間実施する。さらなる一実施形態では、反応工程は、約５〜９０分間実施する。別の実施形態では、反応工程は、約５〜６０分間実施する。別の好ましい実施形態では、反応工程は、約１０〜３０分間実施する。特に好ましい実施形態では、反応工程は、約２０分間実施する。別の好ましい実施形態では、反応工程は、約３０分間実施する。さらなる好ましい一実施形態では、反応工程は、約４５分間実施する。別の好ましい実施形態では、反応工程は、約６０分間実施する。さらなる好ましい一実施形態では、反応工程は、約９０分間実施する。別の好ましい実施形態では、反応工程は、約１２０分間実施する。さらなる好ましい一実施形態では、反応工程は、約１５０分間実施する。

反応工程は、約５０℃〜約９０℃の温度で実施することが好ましい。別の実施形態では、反応工程は、約６５℃〜約８５℃の温度で実施する。さらなる一実施形態では、反応工程は、約６０℃〜約８０℃の温度で実施する。種々の好ましい実施形態では、反応工程は、約６０℃、７０℃、７５℃、８０℃または８５℃の温度で実施する。特に好ましい実施形態では、反応工程は、約７０℃の温度で実施する。

好ましい実施形態では、反応工程は、亜硫酸水素ナトリウムまたはメタ重亜硫酸ナトリウムを約３Ｍの濃度で使用して、約６０〜８０℃の温度で、約１０〜３０分間実施する。特に好ましい実施形態では、反応工程は、亜硫酸水素ナトリウムまたはメタ重亜硫酸ナトリウムを約３Ｍの濃度で使用して、約７０℃の温度で、約２０分間実施する。

反応工程は、バイサルファイト反応を増強できる添加剤の存在下で実施してもよい。添加剤は、ジチオトレイトール（DTT）、キノール、尿素、メトキシアミンまたはそれらの混合物であり得る。

本方法は、塩濃度を、核酸沈殿工程または処理済みＲＮＡと固相の結合を実質的に干渉しないレベルに低下させるために、反応工程後に希釈工程をさらに含み得る。希釈工程は、塩濃度を、約１Ｍ未満、好ましくは、約０．５Ｍ未満に低下するよう、水を使用して実施してもよい。

回収工程は、希釈された処理済みＲＮＡを沈殿させること、または結合している処理済みＲＮＡから亜硫酸水素塩をはじめとする塩などの物質を実質的に除去するために、固体支持体を洗浄することを含み得る。ＲＮＡ沈殿は、アルコール沈殿剤を使用して実施してもよい。アルコール沈殿剤は、イソプロパノール、エタノール、ブタノール、メタノールまたはそれらの混合物であり得る。アルコールは、イソプロパノールであることが好ましい。固体支持体は、磁性ビーズを含み得る。

任意選択の変性工程は、上記方法に含まれる場合には、ＲＮＡを変性するために、通常、約５０℃〜約９０℃の温度で熱を使用して実施することが好ましい。変性工程は、ＲＮＡ試料を約８０℃に加熱することによって実施することがより好ましい。

回収された処理済みＲＮＡの脱スルホン化は、相当な量のＲＮＡ鎖破損を誘導することなく、処理済みＲＮＡに存在するスルホン酸基を除去して、スルホン酸基を実質的に含まないか、またはスルホン酸基の数が減少した、処理済みＲＮＡを得ることを含み得る。任意選択の脱スルホン化工程は、本方法に含まれる場合には、回収されたＲＮＡのｐＨを、バッファーまたはアルカリ試薬を用いて調整して、処理済みＲＮＡに存在するいくつかのスルホン酸基またはすべてのスルホン酸基を除去することによって実施し、それによって、スルホン酸基を実質的に含まないＲＮＡ試料を得てもよい。脱スルホン化工程は、約７．５〜約１１．５のアルカリｐＨで実施することが好ましい。ｐＨは、約８．５〜約１１．５であることがより好ましい。好ましい実施形態では、ｐＨは、約８．７である。別の好ましい実施形態では、ｐＨは、約１０．５である。さらに好ましい一実施形態では、ｐＨは、約１１．５である。

脱スルホン化は、約０℃〜約９０℃の温度で実施することが好ましい。種々の好ましい実施形態では、温度は、約５℃〜約８５℃、約１０℃〜約７０℃、約２０℃〜約６０℃または約３０〜約５０℃から選択される範囲であり得る。好ましい実施形態では、脱スルホン化は、約５℃、約１０℃、約２０℃、約３０℃、約４０℃、約５０℃、約６０℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃または約８５℃の温度で実施する。

脱スルホン化は、約１〜３０分間実施することが好ましい。種々の好ましい実施形態では、脱スルホン化は、約５〜２５分、または約１０〜２０分間実施する。特に好ましい実施形態では、脱スルホン化は、約１〜１０分、または約５〜１０分間実施する。

好ましい実施形態では、脱スルホン化は、ｐＨ約８．５〜約１１．５、約１０℃〜８５℃で、約１〜２０分間実施する。別の好ましい実施形態では、脱スルホン化は、ｐＨ約８．５〜約１１．５、約２０〜７５℃で、約５〜１５分間実施する。さらなる好ましい一実施形態では、脱スルホン化は、ｐＨ約８．５〜約１１．５、約２０〜６０℃で、約５〜１５分間実施する。別の好ましい実施形態では、脱スルホン化は、ｐＨ約８．５〜１１．５、約３０〜５０℃で、約５〜１０分間実施する。特に好ましい実施形態では、脱スルホン化は、ｐＨ８．５〜１１．５、約４０℃で、約５分間実施する。特に好ましい実施形態では、脱スルホン化は、ｐＨ約８．７、４０℃で５分間、またはｐＨ約１１．５、４０℃で約５分間実施する。

バイサルファイト処理済みＲＮＡの約７０％超が回収されることが好ましく、バイサルファイト処理済みＲＮＡの約７５％超が回収されることが好ましく、バイサルファイト処理済みＲＮＡがの約８０％超回収されることが好ましく、バイサルファイト処理済みＲＮＡの約９０％超が回収されることが好ましく、バイサルファイト処理済みＲＮＡの約９５％超が回収されることが好ましい。

脱スルホン化ＲＮＡの約７０％超が回収されることが好ましく、脱スルホン化ＲＮＡの約７５％超が回収されることが好ましく、脱スルホン化ＲＮＡの約８０％超が回収されることが好ましく、脱スルホン化ＲＮＡの約９０％超が回収されることが好ましく、脱スルホン化ＲＮＡの約９５％超が回収されることが好ましい。

本方法は、処理済みＲＮＡ試料を加工または分析する工程をさらに含み得る。

処理されるべき核酸の試料は、ＲＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡ両方の組合せを含み得る。試料は、精製された抽出物であっても、粗抽出物であってもよい。

試料は、組織、臓器、細胞、微生物、生体試料、または環境試料から調製してもよく、または得てもよい。

組織または臓器は、脳、結腸、泌尿生殖器、肺、腎臓、造血、乳房、胸腺、精巣、卵巣、子宮およびそれらの混合物からなる群から選択されることが好ましい。

微生物は、細菌、ウイルス、真菌、原虫、ウイロイドおよびそれらの混合物からなる群から選択されることが好ましい。

生体試料は、血液、尿、糞便、精液、脳脊髄液、洗浄、唾液、拭き取り検体、脳、結腸、泌尿生殖器、肺、腎臓、造血、乳房、胸腺、精巣、卵巣、子宮などの供給源から得た細胞または組織、胚または胚以外の系統から得た組織、環境試料、植物、細菌、細胞内寄生生物、ウイルス、真菌、原虫およびウイロイドをはじめとする微生物からなる群から選択されることが好ましい。

本方法は、反応容器中で実施してよい。反応容器は、試験管、プレート、毛細管、ウェル、遠心分離管、マイクロチューブ、スライド、カバースリップおよび表面からなる群から選択され得る。

本発明の方法は、ＲＮＡ試料の実質的な分解または損失を引き起こすことなく実施できることが有利であり、市販のキットを上回る改善に相当する。

ＤＮＡを処理するためにバイサルファイトを使用する既知法とは異なり、本方法は、分解を実質的にもたらさないか、ＲＮＡの分解を低減し、このことは、十分な無傷の鋳型が残存するので、バイサルファイト処理済みＲＮＡが、ＰＣＲなどの下流適用に適していることを意味する。したがって、本発明の方法を、ｑＰＣＲによる遺伝子発現分析および治療の成功を調べるための薬物療法の間のＲＮＡウイルスのウイルス量モニタリングなどの、試料中に存在するＲＮＡ量の正確な測定が必要とされる状況において使用できる。

本明細書を通じて、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単語「含む（comprise）」または「含む（comprises）」または「含んでいる（comprising）」などの変形は、記載された要素、整数もしくは工程または要素、整数もしくは工程の群を含むことを意味するが、任意のその他の要素、整数もしくは工程または要素、整数もしくは工程の群を含まないことを意味するものではないと理解されよう。

文書、作用、物質、装置、品目または本明細書に含まれている同様のものについての任意の議論は、単に、本発明に状況を提供することを目的とするものである。これらの問題のいずれかまたはすべてが、先行技術の基礎の一部を形成するか、本発明の優先日より前にオーストラリアにおいて存在したような、本発明が関連する技術分野における共通の一般知識であったということの承認ととられるべきではない。

本発明との関連で、任意の１つまたは複数の実施形態は、任意のその他の１つまたは複数の実施形態と組み合わせて採用され、すべてのこのような組合せは、本開示内容によって包含される。

本発明がより明確に理解され得るよう、好ましい形態を、以下の図面および実施例を参照して記載する。

前立腺癌細胞系統ＰＣ−３から単離されたＲＮＡから得たバイサルファイト処理済みＲＮＡの回収の比較を示す図である。ＲＮＡは、トリゾール（商標）（Invitrogen）を製造業者の使用説明書に従って使用して単離した。次いで、ＲＮＡを、以下の脱スルホン化バッファーに再懸濁した；Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファーｐＨ９．５、１０．５、１１．５および１２。次いで、指定の温度および時間でインキュベートした。インキュベーション後、イソプロパノールを使用してＲＮＡを沈殿させ、プレキャスト（２％）アガロースゲル（Invitrogen）に流した。９５℃で３０分間、標準的なＤＮＡ脱スルホン化を実施したところ、図１からわかるように、ＲＮＡ試料は完全に分解し、下流に適用できなかった。 ＲＴ−ＰＣＲにおいて陽性シグナルを生じさせることができる最も短い脱スルホン化時間を決定するために、種々の脱スルホン化時間を使用し、または脱スルホン化を行わずに、ＲＮＡの高投入量およびＨＩＶ−１逆転写酵素を使用してバイサルファイト変換されたＡｃｒｏｍｅｔｒｉｘ ＨＣＶ試料で実施された逆転写ＰＣＲ（RT-PCR）を示す図である。＃１：７６℃で０分脱スルホン化；＃２：７６℃で１分脱スルホン化；＃３：７６℃で２分脱スルホン化；＃４：７６℃で５分脱スルホン化；＃５：７６℃で１０分脱スルホン化；＃６：７６℃で１５分脱スルホン化；＃７：７６℃で１５分脱スルホン化（対照逆転写酵素）；＃８：ＲＴ陰性対照；＃９：ＰＣＲ陰性対照。 種々の逆転写酵素を使用してＲＴ−ＰＣＲにおける陽性シグナルを生じさせることができる最も短い脱スルホン化時間を決定するために、種々の脱スルホン化時間を使用し、低投入量のバイサルファイト変換されたＡｃｒｏｍｅｔｒｉｘ ＨＣＶを使用して、いくつかの異なる逆転写酵素を使用するＲＴ−ＰＣＲを示す図である。 ＴＥバッファーを用いる脱スルホン化のための最適条件を決定するために、種々のｐＨおよび温度のこのバッファーを用いる５分の脱スルホン化後の、低投入量のバイサルファイト変換されたＡｃｒｏｍｅｔｒｉｘ ＨＣＶ ＲＮＡでのＲＴ−ＰＣＲを示す図である。 ４０℃で５分間の異なる組成の２種のバッファーを用いる脱スルホン化後の、可変低投入量のバイサルファイト変換されたＡｃｒｏｍｅｔｒｉｘ ＨＣＶ ＲＮＡでのＲＴ−ＰＣＲを示す図である。結果は、一定の範囲のバッファーを使用して、広範なｐＨで脱スルホン化できることを示す。 １００ｍＭ ＮａＨＣＯ_３を使用する１０ＩＵのバイサルファイト変換されたＨＣＶ ＲＮＡの脱スルホン化に対するｐＨ、時間および温度の効果を示す図である。いくつかのバッファーによって許容され得、同時に、効果的に脱スルホン化する能力を維持する広範な条件を実証する。 ８６℃でｐＨ１０．５または７６℃でｐＨ１１．５のいずれかでＴＥバッファー中で、５、１０、１５、２０、２５および３０分間バイサルファイト処理されたＰＣ３ ＲＮＡから得られたｑＰＣＲデータを示す図である。 ７６℃で５分間、ＴＥバッファーｐＨ１１．５を用いて処理し、次いで、ＰＣＲ増幅したＲＮＡの希釈系列および増幅反応の効率を、バイサルファイト処理されたプライマーと同じ領域に対する未修飾の野生型プライマーと比較した、示す図である。 磁性ビーズを効果的に使用してＨＣＶ ＲＮＡを捕捉でき、そのＲＮＡを支持体と結合させたまま、バイサルファイト処理、回収、脱スルホン化および増幅を効率的に行うことができることを示す図である。 本発明および市販のキットを使用するＨＣＶ ＲＮＡのバイサルファイト処理の比較を示す図である。

ＲＮＡを処理するための実施形態を、以下に、限定されない詳細で記載する。

本発明は、ＲＮＡ試料を処理および分析する方法を提供する。本方法は、ＲＮＡの修飾のための、例えば、ＲＮＡのメチル化パターンまたはメチル化の変化を調べるために使用できる簡単な、高度に効率的な方法、遺伝子発現の定量化および薬物療法に応じたウイルスコピー数の定量化のために極めて少量のＲＮＡを測定する能力を提供するという点で有利である。本発明の方法は、これまでに可能であると考えられてきたものよりも、高い収率および高分子量ＲＮＡを伴い、ＲＮＡの完全破壊を伴わず、したがって、少量のＲＮＡの分析を可能にする、簡易化された手順ならびに多数の試料への容易な適用を提供する。

本発明は、ＲＮＡをバイサルファイト処理する方法であって、
ＲＮＡを、処理済みＲＮＡを形成するように、５０〜９０℃で約５〜１８０分間バイサルファイト試薬と反応させる工程と、
処理済みＲＮＡを回収する工程と
を含む方法に関する。

本明細書に開示される好ましい実施形態は、ＲＮＡをバイサルファイト処理する方法であって、
任意選択により、ＲＮＡを変性して、ＲＮＡ中に存在する任意の相当な二次構造を実質的に除去する工程と、
処理済みＲＮＡを形成するように、ＲＮＡを、バイサルファイト試薬と反応させ、反応物をインキュベートする工程と、
塩濃度を、核酸沈殿工程または固相への処理済みＲＮＡの結合を実質的に干渉しないレベルに低下させる工程と、
処理済みＲＮＡを回収する工程と、
任意選択により、相当な量のＲＮＡ鎖破損を誘導することなく、回収された処理済みＲＮＡの部分的または完全脱スルホン化を実施して、処理済みＲＮＡに存在するスルホン酸基を除去して、スルホン酸基を実質的に含まないか、またはスルホン酸基の数が減少した処理済みＲＮＡを得る工程と
を含む方法に関する。

本発明の方法は、ＲＮＡ試料の分析において特に有用である。

本発明の方法は、核酸試料、例えば、ＲＮＡの鎖（単数または複数）が、相当な程度には、破壊または剪断されないよう実施できるので有利である。また、本発明の方法によって、極めて少量の、例えば、０．５μｇ以下、例えば、約０．２μｇ以下、０．１μｇ以下、５００ｎｇ以下、２５０ｎｇ以下、１００ｎｇ以下、５０ｎｇ以下、１５〜１５０アトグラム、または６０〜１２０アトグラム（１アトグラム＝１×１０^−１８ｇ）程度の少ないＲＮＡの効率的なバイサルファイト処理が可能となる。

したがって、本発明は、一実施形態では、ＲＮＡを処理する方法を提供する。本発明の種々の実施形態では、本方法は、ＲＮＡを変性させる工程、ＲＮＡをバイサルファイト試薬とともにインキュベートすることによってヌクレオチドをスルホン酸基で修飾する工程、バイサルファイト処理済みＲＮＡを塩（亜硫酸水素塩を含む）から希釈またはそうでなければ精製する工程、修飾されたＲＮＡを沈殿させるか、または固相から修飾されたＲＮＡを溶出する工程、および修飾されたＲＮＡを反応させて、スルホン酸基を部分的にまたは完全に除去する工程のうちいくつかまたはすべての工程を含み得る。

任意選択の変性工程は、例えば、ＲＮＡに熱を提供することによって実施できる。任意選択の脱スルホン化工程は、通常、ＲＮＡを実質的に分解することなく、バイサルファイト処理済みＲＮＡに存在するスルホン酸基を部分的または完全に除去するよう制御された条件下で実施する。

試料は、組織、細胞から調製してよく、または血液、尿、糞便、精液、唾液、拭き取り検体、脳脊髄液、洗浄などの任意の生体試料、脳、結腸、泌尿生殖器、肺、腎臓、造血、乳房、胸腺、精巣、卵巣、子宮などの供給源から得た細胞または組織、胚または胚以外の系統から得た組織、環境試料、植物、細菌、細胞内寄生生物、ウイルス、真菌、原虫およびウイロイドなどをはじめとする微生物であり得る。本発明による処理に適した、最良の記載された哺乳類細胞種は、Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓら，１９８９年，Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，第２版，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ，９９５−９９７に要約されている。

ヒト、動物、植物、細菌およびウイルス起源の試料から得たＲＮＡの分析は、死後４８時間までの受精から得たすべての細胞、組織および臓器における、すべての生活環ステージ、ならびに、顕微鏡スライドなどの組織学的供給源に由来し得る試料、ブロックに包埋された試料、または合成もしくは天然表面から、もしくは液体から抽出された試料に及ぶものとする。

分析はまた、細胞外または細胞内様式で、ヒト疾患と関係している、原核生物または真核生物およびウイルス（またはそれらの組合せ）から得たＲＮＡを含む。

ＲＮＡ物質を得るための任意の適した方法を使用してよい。例として、それだけには限らないが、市販のＤＮＡ、ＲＮＡキットまたは試薬、ワークステーション、プロテアーゼ試薬を含有する標準細胞溶解バッファーおよび有機抽出手順が挙げられ、これらは当業者には周知である。

本発明の方法は、反応容器中で実施してもよい。反応容器は、試験管、プレート、毛細管、ウェル、遠心分離管、マイクロチューブ、スライド、カバースリップまたは任意の適した表面など、任意の適した容器であり得る。本方法は、核酸試料の分解または損失の可能性を低減するために、通常、１つの反応容器中で実施する。

一般に、変性工程は、熱処理を含むが、その他の適した変性剤を、それらが最初のＲＮＡ試料の完全性に影響を与えないという条件で使用してもよい。当業者には当然のことながら、いくつかの状況では、この変性工程は、経験的に決定されるように、必要でない場合もある。

一般に、バイサルファイト試薬は、亜硫酸水素ナトリウムまたはメタ重亜硫酸ナトリウムである。バイサルファイト試薬は、メタ重亜硫酸ナトリウムであることが好ましい。バイサルファイト試薬は、シトシン塩基のスルホン化を引き起こして、スルホン酸シトシンを生じ、これに、スルホン酸シトシンのスルホン酸ウラシルへの加水分解脱アミノ化が続く。しかし、当然のことながら、任意のその他の適したバイサルファイト試薬を使用してもよい（Shapiro, R.、DiFate, V．およびWelcher, M、（1974）J. Am. Chem. Soc. 96: 906-912）。

スルホン化試薬とのインキュベーションは、７より低いｐＨで、スルホン酸ウラシル基の形成に有利に働く温度で実施してもよい。７より低いｐＨは、シトシン塩基をスルホン酸シトシンに、続いて、スルホン酸ウラシルに変換するスルホン化反応を実施するのに最適である。しかし、本発明の方法は、必要に応じて、ｐＨ７より上のスルホン化反応を用いて実施してもよい。

スルホン化反応は、バイサルファイト反応を増強できる添加剤の存在下で実施してもよい。適した添加剤の例として、それだけには限らないが、ＤＴＴ、キノール、尿素、メトキシアミンが挙げられる。これらの試薬のうち、キノールは、還元剤である。尿素およびメトキシアミンは、バイサルファイト反応の効率を改良するために加えられる薬剤である。当然のことではあるが、その他の添加剤または薬剤もバイサルファイト反応に役立つよう提供され得る。

スルホン化反応の結果、ＲＮＡ試料中のメチル化シトシンは未変化のまま残り、メチル化されていないシトシンはウラシルに変換される。

スルホン化反応は、通常、約５０〜９０℃の温度で約５〜１８０分間実施する。種々の好ましい実施形態では、スルホン化反応は、約５０〜９０℃の温度で約５〜１５０分間、約５０〜９０℃で約５〜１２０分間、約５０〜９０℃で約５〜９０分間または約５０〜９０℃で約５〜６０分間実施する。代替実施形態では、スルホン化反応は、約５０〜９０℃で、所望のレベルのスルホン化を達成するのに十分な時間、例えば、約５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、７０分、８０分または約９０分実施する。特に好ましい一実施形態では、スルホン化反応は、約７０℃で約２０分間実施する。

通常、バイサルファイト試薬の濃度は、約１Ｍ〜約６Ｍ、好ましくは、約２Ｍ〜約４Ｍ、より好ましくは、約３Ｍである。

本発明の種々の実施形態において、特に好適であることがわかった反応条件は、以下のとおりである。処理されるべきＲＮＡ、またはその他の核酸は、最大２０μｌの容量に作製する。次いで、２０８μｌの３Ｍメタ重亜硫酸ナトリウム（BDH AnalaR番号１０３５６．４Ｄ）の新しく調製した溶液ｐＨ５．０（ｐＨは、１０Ｍ水酸化ナトリウム（BDH AnalaR番号１０２５２．４Ｘ）の添加によって調整してよい）および１２μｌの１００ｍＭキノール溶液（BDH AnalaR番号１０３１２２Ｅ）。加えられるキノールの濃度は、実験的に決定される、約１０〜５００ｍＭの範囲中の何であってもよい。次いで、溶液を、十分に混合し、任意選択により、２０８μｌの鉱油（Sigma分子生物学等級Ｍ−５９０４）で覆うか、または、加熱リッドサーマルサイクラー中で０．２ｍｌの試験管中で実施する。次いで、試料を、十分なバイサルファイト変換を見越した時間、適した温度、例えば、６０〜９０℃、好ましくは、７０℃または別の適した温度で、１０分〜約３時間、好ましくは、２０分静置する。この反応工程はまた、ＲＮＡが固相と結合している間に実施してもよい。当業者には当然であろうが、上記の容積、濃度およびインキュベーション時間および温度は、反応条件が核酸、例えば、ＲＮＡのスルホン化に適している限り、変えてもよい。

本方法は、その後の反応に対して阻害的である塩が、スルホン化核酸、すなわち、スルホン化ＲＮＡと共沈しないように、希釈工程を含み得る。好ましくは、塩濃度は、約１Ｍ未満、例えば、約０．５Ｍ未満に希釈する。通常、希釈工程は、水またはバッファーを使用して、塩濃度を約１Ｍ未満、例えば、約０．５Ｍ未満に低下させるよう実施する。例えば、塩濃度は、通常、約１ｍＭ〜約１Ｍ未満、特に、約０．５Ｍ未満、約０．４Ｍ未満、約０．３Ｍ未満、約０．２Ｍ未満、約０．１Ｍ未満、約５０ｍＭ未満、約２０ｍＭ未満、約１０ｍＭ未満、または必要に応じて、約１ｍＭ未満にさえ希釈する。当業者ならば、核酸との塩析を減少させ、その結果、その後の工程を、核酸試料の最小のさらなる精製または操作しか伴わずに実施できる、適した希釈を容易に決定できる。希釈は、通常、水中で実施するが、バッファーが相当に沈殿しない限り、または塩を核酸とともに相当に沈殿させて、その後の反応を阻害しない限り、任意の適したバッファー、例えば、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡまたはその他の生物学的バッファー中で実施してよい。通常、沈殿は、アルコールなどの沈殿剤を使用して実施する。核酸の沈殿のための例示的アルコールは、イソプロパノール、エタノールまたは任意のその他の適したアルコールから選択できる。

代替実施形態では、その後の精製工程のために、試料に結合試薬を加えて、反応したＲＮＡと固相支持体の結合を促進してもよい。次いで、結合しているＲＮＡを洗浄して、塩（例えば、亜硫酸水素塩）および任意のその他の不要な不純物を除去し、次いで、固体支持体から適当な溶出バッファー中に溶出してもよい。これは、固定された固体支持体、例えば、カラムまたは磁性可動性固体支持体、例えば、コーティングされた磁性ビーズに特に適合する。

本発明の実施形態に従って、１つまたは複数の工程を固体支持体で実施してもよい。一実施形態では、すべての工程を固体支持体で実施する。好ましい実施形態では、脱スルホン化工程は、固体支持体で実施する。

任意選択の脱スルホン化工程は、沈殿している処理済みＲＮＡのｐＨを約１１．５の最大ｐＨまでに調整することによって実施してもよい。しかし、いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分解を最小にするためには、より低いｐＨが好ましいものであり得る。高度にアルカリ環境、例えば、ｐＨ１２以上に対する曝露は、ＲＮＡ分子の完全分解をもたらし得、したがって、アルカリｐＨに対する曝露処理を最小限にし、鎖の破損を避けるまたは制限する。脱スルホン化工程は、適したバッファーまたはアルカリ試薬を用い、ｐＨ約７．０〜１１．５で効率的に実施できる。適したバッファーまたはアルカリ試薬の例として、ｐＨ７．０〜１１．５を有するバッファー、例えば、それだけには限らないが、ＴＥ（「Tris-EDTA」）、ＣＡＰＳ（「Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸」）、リン酸、グリシン、メチルアミンおよび炭酸水素ナトリウムが挙げられる。好ましい実施形態では、脱スルホン化は、８．５〜１１．５の間のｐＨで実施してよい。特に好ましい実施形態では、脱スルホン化は、ｐＨ８．７、１０．５またはｐＨ１１．５で実施してよい。特に好ましいバッファーとして、ＴＥ、炭酸水素ナトリウムおよびＣＡＰＳが挙げられる。当業者には当然であろうが、適したバッファーまたはアルカリ試薬は、利用可能な広範囲の既知バッファーおよびアルカリ試薬から選択してよい。

通常、脱スルホン化工程の温度範囲は、０℃以下、最大約９０^０Ｃであり、処理時間は、使用される条件に応じて、約１分〜約３０分またはそれ以上（例えば、最大約４５または６０分）で変わり得る。本発明の好ましい実施形態では、脱スルホン化は、約３０〜５０℃の温度で約１〜３０分間実施する。特に好ましい実施形態では、脱スルホン化は、約４０℃で約２〜２０分、より好ましくは、約５〜１０分、より好ましくは、約５分間実施する。当業者ならば、脱スルホン化反応を実施するのに適した時間および温度を容易に決定できる。十分な脱スルホン化を可能にするようインキュベーション時間を増大する限り、室温より低い温度も使用してよい。したがって、脱スルホン化工程は、１０℃未満、約５℃、約１０℃、約２０℃、約２２℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約３７℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約７６℃、約８０℃、約８５℃、約８６℃、約９０℃で実施してよい。脱スルホン化反応を実施するのに特に有用な温度は、約４０〜７５℃、好ましくは、約４０℃である。

一部の実施形態では、例えば、スルホン化ＲＮＡをコピーすることが可能な逆転写酵素を使用する場合には、核酸を脱スルホン化することが全く必要でないこともある。脱スルホン化が必要であるかどうか、または望ましいかどうかは、当業者によって実験的に容易に決定できる。

本発明の別の利点は、本方法は、メチルＳＥＱｒバイサルファイト変換キット（Applied Biosystems、カタログ番号４３７４９６０）、Ｍｅｔｈｙｌａｍｐ−９６ＤＮＡ修飾キット（Epigentek、カタログ番号Ｐ−１００８）、ＥｐｉＴｅｃｔバイサルファイトキット（Qiagen、カタログ番号５９１０４）、およびＥＺ ＤＮＡメチル化ディレクトキット（Zymo Research、カタログ番号Ｄ５０２０）などのその他の市販のキットを使用する処理方法よりもかなり短い時間枠で実施できるということである。

本発明は、ＲＮＡの効率的な特性決定ための方法を提供する。本方法は、ＲＮＡ試料で、効率的なスルホン化および脱スルホン化工程が実施されるのを可能にする。しかし、スルホン化工程も脱スルホン化工程も完全に実施される必要はなく、本明細書に開示されるように、その後、核酸の有無を特性決定するのに十分なだけであるということは理解される。当業者ならば、所望の分析には、これらの工程がほぼ完全に実施されるべきかどうか、または不完全な反応で十分であるかどうかは容易に決定できる。例えば、少数の細胞または少量のＲＮＡが使用される場合には、通常、より完全な反応が実施されることが望ましい。多量の核酸試料が特性決定されている場合には、あまり完全でないが、ＲＮＡ試料のその後の分析のために十分な反応生成物は依然として提供する反応が実施されてもよい。本発明の特定の利点として、極めて少量のＲＮＡ、例えば、約０．５μｇ以下、例えば、約０．２μｇ以下、約０．１μｇ以下、５００ｎｇ以下、２５０ｎｇ以下、１００ｎｇ以下、約１５〜１５０アトグラム、または約６０〜１２０アトグラムという量が処理され、特性決定されるのを可能にするということがある。

本明細書に開示されるように、本発明は、ＲＮＡを都合よく処理する方法を提供する。本方法は、ＲＮＡ分子のメチル化状態の分析のために、または遺伝子発現分析の方法のために、または薬物処理に応じたウイルス量モニタリングのための、低レベルのＲＮＡウイルス、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）のモニタリングのために使用してよい。

本発明の利点は、塩濃度を希釈することおよび核酸を沈殿させることまたは核酸と固体支持体を結合することによって、脱塩工程が高度に効率的に実施されるということである。希釈工程は、塩濃度を、核酸が沈殿されるか、固体支持体と結合される場合に、脱スルホン化などのその後の工程を干渉する量より低く低下させる。沈殿工程は、高度に効率的であり、任意選択により、核酸沈殿の効率を高める担体を含み得る。カラムまたは磁性ビーズなどの固体支持体の使用によって、最適な回収、結果までの時間の短縮が可能となり、容易に自動化可能である。したがって、本発明の方法は、損失を最小限に抑え、核酸試料の回収率を高める。したがって、本発明の方法は、極めて少量の出発材料が使用され、メチル化、遺伝子発現および病原体の検出に関して効率的に特性決定されるのを可能にするというさらなる利点を提供する。

さらに、本方法が、脱スルホン化工程を含む場合には、わずかにアルカリｐＨのバッファー溶液の使用を用いて、注目するＲＮＡが、実質的に断片化されるようになる可能性を低下させることができる。緩衝溶液のｐＨを、ｐＨ１１．５をかなり上回って高めることは、高分子量核酸、特に、ＲＮＡの極めて多量の断片化につながり得る。したがって、このような断片化を最小限に抑えることが望まれる場合には、ｐＨ約１１．５を下回るアルカリｐＨ、例えば、約８．５〜１１．５を通常使用する。

本発明のさらに別の利点は、反応を、各試料に対して単一の試験管または容器中で実施でき、ひいては、試料の損失を最小限に抑え、多数の試料の処理を可能にすることである。これまでの方法と比較した、本発明の方法のさらなる利点は、ＲＮＡを、一度スルホン化すると、Ｃｌａｒｋら，１９９４年によって記載される方法におけるように、標的ＲＮＡを完全に破壊する強塩基の添加を必要とするのではなく、むしろ塩基性ｐＨを有するバッファーに再懸濁し、脱スルホン化工程を実施できるということである。

本発明の方法を使用して、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡもしくは任意のその他の注目するＲＮＡ種、組織または生物にかかわらず、ＲＮＡ種のメチル化状態を特性決定できる。本発明の方法はまた、ゲノム配列決定法、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｒｏｍｍｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８２７−１８３１（1992）によって記載されるものとともに使用してもよい。

本発明は、試料のメチル化状態を調べる方法、または試料の遺伝子発現プロフィールを数量化する、もしくは患者試料中のウイルスの循環レベルを定量化するための方法をさらに提供する。本方法は、ＲＮＡを処理するための本発明の方法を使用して、試料で実施してもよい。試料のメチル化状態を調べる方法は、試料のメチル化状態を、参照試料に対して比較し、調べることができるよう、試験試料および対照試料を用い、並行して実施してよく、これも、やはり、遺伝子発現またはウイルス量モニタリングアッセイに適用できる。例えば、試料を比較し、全般的に、または特定の部位にメチル化の増大または減少があるかどうかを調べることができる。このような判定を使用して、本明細書に論じられるような疾患の予後を診断および／または判定できる。本方法は、例えば、ＨＣＶまたはＨＩＶなどのＲＮＡベースのウイルスの存在または定量化などの診断適用では、試料のメチル化状態を報告することをさらに含み得る。

本発明の方法の要素は、キットの形態で提供され得るということは理解される。キットは、本発明の方法を実施するための、適当な化学試薬、反応容器、例えば、試験管および使用説明書を含み得る。

方法および試薬
化学薬品は、以下のとおりに入手した：ＢｉｏＲａｄ製アガロース（Hercules CA；認定分子生物学等級番号１６１−３１０１）；ＢＤＨ製氷酢酸（Kylsyth,Australia; AnalaR 100015N）；ＢＤＨ製エチレンジアミン四酢酸（EDTA）（AnalaR 10093.5V）；Ａｌｄｒｉｃｈ製エタノール（St.Louis MO；２００プルーフＥ７０２−３）；Ｓｉｇｍａ製イソプロパノール（St. Louis MO；９９％＋Sigma Ｉ−９５１６）；Ｓｉｇｍａ製鉱油（M-5904）；Ｓｉｇｍａ製３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（S-7899）；Ｓｉｇｍａ製塩化ナトリウム（ACS試薬Ｓ９８８８）；およびＢＤＨ製水酸化ナトリウム（AnalaR番号１０２５２．４Ｘ）。

酵素／試薬は、以下のとおりに入手した：Ｐｒｏｍｅｇａ製ＰＣＲマスターミックス（Madison WI；番号Ｍ７５０５）；スーパースクリプトＩＩＩ逆転写酵素（Invitrogen）；ＨＩＶ逆転写酵素（Ambion番号ＡＭ２０４５）；ｉＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素キット（Biorad番号１７０８８９７）およびＳｉｇｍａ製ＤＮＡマーカー（Direct load PCRローラダー１００〜１０００ｂｐ、Sigma Ｄ−３６８７および１００〜１０Ｋｂ、Sigma Ｄ−７０５８）。

溶液は、以下のとおりとした：（１）１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／０．１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０〜１２．５；（２）３Ｍメタバイサルファイト（１０Ｎ ＮａＯＨ５００μｌ（BDH AnalaR番号１０３５６．４Ｄ）を含む水１０ｍｌ中、５．６ｇ；（３）１００ｍＭキノール（水５０ｍｌ中、０．５５ｇ；BDH AnalaR番号１０３１２２Ｅ）；（４）１００ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、ｐＨ８．０〜１１．５（BDH番号１０２４７）；（５）１０ｍＭ ＣＡＰＳ、ｐＨ１１〜１１．５（Sigma番号Ｃ６０７０）；（６）５０Ｘ ＴＡＥゲル電気泳動バッファー（Ｔｒｉｚｍａ塩基２４２ｇ、氷酢酸５７．１ｍｌ、ＥＤＴＡ３７．２ｇおよび１ｌまでの水）；および（７）５Ｘ アガロースゲルローディングバッファー（１％ブロモフェノールブルー（Sigma Ｂ６１３１）１ｍｌ、キシレンシアノール（Sigma Ｘ−４１２６）１ｍｌ、グリセロール（Sigma Ｇ６２７９）３．２ｍｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０ ８μｌ、５０Ｘ ＴＡＥバッファー２００μｌおよび１０ｍｌまでの水）。

組織および細胞系統
ＲＮＡは、トリゾール（商標）（Invitrogen）を製造業者のデータシートに指示されるとおりに使用して前立腺癌細胞系統ＰＣ３から単離した。

ＨＣＶ ＲＮＡは、ＯｐｔｉＱｕａｌ（登録商標）ＨＣＶ ＲＮＡ高陽性対照（Acrometrixカタログ番号９６−０２０３）から、ＱｉａＡｍｐ ＵｌｔｒａＳｅｎｓ（Qiagen）ウイルスキットを、製造業者の使用説明書に従って使用して単離し、５，０００ＩＵ／μｌの最終濃度で再懸濁した。

ＲＮＡのバイサルファイト変換
亜硫酸水素ナトリウム（Sigma ５９０００ ５００ｇ；ロット番号１１６Ｋ０７６１）３．３５ｇを、Ｘｃｅｅｄ試薬１（Methyleasy Xceedキット、Human Genetic Signatures、Sydney, Australia）５ｍｌに溶解した。この試薬を、十分に溶解するまで８０℃に加熱し、次いで、放冷した。

ヒドロキノン（Ｍｅｒｃｋ８．２２３３３．０２５０；ロット番号Ｋ３６１０００３３ ７０２）０．１１ｇを、ヌクレアーゼ不含水１０ｍｌに溶解した。

ＲＮＡ５μｌを、ＰＣＲ試験管中で、バイサルファイト試薬２２０μｌおよびキノール１２μｌと混合し、ＰＣＲ機器中で７０℃で２０分間インキュベートした。

ヌクレアーゼ不含水８００μｌを、グリコブルー（Ambion ＡＭ９５１５；ロット番号０７０５００３）２μｌとともに加え、試料を十分に混合し、次いで、イソプロパノール１ｍｌを加え、試料を４℃で１時間インキュベートした。

１６０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離することによってＲＮＡをペレットとした。

上清を廃棄し、ペレットを、中程度にボルテックス処理しながら、７０％エタノール１ｍｌで洗浄した。試料を１６０００×ｇ、４℃で７分間再度遠心分離した。

上清を廃棄し、ペレットを数分間風乾した。

ペレットを、脱スルホン化バッファー（Ｘｃｅｅｄ試薬５、Methyleasy Xceedキット、Human Genetic Signatures、Sydney, Australia）７０μｌに再懸濁し、ＰＣＲ機器中で、７６℃で０〜１５分間脱スルホン化した。

ＲＮＡを冷却し、次いで、反応液あたり以下を含む２μｌのマスターミックスにＲＮＡ １１μｌを加えた：
１０ｍＭ ｄＮＴＰＳ １μｌ
ランダムＨプライマー（３００ｎｇ／μｌ） １μｌ

試料を６５℃で５分間加熱し、次いで、氷上に、少なくとも１分間置き、その後、反応液あたり以下を含むマスターミックス７μｌを加えた：
ＨＩＶ−ＲＴ 対照ＲＴ
１０×ＨＩＶ−ＲＴバッファー ２μｌ ５×ＦＳバッファー ４μｌ
ＨＩＶ ＲＴ（１Ｕ／μｌ） １μｌ ０．１Ｍ ＤＴＴ １μｌ
ＲＮアーゼ ＯＵＴ １μｌ スーパースクリプトＩＩＩ １μｌ
水 ３μｌ ＲＮアーゼ ＯＵＴ １μｌ

試料を混合し、逆転写を以下のとおりに実施した；２５℃で２分、２７℃で２分、２９℃で２分、３１℃で２分、３３℃で２分、３５℃で２分、３７℃で３０分、４５℃で１０分、５０℃で１０分、７０℃で５分、次いで、１５℃で浸漬した。

反応液あたり以下を含む、ＰＣＲによる分析のために、ｃＤＮＡ５μｌをとった：
Ｐｒｏｍｅｇａマスターミックス ３７．５μｌ
Ｆ１プライマー（１００ｎｇ／μｌ） １．０μｌ
Ｒ０プライマー（１００ｎｇ／μｌ） １．０μｌ
水 ５．５μｌ

サイクルは以下のとおりとした：

以下の機器を使用した：ＰＣＲ機は、ＴｈｅｒｍａｌＨｙｂａｉｄ ＰＸ２（Sydney, Australia）であり、Ｇｅｌ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍは、Ｋｏｄａｋ ＵＶＩｔｅｃ ＥＤＡＳ２９０（Rochester NY）であり、微量遠心管は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４１５−Ｄ（Brinkman Instruments; Westbury NY）とした。

ＲＮＡ分離
２％アガロースプレキャストゲル（Invitrogen）を使用した。注目するＲＮＡ試料またはＲＴ−ＰＣＲ産物を、プレートのウェルに直接ロードし、ゲルをマザー−ベース（mother-base）（Invitrogen）を使用して溶解した。

ＲＮＡのバイサルファイト処理
本発明のバイサルファイト処理の有効性を実証する例示的プロトコールを以下に示す。このプロトコールは、首尾よく、実質的にすべての処理済みＲＮＡの回収をもたらした。当然のことではあるが、試料または試薬の容積または量は、変わり得る。

２０μｌの最終容量中のＲＮＡを、８０℃で２分間加熱し、標的分子内に存在する任意の二次構造を変性させた。５０℃を上回る温度でのインキュベーションを使用して、二次構造の変性の効率を改善することができる。高度の二次構造を有すると疑われる分子は、バイサルファイト処理の前にすべての構造を除去するために、より高い温度を必要とする場合がある。処理前に、ＲＮＡを加熱変性することは、必ずしも必要ではない場合もある。ＲＮＡ変性は、約３７℃〜約９０℃の任意の温度で実施してよく、約５分〜約８時間の長さで変わり得る。

インキュベーション後、３Ｍメタ重亜硫酸ナトリウム（新しく作製した、１０Ｎ ＮａＯＨ５００μｌを含む水１０ｍｌ中、５．６ｇ；BDH AnalaR番号１０３５６．４Ｄ）２０８μｌおよび１００ｍＭキノール（新しく作製した、水５０ｍｌ中、０．５５ｇ、BDH AnalR番号１０３１２２Ｅ）１２μｌを、連続して加えた。キノールは、還元剤であり、試薬の酸化を低減するのに役立つ。その他の還元剤も使用してよく、例えば、ジチオトレイトール（DTT）は、ＲＮアーゼの作用を阻害することがわかっているので特に有用である。試料を２００μｌの鉱油で覆うか、または反応を、加熱リッドサーマルサイクラー中の０．２ｍｌ ＰＣＲ試験管中で実施した。鉱油で覆うことは、試薬の蒸発および酸化を妨げるが、必須ではない。次いで、試料を７０℃で２０分間インキュベートした。一般に、バイサルファイト処理は、約５０℃〜約９０℃の任意の温度で実施してよく、約５分〜約１８０分の長さで変わり得る。

メタ重亜硫酸ナトリウムで処理した後、オイルを除去し、ＲＮＡ濃度が低い場合には、または沈殿後にペレットを可視化するのに役立つよう、ｔＲＮＡ（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌまたはグリコブルー２μｌを加えた。これらの添加剤は、任意選択であり、特にＲＮＡが低濃度で存在する場合には、これらの添加剤を使用して、標的ＲＮＡと共沈させることによって得られるＲＮＡの収率を改善できる。核酸の量が＜０．５μｇである場合には、通常、核酸の、より効率的な沈殿のための担体としての添加剤の使用が望ましい。

イソプロパノール精製処理は、以下のとおりに実施した：試料に水８００μｌを加え、混合し、次いで、イソプロパノール１ｍｌを加えた。水またはバッファーは、反応容器中のバイサルファイト塩の濃度を、塩が、注目する標的核酸とともに沈殿しないレベルに低下させる。通常、希釈は、本明細書に開示されるように、塩濃度が所望の範囲より低く希釈される限り、約１／４〜１／１０００である。

試料を再度混合し、４℃で最低５分間静置した。沈殿工程は、５分〜数時間の任意の期間、静置してよいが、試料を１時間以下で沈殿させることが好ましい。試料を、微量遠心管中で、１０〜１５分間回転させ、ペレットを、毎回ボルテックス処理を行いながら、７０〜８０％エタノールで１回〜２回洗浄した。この洗浄処理によって、核酸とともに沈殿した任意の残存する塩が除去される。

ペレットを乾燥させ、次いで、５０μｌなどの適した容量のＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）またはその他のバッファー、ｐＨ７．０〜１１．５に再懸濁した。ＴＥについて、ｐＨ１１．５のバッファーは、特に効率的であることがわかったが、その他のバッファーを用いる場合、より低いｐＨを効果的に使用できる。試料を、核酸を懸濁し、脱スルホン化するための必要に応じて、２０℃〜９０℃で約１〜３０分間インキュベートした。

ＰＣ３細胞の分析およびＰＣＲ増幅の感度
ＰＣ３細胞の培養物を、標準条件下で９０％コンフルエンスに増殖させた。細胞をトリプシン処理し、洗浄し、次いで、血球計算器を使用してカウントした。次いで、細胞を、必要に応じて希釈した。細胞を、トリゾール（Invitrogen）を、製造業者の使用説明書によって記載されるとおりに使用して溶解し、次いで、ＲＮＡを、上記のスルホン化法を使用して修飾した。

次いで、ＲＮＡを、０．２ｍｌのＰＣＲ試験管中で以下のとおりに希釈した；Ｔ／Ｅ ｐＨ８．０、１０μｌ中で、１／１００、１／１０００、１／１００００および１／１０００００。ＲＮＡを、先に記載したとおりに、４０サイクルの間増幅した。

バイサルファイト処理済みＲＮＡの分解に対するｐＨ、時間および温度の効果
図１からわかるように、温度およびｐＨが高いほど、ＲＮＡが分解される可能性が高い。バイサルファイト処理されたＤＮＡの通常の脱スルホン化温度は、９５℃で３０分間であり、図１からわかるように、９０℃で１５分間の処理でさえ、ＲＮＡの完全分解をもたらし、これは、材料を、ＰＣＲなどの下流適用にとって役に立たないものにする。ウイルス量モニタリングなどの適用のためにＲＮＡの正確な定量化をもたらすために、出発材料の相当な分解は避けなければならない。ＲＮＡの分解は、本来は無作為なものであるので、この無作為性が、試料間可変性に影響を及ぼし、ウイルス量の不正確な推定につながり、患者管理体制に対して重大な結果を有し得る。図１からわかるように、７０℃でさえ、１５分間のインキュベーション後にＲＮＡの相当な分解が観察され得、このことは、ＲＮＡに対する損傷を最小限に抑えるよう、この温度で脱スルホン化時間が減少されるべきであるということを示す。６０℃では、高ｐＨ脱スルホン化バッファー（ｐＨ１２）を使用する場合を除いて、全経時変化実験にかけて任意の試料の分解が、事実上、観察され得なかった。したがって、これらの結果から、ＴＥを脱スルホン化バッファーとして使用する場合の最適時間／ｐＨおよび温度範囲は、１１．５以下のｐＨを使用して、約６０℃〜７０℃以下で１５分未満であると示唆され得る。

ＨＩＶ ＲＴを使用する、バイサルファイト処理済みＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅に対する時間および温度の効果
図２および図３は、ＨＩＶ ＲＴを使用して、比較的多量の出発材料がある限り、バイサルファイト処理済みＲＮＡを、任意の相当な脱スルホン化を伴わずに増幅することが可能であることを示す。しかし、出発材料の量が少ない場合には、この実施例における最適シグナルを得るために、少なくとも１分の脱スルホン化が必要とされる。

バイサルファイト処理されたＤＮＡを、少なくとも２０分以上の脱スルホン化時間８０℃で増幅することは、任意の増幅されたバイサルファイト処理されたＤＮＡを作製するために、よく必要とされるので、データから（図２および図３参照のこと）、特定のＲＮＡ逆転写（RT）酵素が、そのＤＮＡポリメラーゼ対応物よりも、かなり「乱雑」であると思われるということも際立っている。しかし、逆転写酵素を用いる場合、標的の濃度がかなり高い限り、脱スルホン化を全く行わずにＲＮＡを増幅してもよい（図２および図３参照のこと）。これは、逆転写酵素は、硫酸基などのＲＮＡ分子上のかさ高い障害を迂回する能力を有するが、ＤＮＡ上の硫酸基は、ポリメラーゼが、障害に達した時点で、処理されたＤＮＡをコピーするのを停止させる妨害物を形成することが明らかであるということを示す。したがって、ＲＴ酵素の、この、ここで未知の特性は、いくつかの場合には、脱スルホン化工程を完全に避けることができる可能性を高めるので、バイサルファイト処理済みＲＮＡからＤＮＡ鎖をコピーするとなった場合に極めて有利である。図１からわかるように、硫酸基の除去に必要とされる高ｐＨおよび温度のために、バイサルファイト処理済みＲＮＡに最も損傷を引き起こすのは脱スルホン化工程であるので、この工程の除去は、費やされる時間を減少させるだけでなく、ＲＮＡ分解の低減または防止に大きく役立つ。

バイサルファイト処理済みＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅に対する、時間、温度および脱スルホン化バッファーのｐＨの効果
図４、５および６は、バイサルファイト変換されたＲＮＡ試料の効率的な脱スルホン化は、温度、時間およびバッファーのｐＨだけでなく、バッファーの組成にも応じて変わることを実証する。したがって、ＮａＨＣＯ_３およびＣＡＰＳのそれぞれについて、脱スルホン化を４０℃で５分間実施する場合には（図５）、種々のバッファーの、同一試料の脱スルホン化のための最適ｐＨは、ｐＨ８．７から１１．５の間で変わる。ＴＥバッファーについては、温度の増大は、低ｐＨを使用して効率的な脱スルホン化をもたらす（図４）が、１００ｍＭ ＮａＨＣＯ_３は、ＲＮＡを脱スルホン化するために、広範なｐＨにわたって効果的に使用できる（図６）。

本発明の特定の利点は、非常に少量のバイサルファイト処理済みＲＮＡ、例えば、１〜１０ＩＵのＨＣＶ ＲＮＡ（約１５〜１５０アトグラムのＲＮＡに相当する）の増幅の実証であり、このようにして、ＲＮＡが著しくは分解されていないことが確認される。ＲＮＡのバイサルファイト処理およびその後の検出は、これらの低レベル付近ではどこでも、以前は実証されていなかった。したがって、ＲＮＡ試料および所望の実験計画に応じて、種々のｐＨのさまざまなバッファーを使用し、種々の時間および温度で脱スルホン化することが可能である。

ＲＮＡを使用する脱スルホン化反応条件のリアルタイムＰＣＲ分析
図７は、低下したｐＨ（１０．５）では、高温（８６℃）でさえ、逆転写およびＰＣＲの前の少なくとも２０分のＴＥバッファーを用いる脱スルホン化の後にしか最適増幅曲線が作製されないことを示す。しかし、ｐＨを１１．５に高め、温度を低下させた場合には、これは、ｃＤＮＡの増幅効率を劇的に実質的に改善し、わずか５分の脱スルホン化後に、増幅の見掛けの相違はない。

結果は、単一ラウンドの一段階逆転写ＰＣＲを用いるＲＮＡのバイサルファイト処理を示す。逆転写は、遺伝子特異的プライマーと、それに続く４０サイクルのＰＣＲ増幅を使用して実施した。蛍光は、反応液にＳｙｔｏ９を組み込むことによって測定した。ｐＨ１１．５／７６℃を使用して、脱スルホン化はわずか５分で実施できるということがわかる。先行技術から、ｐＨの増大は、ＲＮＡにとって有害であろうと考えられていたので、これは、驚くべきことである。この実験から得られた結果は、ＲＮＡの実際の脱スルホン化は、最適化された条件下では極めて迅速に起こることを示す。

図８は、バイサルファイト処理および脱スルホン化のための最適条件を用いると、バイサルファイト処理済みＲＮＡの増幅によって、野生型ＲＮＡに相当する増幅シグナルを生じ、このことは、改善されたバイサルファイト手順が、投入ＲＮＡの損失を事実上もたらさないことを示す。

図８の結果は、投入ＲＮＡの希釈系列を使用する単一ラウンドの一段階逆転写ＰＣＲを使用するＲＮＡのバイサルファイト処理を示す。逆転写は、遺伝子特異的プライマーと、それに続く４０サイクルのＰＣＲ増幅を使用して実施した。蛍光は、Ｓｙｔｏ９を反応液に組み込むことによって測定した。結果は、反応は、脱スルホン化時間がわずか５分に低減される場合に感度の損失を全く被らないことを示す。さらに、希釈研究は、ＲＮＡのバイサルファイト処理は未処理のＲＮＡと比較して、感度の大きな損失をもたらさないことを示す。

バイサルファイト処理の際の固体支持体の使用
図９は、ＲＮＡのバイサルファイト処理の際に種々の固相支持体を使用できることを示す。Ａｃｒｏｍｅｔｒｉｘ ＨＣＶ ＲＮＡを、３つの異なる供給業者（Chargeswitch, Invitrogen；Genemag, Chemicell；およびMagmax, Ambion）製の磁性ビーズと結合させ、ビーズと結合しながら、バイサルファイト処理し、洗浄して、過剰のバイサルファイト試薬を除去し、次いで、溶出し、単一工程で脱スルホン化し、その後、ｉＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Biorad）を用いて逆転写し、続いてＰＣＲ増幅を行った。３種のビーズ種のうち２種は、この実施例において働き、したがって、バイサルファイト処理と適合し、そのＲＮＡ結合能を保持する。カラムなどのその他の適合する支持体も、この手順の間に使用してよい。固相の使用によって、手順の自動化および／または沈殿ベースの方法と比較して、結果までの時間の短縮が可能となる。処理済みＲＮＡは、必要に応じて、必要とされる手順の間の任意の点で固相と結合させても、またはＰＣＲ増幅を含む全手順を通じて固相と結合させてもよい。

市販のバイサルファイトキットを用いる比較
４種の主要な市販のバイサルファイト変換キットを使用して、ＨＣＶ ＲＮＡのバイサルファイト変換の比較を行い、結果を本発明の方法（「HGS」法と呼ばれる）と比較した。
Ａｃｒｏｍｅｔｒｉｘ ＨＣＶ ＲＮＡを精製し、１０，０００コピー、５，０００コピー、１，０００コピー、５００コピー、１００コピー、５０コピー、２０コピーおよび０コピーを、本明細書に開示されるＨＧＳ法、メチルＳＥＱｒバイサルファイト変換キット（Applied Biosystems、カタログ番号４３７４９６０）、Ｍｅｔｈｙｌａｍｐ−９６ＤＮＡ修飾キット（Epigentek、カタログ番号Ｐ−１００８）、ＥｐｉＴｅｃｔバイサルファイトキット（Qiagen、カタログ番号５９１０４）またはＥＺ ＤＮＡメチル化ディレクトキット（Zymo Research、カタログ番号Ｄ５０２０）のいずれかを、製造業者の使用説明書に従って使用してバイサルファイト変換した（表１）。

脱スルホン化および／または溶出に続いて、ＲＮＡを、本明細書に開示されるように逆転写した。２０μｌの総ｃＤＮＡのうち１μｌを、バイサルファイト変換されたＨＣＶを特異的に増幅するよう設計されている２種の異なるプライマーセットを使用してＰＣＲ増幅した。したがって、ＰＣＲでは、５００、１００、５０、１０、５、２．５、１および０コピーのＨＣＶ／反応がある。図１０から明らかなように、ＨＧＳ法は、すべてのＨＣＶを効率的に保持するか、ＨＣＶの効率的な増幅を可能にする唯一の方法であった。

まとめ
バイサルファイト処理されたＤＮＡを用いる場合、相当量の増幅を生じさせるために、試料は、少なくとも８０℃の温度で少なくとも２０分間以上スルホン化されることが多い。しかし、これは、標的の濃度がかなり高い限り、脱スルホン化を全く行わずに（図２および図３参照のこと）、または低い出発ＲＮＡ濃度を用いわずか５分の脱スルホン化を行って（図４、５および６）、ＲＮＡを増幅することができる種々の逆転写酵素とは対照をなす。得られたｃＤＮＡは、次に、その後の処理を行うことなく、従来法を使用するＰＣＲによってさらに増幅できる。これらの結果から、ある種の逆転写酵素は、バイサルファイト処理された核酸の増幅において、対応するＤＮＡポリメラーゼよりもかなり効率的であるようである。このことは、最適化された変換および脱スルホン化条件と併せて、ＲＮＡのバイサルファイト変換が効果的に実施できること、したがって、変換工程の間ＲＮＡ分子を無傷で維持する能力を相当に改善し、任意のＲＮＡベースのアッセイに良好な感度をもたらすことを意味する。

当業者には当然のことながら、特定の実施形態において示される本発明に、広く記載される本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、多数の変法および／または改変を行うことができる。したがって、本実施形態は、あらゆる点で、例示的と考えられるべきであって、制限的と考えられるべきではない。

Claims (30)

1. ＲＮＡをバイサルファイト処理する方法であって、
   処理済みＲＮＡを形成するように、ＲＮＡを、バイサルファイト試薬と５０〜９０℃で５〜１８０分間反応させる工程と、
   前記処理済みＲＮＡを回収する工程と
   を含む方法。
2. ＲＮＡを、バイサルファイト試薬と、５０〜９０℃で５〜１２０分間反応させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
3. ＲＮＡを、バイサルファイト試薬と、５０〜９０℃で５〜９０分間反応させる工程を含む、請求項２に記載の方法。
4. ＲＮＡを、バイサルファイト試薬と、５０〜９０℃で５〜６０分間反応させる工程を含む、請求項３に記載の方法。
5. ＲＮＡを、バイサルファイト試薬と、７０℃で２０分間反応させる工程を含む、請求項４に記載の方法。
6. 回収された前記ＲＮＡを部分的にまたは完全に脱スルホン化する工程をさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 脱スルホン化を、ｐＨ約１１．５までのアルカリｐＨで実施する、請求項６に記載の方法。
8. 脱スルホン化を、０〜９０℃の温度で１〜３０分間実施する、請求項６または７に記載の方法。
9. 脱スルホン化を、２０〜５０℃の温度で５〜２０分間実施する、請求項８に記載の方法。
10. 前記処理済みＲＮＡの７０％超が回収される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記処理済みＲＮＡの８０％超が回収される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記処理済みＲＮＡの９０％超が回収される、請求項１１に記載の方法。
13. 脱スルホン化ＲＮＡの７０％超が回収される、請求項６から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 脱スルホン化ＲＮＡの８０％超が回収される、請求項１３に記載の方法。
15. 脱スルホン化ＲＮＡの９０％超が回収される、請求項１４に記載の方法。
16. バイサルファイト試薬が、亜硫酸水素ナトリウムまたはメタ重亜硫酸ナトリウムから選択される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記回収工程を、ＲＮＡの沈殿によって、または固相分離によって実施する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記回収工程を、ＲＮＡの沈殿によって実施する、請求項１７に記載の方法。
19. 少なくとも１つの工程を、固相支持体上で実施する、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記処理工程、回収工程および脱スルホン化工程を、固相支持体上で実施する、請求項１９に記載の方法。
21. 前記固相支持体が、磁性ビーズまたはカラムを含む、請求項１９または２０に記載の方法。
22. 前記脱スルホン化工程を、４０℃の温度で実施する、請求項６から２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記脱スルホン化工程を、５分間実施する、請求項６から２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記脱スルホン化工程を、８．５から１１．５の範囲のｐＨで実施する、請求項３から２２のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記ｐＨが、８．７、１０．５または１１．５である、請求項２４に記載の方法。
26. アルカリｐＨが、炭酸水素ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（TE）バッファーまたはＮ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（CAPS）バッファーを用いて達成される、請求項７に記載の方法。
27. 処理されるＲＮＡの量が、０．５μｇ以下である、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 処理されるＲＮＡの量が、少なくとも１５〜１５０アトグラムである、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記反応工程の前に、変性工程をさらに含む、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、
    希釈液、バイサルファイト試薬およびアルカリから選択される試薬を含有する容器と、該試薬を使用するための使用説明書とを含むキット。