KR101912488B1 - 분자 검출 분석법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포를 파괴하고 핵산을 처리하는 조건 하에 생물학적 샘플을 바이설파이트 작용제로 직접 처리하는 단계; 처리된 샘플로부터 바이설파이트 작용제를 제거하는 단계; 및 처리된 샘플 내 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 분자 검출 분석법에 관한 것이다.

Description

분자 검출 분석법{MOLECULAR DETECTION ASSAY}
본 발명은 분자 검출 분석을 위한 샘플의 처리, 특히 질병 검출을 위한 핵산 검출 분석을 위한 임상적 샘플의 처리 방법에 관한 것이다.
인간의 분자 시험은 의학적 진단 및 환자 관리를 위해 점점 더 중요하게 되었다. 동물의 분자 시험은 수의학적 용도에서 중요성을 얻고 있다. 핵산 시험은 현대 법의학, 출입국, 친부 지정 및 다른 인간 신원 용도를 위한 필수 도구이다. 후성 유전학은 암 연구, 바이오마커의 식별, 소인 및 잠재적 약물 표적에 대해 점점 더 중요하게 된다. RNA 유전자형은 연구, 적용되는 시험 및 진단의 모든 영역에서 개체 또는 세포 간의 유전적 차이를 분석하기 위해 사용되는 용도의 범위를 포함한다. 생물학적 샘플을 다룰 때, 현재의 분자 시험은 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)과 같은 기법에 의한 핵산 검출을 수행하기 전 샘플의 특정한 전처리를 필요로 한다. 샘플 전처리는 현재 필수적인 것으로 고려되며, 다수의 상업적 키트 및 샘플이 개발되었고, 시장에서 사용되고 있다. 불행하게도, 전처리는 분자 시험에 대한 비용을 추가하며, 추가적인 처리 시간 및 장비를 필요로 한다.
휴먼 제네틱 시그네처즈 회사(Human Genetic Signatures Pty Ltd)(호주 시드니에 소재)는 WO 2006/058393호 및 미국특허출원 제7833942호에 개시된 미생물유기체의 검출을 위한 방법을 개발하였다. 해당 방법은 미생물유기체의 미생물 핵산을 작용제(agent)로 처리하여 미생물유기체를 검출하는데 사용될 수 있는 독특한 핵산 서열을 갖는 미생물 핵산으로부터 유래된 핵산의 단순화된 형태를 형성하는 단계를 수반한다.
본 발명자는 현재 분자 검출 분석에서 필요한 바와 같은 샘플 전처리를 필요로 하지 않는 개선된 분자 검출 분석법을 개발하였다.
본 발명은 샘플 정화 단계 또는 세포를 용해시키거나 또는 핵산을 정제하기 위한 생물학적 샘플의 처리 단계를 필요로 하는 일 없이 생물학적 샘플에 대해 수행되는 분자 검출 분석법에 관한 것이다.
제1 양태에서, 본 발명은,
(a) 세포를 파괴하고 핵산을 처리하는 조건 하에 생물학적 샘플을 바이설파이트 작용제로 직접 처리하는 단계;
(b) 처리된 샘플로부터 바이설파이트 작용제를 제거하는 단계; 및
(c) 처리된 샘플 내 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함하는, 분자 검출 분석법을 제공한다.
생물학적 샘플은 단계 (a) 전에 세포 파괴 또는 화학적/물리적 처리를 필요로 한다.
생물학적 샘플은 배설물, 비강, 혈액, 혈장, 혈청, 구강 세포, 고름, 상처, 농축된 여과액, 뇌척수액, 정액, 액상세포 검사(liquid based cytology: LBC), 조직, FFPE, 레이저 포획 세포, 배양된 세포, 펠렛화된 세포, 박테리아 배양물, 박테리아 콜로니, 바이러스 현탁액, 흡입물, 기관지폐포세척액, 가래 샘플, 환경 샘플, 환경 농축물, 식품, 원성분(raw ingredient), 물 샘플 또는 물 농축물 등으로부터 선택될 수 있다.
검출된 핵산은 DNA, RNA 또는 DNA와 RNA 둘 다의 조합물일 수 있다.
분석은 동물에서 감염성 질병, 유전적 질병 또는 유전적 특성을 검출하는데 적합하다. 바람직하게는, 동물은 인간이다.
감염성 질병은 박테리아, 바이러스, 바이로이드, 효모, 진균, 프리온, 기생충 또는 아메바를 포함하는 미생물유기체에 의해 야기될 수 있다.
유전적 질병은 암, 돌연변이, 복제수 변화, 유전 장애, 환경 유발 질병, 발암물질에 노출에 의해 야기된 질병, 게놈 내 뉴클레오타이드 반복체의 확장 또는 감소를 특징으로 하는 질병일 수 있다.
유전적 특성은 암 및 유전적 및 후성적 변화가 질병 상태의 진행에 기여하는 임의의 다른 질병에 대한 감수성(susceptibility)일 수 있다.
바람직하게는, 바이설파이트 작용제는 바이설파이트나트륨 또는 메타바이설파이트나트륨이다. 바이설파이트 작용제는 바람직하게는 약 4.5 내지 약 5.5의 pH 범위를 지니며 약 2.5M 내지 약 3.5M 의 농도에서 사용된다. 더 바람직하게는, 바이설파이트 작용제는 약 5.0의 pH로 약 3M의 농도에서 사용된다.
바람직하게는, 단계 (a)는 약 75℃ 내지 95℃에서 약 1분 내지 30분 동안 가열하는 단계를 수반한다. 더 바람직하게는, 샘플은 약 80℃ 내지 95℃의 온도에서 약 10분 내지 20분 동안 가열된다. 온도 및 가열 지속기간은 처리되는 샘플 및 검출되는 핵산의 세포 공급원에 따라서 다를 수 있다는 것이 인식될 것이다.
바이설파이트는 임의의 적합한 수단에 의해 처리된 샘플로부터 제거될 수 있다. 예는 칼럼 기반 정제를 포함하거나 또는 비드 기반 정제가 최적이지만, 일부 경우에 단순한 침전 단계로 충분할 수 있다.
바이설파이트의 제거 후, 샘플은 적어도 pH 10, 더 바람직하게는 약 pH 11.5 내지 약 12.5를 갖는 용리 완충제 중에서 바람직하게 재현탁된다. 적어도 약 12의 pH가 대부분의 샘플에 대해 적합한 것으로 발견되었다.
바이설파이트 작용제는 처리된 핵산에서 사이토신을 유라실로 바꾼다. 이중 가닥 DNA에서, 바이설파이트 작용제는 비상보적 핵산 분자를 제외한 2개의 유도체를 형성하는 상보적 이중 가닥 게놈 DNA의 각 가닥에서 사이토신을 유라실로 바꾼다.
일 바람직한 형태에서, 유도체 미생물 핵산은 염기 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T) 및 유라실(U)을 실질적으로 함유하며, 대응되는 미처리 핵산으로서 동일한 전체 수의 염기를 실질적으로 가진다.
처리된 핵산이 증폭된다면, 증폭된 핵산은 실질적으로 염기 아데닌(A), 구아닌(G) 및 티민(T)을 함유한다. 증폭은 중합효소 연쇄반응(PCR), 등온 증폭법 또는 신호증폭법과 같은 어떤 적합한 수단에 의해 수행될 수 있다.
바람직한 형태에서, 분석은 처리된 샘플에 핵산 프라이머 또는 프로브를 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
바람직하게는, 처리된 샘플은 증폭 반응을 받아서 미생물유기체 또는 유전적 지표에 특이적인 표적 핵산 분자를 형성한다.
표적 핵산 분자는 바람직하게는 증폭에 의해 검출된다. 적합한 증폭 검출의 예는 PCR, qPCR, 역전사효소 PCR, 디지털 PCR, 등온 증폭법 또는 신호 증폭법을 포함한다.
처리된 핵산은 또한 로슈(Roche) 454, ABI SOLiD 또는 이온 토렌트 시스템즈(Ion torrent systems), 일루미나(Illumina) Hi Seq SBS 기법, 헬리코스 헬리스코프(Helicos Heliscope) 또는 퍼시픽 바이오사이언스에 의해 사용된 SMRT 기법 또는 임의의 다른 동등한 기법과 같은 시퀀싱 기법에 의해 검출될 수 있다.
바람직한 형태에서, 표적 핵산 분자는,
미생물-특이적 핵산 분자의 표적 영역에 결합될 수 있는 디텍터(detector) 리간드를 제공하고, 디텍터 리간드가 표적 영역에 충분한 시간 동안 결합되게 하는 단계; 및
표적 영역에 대한 디텍터 리간드의 결합을 측정하여 미생물-특이적 핵산 분자의 존재를 검출하는 단계에 의해 검출된다.
다른 바람직한 형태에서, 표적 핵산 분자는 증폭 산물을 분리시키는 단계 및 분리된 산물을 시각화하는 단계에 의해 검출된다. 바람직하게는, 증폭 산물은 전기영동에 의해 분리되고, 겔에 대해 하나 이상의 밴드를 시각화함으로써 검출된다.
바람직하게는, 표적 핵산 분자는 세포 내에서 자연적으로 생기지 않는다.
제2 양태에서, 본 발명은 샘플의 직접적 처리를 위한 분자 검출 분석용 키트를 제공하되, 해당 키트는,
바이설파이트 시약;
핵산 용리 및 반응 시약;
표적 핵산에 대한 PCR 프라이머; 및
분석을 수행하기 위한 설명서를 포함한다.
키트는 핵산 분리 또는 정제 칼럼, PCR 마스터믹스, PCR용 시약, 대조군 핵산 프라이머, 반응관, 시험관, 면봉 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서 전체적으로, 문맥에서 달리 요구되지 않는다면, 단어 "포함하다" 또는 변형어, 예컨대 "포함하다" 또는 "포함하는"은 언급된 구성요소, 정수 또는 단계 또는 구성요소, 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 의미하는 것으로 이해될 것이지만, 임의의 다른 구성요소, 정수 또는 단계, 또는 구성요소, 정수 또는 단계의 그룹을 제외하는 것은 아니다.
본 명세서에 포함된 문헌, 행동, 재료, 장치, 논문 등의 어떤 논의는 단지 본 발명에 대한 내용을 제공하는 목적을 위한 것이다. 임의의 또는 모든 이들 물질은 선행기술 기반의 요소를 형성하거나 또는 본 발명의 개발 전 호주에서 존재하는 것과 같은 본 발명에 대해 적절한 분야에서 흔한 일반적인 지식이라는 용인으로서 취해져서는 안 된다.
본 발명이 더 명확하게 이해될 수 있도록, 바람직한 실시형태가 다음의 도면 및 실시예를 참고로 하여 기재될 것이다.
도 1은 본 발명을 사용하는 클로스트리디움 디피실(C. difficile) 검출 결과를 도시한 도면. A. Fam 채널은 클로스트리디움 디피실의 tcdA/B 유전자에 특이적이고; B. Cy5 채널은 추출 대조군에 대해 특이적이다.
도 2는 동일 샘플로부터의 3가지 바이러스의 증폭 결과를 도시한 도면. A. Fam=노로바이러스(Norovirus)(단일가닥 RNA 바이러스); B. Hex=아데노바이러스(아데노바이러스)(이중 가닥 DNA 바이러스; C. Cy5=로타바이러스(Rotavirus)(단일가닥 RNA 바이러스.
도 3은 배설물질 내로 인간 세포의 스파이킹 효과를 도시한 도면. A는 95℃에서 3M 바이설파이트 시약 중에서 15분 동안 가열된 다음 높은 pH 완충제(12.3) 중에서 재현탁되고, 인간 β-글로빈 유전자에 대해 증폭된, 인간 MRC5 세포를 나타낸다. B는 95℃에서 3M 바이설파이트 시약 중에서 15분 동안 가열된 다음 높은 pH 완충제(12.3) 중에서 재현탁되고, 인간 β-글로빈 유전자에 대해 증폭된, 배설물질 내로 스파이킹된 동일 세포를 나타낸다.
이점
본 발명은 다음을 포함하는 선행기술 방법 이상의 다수의 이점을 가진다.
a. 샘플의 세포 용해 및 핵산 전환은 동일한 관 내에서 동시에 일어나며, 완전한 용해 및 전환은 30분 미만에 달성될 수 있으며, 심지어 10분 내지 20분만큼 빨리 달성될 수 있다.
b. 배설물질과 같은 샘플은 민감도의 손실 없이 직접 처리될 수 있다.
c. 본 발명에 기반한 시험은 프로테이나제 K와 같은 효소로 전처리 없이 1차 환자 샘플에 대해 수행될 수 있는 이점을 가진다.
d. 해당 방법은 현재 시장에서 상업적 정제 키트와 같은 어떤 값비싼 정제 방법을 필요로 하지 않는다. 이들 상업적 키트는 몇 가지만 말하자면 혈액, 배설물, 배양된 세포, FFPE, 박테리아, 바이러스 및 기생충과 같은 거의 모든 샘플 유형에 대해 이용가능하다. 이들 상업적 키트는 수천 달러의 비용이 들며, 샘플을 정제하는데 2 내지 4시간이 걸릴 수 있다. 전세계의 거의 모든 실험실은 현재 사용되는 분자 분석에서 어떤 후속 증폭 단계 전에 샘플 정제를 위해 이들 키트를 사용한다.
e. 바이설파이트의 제거 후, 그 다음에 샘플은 가열 탈설폰화와 같은 어떤 추가 처리를 필요로 하지 않는 간단한 용리로 재현탁되고, 따라서 처리는 단순화된다.
f. 해당 방법은 특별화된 바이러스 정제 키트를 사용할 어떤 필요 없이 동일한 샘플로부터 동일한 관 내 RNA와 DNA 바이러스를 둘 다 동시에 검출할 수 있다. RNA와 DNA 바이러스(하나는 단일가닥이고, 하나는 이중 가닥이지만)는 둘 다 용해되고, 본 발명에 의해 동일한 효율로 전환된다.
g. 놀랍게도, 높은 pH의 용리 완충제는 RNA를 분해하지 않는다. 이 발견은 선행 기술 교시가 높은 온도와 pH에서 RNA의 처리에 대해 분명히 알리고 있기 때문에, 선행기술에서 교시된 것에 대해 불리하다.
h. 해당 방법은 유사한 조건을 사용하여 모든 박테리아 유형을 용해하고, 전환할 수 있으며, 따라서 단일 환자 샘플이 클로스트리디움 디피실, 살모넬라(Salmonella), 캄필로박터(Camplylobacter) 및 기생충 등에 대한 다수의 시험에 대해 사용될 수 있고, 따라서 각각의 박테리아 또는 표적 미생물유기체에 대한 별개의 추출방법의 문제를 제거할 수 있다.
i. 해당 방법은 통상적인 용해 기법에 저항할 수 있도록 거친 외부 껍질을 형성할 수 있는 기생충과 같은 샘플을 용해하는데 어려움이 있을 수 있다. 따라서 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis: TB)(통상적인 용해 기법에 대해 매우 저항성)와 같은 표적 유기체가 검출에 이상적인데, 민감한 핵산 기반 진단 시험이 필요하기 때문이다.
j. 해당 방법은 중요한 RNA 바이러스를 매우 낮은 수준으로 검출하는 이용성을 보여주는 바이러스의 10개만큼 적은 복제물을 사용하여 혈청으로부터 직접 C형 간염 바이러스(HCV)를 효율적으로 용해하고 전환할 수 있다.
k. 해당 방법은 또한 많은 시간에 의해 샘플 처리 시간을 감소시키고, 샘플이 정제된 다음 바이설파이트가 전환되고, 다시 현재 수행되는 바와 같이 정제되는 문제를 제거한다.
l. 해당 방법은 환자 배설물질에서 직장결장암의 민감한 검출에 적합하다. 이러한 샘플은 비침습적이며, 검출의 1차 수준으로서 내시경에 대한 의존을 감소시킨다. 추가로, '결과에 대한 샘플'은 복잡한 샘플 처리 절차 없이 3시간 미만으로 예상된다. 진단을 위해 혈청 샘플로 배설물질의 사용은 다수의 이점을 가지는데, 가장 중요한 것은 민감도가 항상 주된 문제인 혈청 샘플과 달리, 매우 다수의 인간 세포가 샘플 내에 존재할 가능성이 있다는 것이다.
샘플
본 발명은 배설물, 비강, 혈액, 혈장, 혈청, 구강 세포, 고름, 상처, 농축된 여과액, 뇌척수액, 정액, 액상세포 검사(LBC), 조직, FFPE, 레이저 포획 세포, 배양된 세포, 펠렛화된 세포, 박테리아 배양물, 박테리아 콜로니, 바이러스 현탁액, 흡입물, 기관지폐포세척액, 가래 샘플, 환경 샘플, 환경 농축물, 식품, 원성분, 물 샘플 또는 물 농축물 등을 포함하는 샘플의 처리에 적합하다.
샘플 처리( HGS )
본 발명에 다른 샘플의 바람직한 처리방법은 다음과 같다. 샘플은 200㎕의 3M(2.5 내지 3.5M 범위) 바이설파이트나트륨 pH 5.0(pH 4.5 내지 5.5 범위)에 직접 위치시키며, 75℃ 내지 95℃에서 10분 내지 20분 동안 가열된다.
임의의 적합한 수단에 의해 처리된 샘플로부터 바이설파이트가 제거된다. 예는 칼럼 기반 정제를 포함하거나 또는 비드 기반 정제가 최적이지만, 일부 경우에 단순한 침전 단계로 충분할 수 있다.
바이설파이트의 제거 후, 샘플은 pH 11.5 내지 약 12.5(>pH 12가 바람직함)를 갖는 용리 완충제 중에서 바람직하게 재현탁된다.
샘플은 이제 추가 처리 없이 PCR 증폭을 위한 준비가 된다.
바이설파이트의 제거
바이설파이트 제거는 메틸이지(MethylEasy)(상표명) 기법(휴먼 제네틱 시그네처)과 같은 상업적으로 입수가능한 방법에 의해 달성되도록 사용될 수 있다. 간략하게는, 240㎕의 시약 #3은 샘플에 첨가되고, 샘플은 원심분리 칼럼에 전달된다. 그 다음에 칼럼은 10,000xg에서 교반되어 바이설파이트를 제거한다. 그 다음에 칼럼은 세척 간에 10,000xg에서 300㎕의 시약 #4 교반에 의해 2회 세척된다. 20 내지 50㎕의 용리 완충제가 첨가되고, 샘플을 깨끗한 수집관으로 교반시킨다. 샘플은 이제 PCR 증폭을 위한 준비가 된다.
샘플 전처리
현재 샘플 전처리는 퀴아젠 인코포레이티드(Qiagen Inc)(미국 캘리포니아주 91355 발렌시아에 소재), 시그마 라이프 사이언스(Sigma Life Sciences)(미국 미조리주 세인트루이스에 소재), 인비트로젠(미국 캘리포니아주 92008 칼스베드에 소재) 및 프로메가 코포레이션(Promega Corporation)(미국 위스콘신주 매디슨 53711에 소재)에 의해 시판되는 상업적 키트를 수반한다.
본 발명을 다음의 방법과 비교하였다.
병원 “내부( in - house )” 시험
대변 샘플을 95℃에서 10분 동안 가열한 다음, 희석시켰고, 그 다음에 샘플을 클로스트리디움 디피실의 tcdB 유전자에 대해 증폭시켰다.
퀴아젠 정제
QIAamp DNA 대변 미니 키트(50) 카탈로그 # 51504.
상업적 기생충 시험
오스다이아그노스틱스(AusDiagnostics) 위장 기생충 5, 카탈로그 번호: 6502.
결과
대변 샘플
표 1, 표 2, 표 3 및 표 4 에서 시험한 모든 대변 샘플을 다음과 같이 처리하였다:
면봉을 배변물질에 넣은 다음, 200㎕의 3M 바이설파이트나트륨 pH 5.0을 함유하는 관에 옮기고, 혼합한 다음, 95℃에서 15분 동안 가열하였다.
바이설파이트를 메틸이지(MethylEasy)(상표명) 방법을 사용하여 제거하였고, 샘플을 20 내지 50㎕ 용리 완충제 중에서 재현탁시킨 다음, 표준 조건을 사용하여 증폭시켰다.
표 1은 병원 "내부" 시험의 결과를 나타내며, 퀴아젠 정제를 사용하여 동일한 샘플을 시험하였고, 동일한 샘플을 본 발명에 따른 방법을 사용하여 시험하였다. 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 병원 "내부" 시험은 7의 위음성 결과 및 1의 위양성 결과(EIA 및 배양물뿐만 아니라 상업적으로 입수가능한 분자 진단 키트에 의해 확인)를 초래하였는데, 이는 해당 방법이 1차 환자 샘플에서 클로스트리디움 디피실의 검출을 위한 필요한 민감도를 갖지 않는다는 것을 나타낸다. 퀴아젠 방법을 사용할 때, 4개의 샘플은 처리를 위한 충분한 재료를 갖지 않은 한편, 1개의 샘플은 위음성 결과(EIA에 의해 GDH 양성)를 제공하였다. 이들 결과는 클로스트리디움 디피실의 빠른 진단을 위한 본 발명에 따른 방법(HGS 방법)의 이용성을 증명한다. 추가로, 제한된 용적을 갖는 샘플은 HGS 방법을 사용하여 용이하게 분석된다. 추가로, 퀴아젠 방법은 적어도 2시간의 샘플 준비 시간을 필요로 하며, 사전결정된 배변물질의 양을 칭량하여야 한다.
Figure 112014029054661-pct00001
Figure 112014029054661-pct00002
Figure 112014029054661-pct00003
Figure 112014029054661-pct00004
표 2는 표준 현미경 검사, 상업적 기생충 시험(오스다이아그노스틱스 이지 플렉스 위장 기생충 5) 및 HGS 방법의 직접 비교 결과를 나타낸다. 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 상업적 방법은 지알디아 낭포를 함유하는 다수의 샘플을 용해할 수 없다. 이는 모든 지알디아 샘플 및 또한 통상적인 현미경 검사에 의해 빠뜨린 일부 샘플을 용이하게 검출하는 HGS 방법과 대조적이다. 추가로, HGS 방법은 기생충과 박테리아 둘 다에 함유된 다수의 샘플, 병원에 의해 후속적으로 확인된 결과와 마찬가지로 박테리아 및 기생충의 용해에 대해 보편적인 것으로 여겨진다.
표 3은 미생물 검출을 위한 HGS 방법 대 통상적인 배양 방법의 결과를 나타낸다. 알 수 있는 바와 같이, 배양 방법은 분자 방법이 검출되는 캄필로박터 종을 함유한 하나의 샘플을 검출하지 못했다. 추가로, 클로스트리디움 디피실을 함유한 샘플에 의해 교차 반응성이 검출되지 않았다. 모든 양성 배양물 결과는 HGS 방법과 일치되는데, 이는 통상적인 배양에 비해 분자 방법의 개선된 민감도를 나타낸다. 더 나아가, HGS 방법의 결과는 통상적인 배양 방법에 대해 필요한 밤새 배양시키는 것에 비해 짧게, 3시간에 이용가능하다.
Figure 112014029054661-pct00005
처리 조건
4개의 대변 샘플, 즉, 클로스트리디움 디피실에 대해 양성인 3개 및 클로스트리디움 디피실에 대해 음성인 1개를 추출 효율에 대한 온도 및 시간의 효과를 결정하기 위해 분석하였다. 추출 대조군(16개의 rDNA 유전자)을 또한 포함시켜 대변 샘플 내에 존재하는 혼합된 균무리(flora)에 대한 조건의 효과를 결정하였다. Fam 채널은 클로스트리디움 디피실의 tcdA/B 유전자에 대해 특이적인 반면, Cy5 채널은 추출 대조군에 대해 특이적이다. 결과를 도 1 및 표 4에 나타낸다.
표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 이들 샘플의 용해를 위한 바람직한 온도 및 시간은 15분 동안 85℃ 내지 95℃에 놓여있다. 모든 양성 샘플 및 대변 균무리는 용이하게 검출되었다.
Figure 112014029054661-pct00006
Figure 112014029054661-pct00007
10㎕의 HCV(아크로메트릭스(Acrometrix))를 200㎕의 3M 바이설파이트나트륨에 첨가하였고, 75℃, 75℃, 80℃ 및 90℃에서 5, 10 또는 15분 동안 가열하였다. 바이설파이트를 변형된 메틸이지(MethylEasy)(상표명) 방법을 사용하여 제거하였고, 샘플을 20㎕의 용리 완충제 중에서 재현탁시켰으며, 12㎕ 역전사시킨 다음 표준 조건을 사용하여 2㎕ 증폭시켰다.
표 5의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, HCV RNA는 가장 높은 시험 온도인 90℃에서 용해 전환을 용이하게 견뎌낼 수 있다. 훨씬 더 놀랍게도, 공개된 문헌과 반대로 높은 pH 완충제의 존재에서 RNA 바이러스 검출을 위해 분석작업하였는데, 이는 RNA 종이 대략 중성 pH에서 유지될 필요가 있다는 것을 나타낸다.
이들 결과는 표 4의 결과와 조합되는데, 이는 15분 동안 약 90℃의 온도가 클로스트리디움 디피실 및 단일가닥 RNA 바이러스, 예컨대 HCV와 같은 이중 가닥 DNA 유기체에 대해 보편적인 샘플 처리 방법일 수 있다는 것을 시사한다. 추가로, 클로스트리디움 디피실은 포자-함유 유기체이기 때문에, 결과는 해당 방법이 거친 포자를 파괴할 만큼 충분히 강하지만 RNA 함유 바이러스가 분해되지 않을 만큼 충분히 순하다는 것을 나타낸다. 또한 이러한 데이터는 선행 기술에 의해 예측되지 않았다.
PCR A와 B는 사용된 마스터믹스가 다르다(각각 점프스타트(JumpStart)(시그마(Sigma)) 및 패스트스타트(FastStart)(로슈(Roche))).
혈청
HCV(젭투메트릭스(Zeptoometrix))의 희석물을 준비한 다음 10㎕의 각각의 희석액을 200㎕의 3M 바이설파이트나트륨에 첨가하였고, 75℃에서 10분 동안 가열하였다.
바이설파이트를 메틸이지(MethylEasy)(상표명) 방법을 사용하여 제거하였고, 샘플을 20㎕의 용리 완충제 중에서 재현탁하였으며, 12㎕ 역전사시킨 다음, 표준 조건을 사용하여 2㎕를 증폭시켰다.
Figure 112014029054661-pct00008
표 6으로부터 알 수 있는 바와 같이, 혈청을 처리하기 위해 직접 HGS 방법을 사용할 때, 2IU 만큼 적은 HCV가 효율적으로 용해될 수 있고, 동시에 전환될 수 있다. 이 결과는 처리를 위한 표적으로서 RNA 바이러스를 사용하여 만들어질 수 있는 우수한 민감도를 보여준다.
표 7은 동일한 추출 조건 하에 RNA 바이러스와 DNA 바이러스 둘 다의 동시 용해/전환이다.
도 2는 동일한 샘플로부터의 3가지 바이러스의 증폭을 나타낸다.
A. Fam=노로바이러스(단일가닥 RNA 바이러스).
B. Hex=아데노바이러스(이중 가닥 DNA 바이러스
C. Cy5=로타바이러스(단일가닥 RNA 바이러스)
노로바이러스, 아데노바이러스 및 로타바이러스 정성적 샘플을 젭토메트릭스(Zeptometrix)로부터 얻었다. 각 바이러스의 샘플(10㎕)을 3M 바이설파이트나트륨에 첨가하였고, 샘플을 90℃에서 10, 15 및 20분 동안 가열하였다. 그 다음에 바이설파이트를 변형된 메틸이지(MethylEasy)(상표명) 방법을 사용하여 제거하였고, 샘플을 20㎕의 용리 완충제 중에서 재현탁하였으며, 12㎕ 역전사시킨 다음, 표준 조건을 사용하여 2㎕를 증폭시켰다.
표 7로부터 알 수 있는 바와 같이, 90℃에서 가열하고 15분 후 RNA와 DNA 바이러스는 둘 다 효율적으로 용해되고, 전환된다. 바이러스 유형 둘 다 동일한 조건 하에 정제하였다. 이들 결과는 동일한 샘플로부터 DNA와 RNA 바이러스 둘 다의 용해 및 효율적인 전환을 위한 보편적인 샘플 제조 방법으로서 HGS 방법의 이용성을 추가로 보여준다. 또한 놀랍게도, RNA 바이러스는 90℃ 샘플 처리 및 높은 pH 완충제를 용이하게 견딜 수 있다.
Figure 112014029054661-pct00009
배설물 샘플을 젭토메트릭스(Zeptometrix)로부터 얻은 노로바이러스, 아데노바이러스 및 로타바이러스 정성적 샘플로 스파이킹하였다. 바이러스 샘플(10㎕)을 배설물질 내로 스파이킹하였고, 샘플을 혼합하였다. 면봉을 배설물질 내에 넣은 다음, 200㎕의 3M 바이설파이트나트륨 pH 5.0을 함유하는 관에 옮기고, 그 다음에 90℃에서 15분 동안 가열하였다.
바이설파이트를 변형된 메틸이지(MethylEasy)(상표명) 방법을 사용하여 제거하였고, 샘플을 20㎕의 용리 완충제 중에서 재현탁하였으며, 12㎕ 역전사시킨 다음, 표준 조건을 사용하여 2㎕를 증폭시켰다.
바이러스에 의한 배설 샘플의 스파이킹 효과
노로바이러스 아데노바이러스 로타바이러스 처리
아데노바이러스 스파이크 해당없음 41.1 해당없음 해당없음
노로바이러스 스파이크 39.45 해당없음 해당없음 해당없음
로타바이러스 스파이크 해당없음 해당없음 39.62 해당없음
표 8로부터의 결과는 바이러스 입자가 배설 샘플 내로 스파이킹되고, 보편적인 조건이 적용될 때조차, DNA와 RNA 바이러스는 둘 다 효과적으로 용해되고 전환된다는 것을 나타낸다. 따라서, 해당 방법은 관심 대상의 어떤 미생물유기체에 대한 어떤 샘플에 적용가능하여야 한다.
인간 세포
본 발명이 또한 암과 같은 인간 질병의 검출에 적합한지의 여부를 결정하기 위해, 5㎕, 10㎕ 및 20㎕의 희석된 인간 세포를 10분 또는 15분 동안 70℃, 80℃, 90℃ 및 95℃에서 200㎕의 3M 바이설파이트 중에서 인큐베이션시켰다. 바이설파이트 용액을 제거하기 위해 샘플을 처리하였고, 50㎕의 완충제 pH 12.3 중에서 재현탁시켰다. 그 다음에 물질(2㎕)을 인간 β-글로빈 유전자에 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용하여 증폭시켰다. 결과를 표 9 및 도 3에 나타낸다.
Figure 112014029054661-pct00010
표 9에서 알 수 있는 바와 같이, 전처리 없이 인간 세포의 동시 용해 및 전환을 위한 바람직한 시간 및 온도는 90℃ 내지 95℃에 15분에 놓인다.
도 3은 배설물질 내로 인간 세포의 스파이킹 효과를 나타낸다. 도 3A는 95℃에서 3M 바이설파이트 중에서 15분 동안 가열된 다음, 높은 pH 완충제(12.3) 중에서 재현탁시키고, 인간 β-글로빈 유전자에 대해 증폭된 인간 MRC5 세포를 나타낸다. 도 3B는 95℃에서 3M 바이설파이트 중에서 15분 동안 가열된 다음, 높은 pH 완충제(12.3) 중에서 재현탁시키고, 인간 β-글로빈 유전자에 대해 증폭된, 배설물질 내로 스파이킹된 동일한 세포를 나타낸다. 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 인간 세포는 샘플 전처리 또는 DNA 단리에 대한 어떤 필요 없이 1차 인간 배설물질에서 용해되고, 효율적으로 전환될 수 있다.
결과는 인간 세포의 메틸화 프로파일링이 바이설파이트 전 전처리 또는 샘플 정제에 대한 필요 없이 환자로부터 얻어진 배설 샘플에 직접 수행될 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 해당 방법은 1차 인간 물질로부터 직접 결장직장암의 진단을 위한 비침습적이고, 간단한 방법으로서 이상적이다.
진단 시험 키트
본 발명은 진단 실험실 등에서 사용이 용이하게 하는 진단 키트 형태로 제공될 수 있다. 표 10 및 표 11은, 예를 들어 미생물유기체에 대한 전형적인 시험 키트로 제공되는 시약을 나타낸다. 키트는 사용을 위한 설명서를 포함한다. 해당 물질이 진단 실험실에서 보통 용이하게 이용가능하기 때문에 관, 면봉 및 다른 실험실 장비가 키트로 제공될 필요가 없다는 것을 인식할 것이다.
2개의 박스 중 1(실온에서 저장)
성분 명칭 함량
시약 1(알칼리수) 5 x 5㎖
시약 2(바이설파이트) 5 x 3.5g
시약 3(결합 시약) 5 x 5.8㎖
시약 4(세척 완충제) 5 x 3㎖
시약 5(용리 완충제) 5 x 3㎖
피복된 면봉 100
반응관(1.5㎖) 100
세척관 100
수집관(1.5㎖) 100
정제 칼럼 100
상세하게 설명된 사용자 지침 1
2개의 박스 중 2(수령 시 -20℃에서 저장)
PCR 마스터믹스 5 x 바이알
PCR 성분 5 x 바이알
박스 2는 샘플이 처리될 상이한 위치 내 DNA "세정실"에서 -20℃에서 저장하여야 한다.
특이적 미생물유기체 또는 유전자 시험을 위한 키트는 표적 핵산 분자를 증폭시키는 PCR 프라이머를 포함한다.
광범위하게 기재된 본 발명의 정신 또는 범주로부터 벗어나는 일 없이 구체적 실시형태에 나타낸 바와 같이 수많은 변화 및/또는 변형이 본 발명에 대해 만들어질 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다. 따라서 본 실시형태는 예시적이며, 제한적이지 않은 모든 사항으로 고려되어야 한다.

Claims (20)

  1. 분자 검출 분석법으로서,
    2.5M 내지 3.5M의 농도, pH 4.5 내지 5.5, 그리고 80℃ 내지 95℃의 온도에서 10분 내지 20분 동안 바이설파이트 작용제로 직접 생물학적 샘플을 처리하여 세포를 파괴하고 핵산을 처리하는 단계;
    상기 처리된 샘플로부터 상기 바이설파이트 작용제를 제거하는 단계; 및
    상기 처리된 샘플 내 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함하고,
    상기 분석법은 바이설파이트 작용제로 처리하기 전에 생물학적 샘플의 전처리 없이 실시되는 것인 분자 검출 분석법.
  2. 제1항에 있어서, 생물학적 샘플은 배설물, 비강물, 혈액, 혈장, 혈청, 구강 세포, 고름, 상처, 농축된 여과액, 뇌척수액, 정액, 액상세포 검사(liquid based cytology: LBC), 조직, FFPE, 레이저 포획 세포, 배양된 세포, 펠렛화된 세포, 박테리아 배양물, 박테리아 콜로니, 바이러스 현탁액, 흡입물, 기관지폐포세척액, 가래 샘플, 환경 샘플, 환경 농축물, 식품, 원성분(raw ingredient), 물 샘플 또는 물 농축물로부터 선택되는 것인 분자 검출 분석법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 동물에서 감염성 질병, 유전적 질병 또는 유전적 특성(genetic trait)을 검출하기 위한 것인 분자 검출 분석법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 감염성 질병은 미생물유기체에 의해 야기된 것인 분자 검출 분석법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 미생물유기체는 박테리아, 바이러스, 바이로이드, 효모, 진균, 기생충 또는 아메바인 분자 검출 분석법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 유전적 질병은 암, 복제수 변이와 관련된 질병, 유전성 장애, 환경 유발 질병, 발암물질에의 노출에 의해 야기된 질병, 또는 뉴클레오타이드 반복체 길이의 확장 또는 감소를 특징으로 하는 질병인 분자 검출 분석법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 바이설파이트 작용제는 나트륨 바이설파이트 또는 나트륨 메타바이설파이트인 분자 검출 분석법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 바이설파이트 작용제는 pH 5.0에서 3M 농도로 사용되는 것인 분자 검출 분석법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 처리 단계는 85℃ 내지 95℃의 가열을 포함하는 것인 분자 검출 분석법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 바이설파이트 작용제는 칼럼 기반 정제, 비드 기반 정제 또는 침전에 의해 제거되는 것인 분자 검출 분석법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 바이설파이트 작용제의 제거 후, 상기 처리된 샘플은 pH 10 이상을 갖는 용리 완충제 중에서 재현탁되는 것인 분자 검출 분석법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 용리 완충제는 pH 11.5 내지 12.5를 갖는 것인 분자 검출 분석법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 용리 완충제는 pH 12 이상을 갖는 것인 분자 검출 분석법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 처리된 샘플에 핵산 프라이머 또는 프로브를 제공하는 단계를 더 포함하는 분자 검출 분석법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 표적 핵산은 증폭에 의해 검출되는 것인 분자 검출 분석법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 증폭은 PCR, qPCR, 역전사 PCR, 디지털 PCR, 등온 증폭 또는 신호 증폭인 분자 검출 분석법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 표적 핵산은 상기 처리된 샘플을 시퀀싱함으로써 검출되는 것인 분자 검출 분석법.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160108459A1 (en) * 2014-10-17 2016-04-21 Biochain Institute Inc. Automated isolation and chemical reaction(s) of nucleic acids
ES2815684T3 (es) 2015-06-10 2021-03-30 Biocartis N V Detección mejorada de ADN metilado
RU2612147C1 (ru) * 2015-11-06 2017-03-02 Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы Научно-исследовательский институт неотложной детской хирургии и травматологии Департамента здравоохранения города Москвы Способ оценки готовности раневой поверхности к пластическому закрытию

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009088987A2 (en) 2008-01-03 2009-07-16 The Johns Hopkins University Compositions and methods for polynucleotide extraction and methylation detection

Family Cites Families (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5418149A (en) 1990-07-24 1995-05-23 Hoffmann-La Roche Inc. Reduction of non-specific amplification glycosylase using DUTP and DNA uracil
US5750338A (en) 1986-10-23 1998-05-12 Amoco Corporation Target and background capture methods with amplification for affinity assays
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5124327A (en) 1991-09-06 1992-06-23 Merck & Co., Inc. HIV reverse transcriptase
JPH08503606A (ja) 1992-10-09 1996-04-23 アモコ・コーポレーション 検定法
US5473060A (en) 1993-07-02 1995-12-05 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide clamps having diagnostic applications
US6156501A (en) 1993-10-26 2000-12-05 Affymetrix, Inc. Arrays of modified nucleic acid probes and methods of use
JP3175110B2 (ja) 1994-02-07 2001-06-11 オーキッド・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド リガーゼ／ポリメラーゼ媒体された単一ヌクレオチド多型のジェネティックビットアナリシスおよび遺伝子解析におけるその使用
SE9400522D0 (sv) 1994-02-16 1994-02-16 Ulf Landegren Method and reagent for detecting specific nucleotide sequences
FR2737223B1 (fr) 1995-07-24 1997-09-12 Bio Merieux Procede d'amplification de sequences d'acide nucleique par deplacement, a l'aide d'amorces chimeres
US5994066A (en) 1995-09-11 1999-11-30 Infectio Diagnostic, Inc. Species-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories
DE19612684A1 (de) 1996-03-29 1997-10-02 Gsf Forschungszentrum Umwelt Neue Verwendung extrem thermophiler DNA-Polymerasen
SE9601676D0 (sv) 1996-04-30 1996-04-30 Ulf Landegren Improved probing of specific mucleic acids
JP4468488B2 (ja) 1996-05-29 2010-05-26 コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッド 組み合せたリガーゼ検出およびポリメラーゼ連鎖反応を用いる核酸配列相違の検出
US6017704A (en) 1996-06-03 2000-01-25 The Johns Hopkins University School Of Medicine Method of detection of methylated nucleic acid using agents which modify unmethylated cytosine and distinguishing modified methylated and non-methylated nucleic acids
US5786146A (en) 1996-06-03 1998-07-28 The Johns Hopkins University School Of Medicine Method of detection of methylated nucleic acid using agents which modify unmethylated cytosine and distinguishing modified methylated and non-methylated nucleic acids
DE69720283T2 (de) 1996-12-30 2004-01-29 Univ Johns Hopkins Med Bestimmung der krebsanfälligkeit eines organs oder gewebes durch bestimmung seiner zellprägung
GB9717061D0 (en) 1997-08-13 1997-10-15 Tepnel Medical Ltd Amplification of nucleic acids
EP2341058A3 (en) 1997-09-12 2011-11-23 Exiqon A/S Oligonucleotide Analogues
GB9806253D0 (en) 1998-03-25 1998-05-20 Tepnel Medical Ltd Amplification of nucleic acids
DE19905082C1 (de) 1999-01-29 2000-05-18 Epigenomics Gmbh Verfahren zur Identifikation von Cytosin-Methylierungsmustern in genomischen DNA-Proben
US6410231B1 (en) 1999-02-26 2002-06-25 Incyte Genomics, Inc. SNP detection
US6951722B2 (en) 1999-03-19 2005-10-04 Takara Bio Inc. Method for amplifying nucleic acid sequence
US6331393B1 (en) 1999-05-14 2001-12-18 University Of Southern California Process for high-throughput DNA methylation analysis
US6420106B1 (en) 1999-06-09 2002-07-16 Quantovir Ab Method and kit for early cancer prediction
DE19935749C2 (de) 1999-07-28 2003-06-26 Epigenomics Ag Verfahren zur Chrakterisierung von Nukleinsäurefragmenten
US6692918B2 (en) 1999-09-13 2004-02-17 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences
DE50007314D1 (de) 1999-11-12 2004-09-09 Epigenomics Ag Verfahren zur kontrollierbaren durchführung komplexer pcr-amplifikationen
DE19957827C2 (de) 1999-11-25 2003-06-12 Epigenomics Ag Verwendung eines Oligomer-Arrays mit PNA- und/oder DNA-Oligomeren auf einer Oberfläche
DE19959691A1 (de) 1999-12-06 2001-08-16 Epigenomics Ag Verfahren zur parallelen Detektions des Methylierungszustandes von genomischer DNA
EP1130113A1 (en) 2000-02-15 2001-09-05 Johannes Petrus Schouten Multiplex ligation dependent amplification assay
DE10010281B4 (de) 2000-02-25 2005-03-10 Epigenomics Ag Ligase/Polymerase-Verfahren zur Detektion von Cytosin-Methylierung in DNA Proben
AU2001241939A1 (en) 2000-02-28 2001-09-12 Maxygen, Inc. Single-stranded nucleic acid template-mediated recombination and nucleic acid fragment isolation
US7195870B2 (en) 2000-04-06 2007-03-27 Epigenomics Ag Diagnosis of diseases associated with gene regulation
US6521411B2 (en) 2000-09-28 2003-02-18 Transgenomic, Inc. Method and system for the preparation of cDNA
IE20000887A1 (en) 2000-11-03 2002-12-11 Univ College Cork Nat Univ Ie Method for the amplification and optional characterisation of nucleic acids
AUPR142500A0 (en) 2000-11-13 2000-12-07 Human Genetic Signatures Pty Ltd A peptide nucleic acid-based assay for the detection of specific nucleic acid sequences
DE10061348C2 (de) 2000-12-06 2002-10-24 Epigenomics Ag Verfahren zur Quantifizierung von Cytosin-Methylierungen in komplex amplifizierter genomischer DNA
US20020142397A1 (en) 2000-12-22 2002-10-03 Philippe Collas Methods for altering cell fate
WO2002062993A1 (fr) 2001-02-06 2002-08-15 Takara Bio Inc. Acides nucleiques amplifies et produits immobilises de ces derniers
WO2003048732A2 (en) 2001-02-07 2003-06-12 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
DE10112515B4 (de) 2001-03-09 2004-02-12 Epigenomics Ag Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungsmustern mit hoher Sensitivität
GB0113118D0 (en) 2001-05-31 2001-07-18 Intercytex Ltd Stem Cells
KR20040036900A (ko) 2001-07-15 2004-05-03 켁크 그래주에이트 인스티튜트 닉킹제를 사용한 핵산 단편의 증폭
US7056671B2 (en) 2001-08-20 2006-06-06 Takara Bio Inc. Isothermal chimeric primer nucleic acid amplification methods using blocking oglionucleotide
EP1319718A1 (en) 2001-12-14 2003-06-18 Keygene N.V. High throughput analysis and detection of multiple target sequences
US20060014144A1 (en) 2001-12-18 2006-01-19 Christensen Ulf B Pseudonucleotide comprising an intercalator
WO2003052133A2 (en) 2001-12-18 2003-06-26 Human Genetic Signatures Pty Ltd Oligonucleotide analogues comprising intercalator pseudonucleotides
US7932070B2 (en) 2001-12-21 2011-04-26 Agilent Technologies, Inc. High fidelity DNA polymerase compositions and uses therefor
US6960436B2 (en) 2002-02-06 2005-11-01 Epigenomics Ag Quantitative methylation detection in DNA samples
IE20020544A1 (en) 2002-06-28 2003-12-31 Univ College Cork Nat Univ Ie Method for the characterisation of nucleic acid molecules
DE10236406C1 (de) 2002-08-02 2003-12-24 Epigenomics Ag Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren mit geringer Komplexität
SE0202867D0 (sv) 2002-09-27 2002-09-27 Pyrosequencing Ab New sequencing method
AU2002951899A0 (en) 2002-10-04 2002-10-24 Macquarie University Random drift mutagenesis
AU2003900368A0 (en) 2003-01-24 2003-02-13 Human Genetic Signatures Pty Ltd Assay for nucleic acid molecules
EP1443052A1 (en) 2003-01-29 2004-08-04 Roche Diagnostics GmbH Improved method for bisulfite treatment of nucleic acid
ES2294462T5 (es) 2003-01-29 2015-05-06 Epigenomics Ag Método mejorado para el tratamiento de bisulfito
US20040203004A1 (en) 2003-04-10 2004-10-14 Bernard Hans Ulrich Diagnostic apparatus and method
AU2003901834A0 (en) 2003-04-17 2003-05-01 Clearcoll Pty Ltd Cross-linked polysaccharide compositions
US7288373B2 (en) 2003-05-02 2007-10-30 Human Genetic Signatures Pty Ltd. Treatment of methylated nucleic acid
DE602004028478D1 (de) 2003-06-17 2010-09-16 Human Genetic Signatures Pty Verfahren zur genomamplifikation
DE10331107B3 (de) 2003-07-04 2004-12-02 Epigenomics Ag Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungen in DNA mittels Cytidin-Deaminasen
JP4166725B2 (ja) * 2003-07-31 2008-10-15 独立行政法人科学技術振興機構 メチル化ｄｎａ検出方法
US7368239B2 (en) 2003-08-29 2008-05-06 Applera Corporation Method and materials for polyamine catalyzed bisulfite conversion of cytosine to uracil
EP1668148B1 (en) 2003-09-04 2008-12-31 Human Genetic Signatures PTY Ltd. Nucleic acid detection assay
WO2005030041A2 (en) 2003-09-25 2005-04-07 Third Wave Technologies, Inc. Detection of hpv
CA2544841C (en) 2003-11-03 2014-03-25 Medical Research Council Pola dna polymerases capable of abasic site bypass
CA2547743C (en) 2003-12-02 2011-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved method for bisulfite treatment
JP4249186B2 (ja) 2003-12-10 2009-04-02 タカラバイオ株式会社 核酸の増幅方法
US20050136417A1 (en) 2003-12-19 2005-06-23 Affymetrix, Inc. Amplification of nucleic acids
CA2496997A1 (en) 2004-02-13 2005-08-13 Affymetrix, Inc. Analysis of methylation status using nucleic acid arrays
US20050196392A1 (en) 2004-02-20 2005-09-08 Andersen Mark R. Lesion repair polymerase compositions
EP2290106B1 (en) 2004-03-08 2018-01-03 Rubicon Genomics, Inc. Method for generating and amplifying DNA libraries for sensitive detection and analysis of DNA methylation
US8168777B2 (en) 2004-04-29 2012-05-01 Human Genetic Signatures Pty. Ltd. Bisulphite reagent treatment of nucleic acid
US7745188B2 (en) 2004-05-20 2010-06-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Thermostable Y-family polymerases and chimeras
US7361465B2 (en) 2004-09-07 2008-04-22 Applera Corporation Methods and compositions for tailing and amplifying RNA
EP1794173B1 (en) 2004-09-10 2010-08-04 Human Genetic Signatures PTY Ltd Amplification blocker comprising intercalating nucleic acids (ina) containing intercalating pseudonucleotides (ipn)
NZ555620A (en) 2004-12-03 2008-08-29 Human Genetic Signatures Pty Methods for simplifying microbial nucleic acids by chemical modification of cytosines
AU2005318874B2 (en) 2004-12-23 2007-05-03 Human Genetic Signatures Pty Ltd Detection of human papilloma virus
EA013634B1 (ru) 2005-04-15 2010-06-30 Эпиджиномикс Аг Способы и нуклеиновые кислоты для анализов клеточных пролиферативных нарушений
EP1883707B1 (en) 2005-05-26 2014-04-09 Human Genetic Signatures PTY Ltd Isothermal strand displacement amplification using primers containing a non-regular base
US20070020639A1 (en) 2005-07-20 2007-01-25 Affymetrix, Inc. Isothermal locus specific amplification
JP5164845B2 (ja) 2005-09-14 2013-03-21 ヒューマン ジェネティック シグネチャーズ ピーティーワイ リミテッド 健康状態のアッセイ
WO2007068437A1 (en) 2005-12-14 2007-06-21 Roche Diagnostics Gmbh New method for bisulfite treatment
ES2546848T3 (es) 2006-03-10 2015-09-29 Epigenomics Ag Un método para identificar una muestra biológica para el análisis de la metilación
WO2007106802A2 (en) 2006-03-14 2007-09-20 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Method for linear amplification of bisulfite converted dna
US20080050738A1 (en) 2006-05-31 2008-02-28 Human Genetic Signatures Pty Ltd. Detection of target nucleic acid
JP2009538603A (ja) * 2006-06-02 2009-11-12 ヒューマン ジェネティック シグネチャーズ ピーティーワイ リミテッド 微生物の検出および分析に使用するための微生物改変核酸
JP5009289B2 (ja) 2006-06-16 2012-08-22 国立大学法人 岡山大学 Ｍａｌｔリンパ腫の検査方法及びキット
WO2008109945A1 (en) 2007-03-12 2008-09-18 Human Genetic Signatures Pty Ltd Analysis of ribonucleic acid
AU2008229628A1 (en) 2007-03-16 2008-09-25 Human Genetic Signatures Pty Ltd Assay for gene expression
WO2008135512A2 (en) 2007-05-02 2008-11-13 Jerzy Paszkowski Dna amplification method
US20100273156A1 (en) 2007-05-31 2010-10-28 Becton, Dickinson And Company Sequences and methods for detecting influenza a and influenza b virus
JP5431351B2 (ja) 2007-11-27 2014-03-05 ヒューマン ジェネティック シグネチャーズ ピーティーワイ リミテッド バイサルファイト修飾された核酸を増幅およびコピーするための酵素
AU2008331435B2 (en) 2007-12-05 2013-01-10 Human Genetic Signatures Pty Ltd Bisulphite treatment of RNA
EP2222850A4 (en) * 2007-12-20 2011-12-07 Human Genetic Signatures Pty DISPOSAL OF CONTAMINANTS RELATED TO NUCLEIC ACID AMPLIFICATION
JP5522348B2 (ja) * 2008-03-19 2014-06-18 国立大学法人 岡山大学 成人ｔ細胞白血病・リンパ腫の予後推定法およびキット
JP2012515528A (ja) 2009-01-21 2012-07-12 ヒューマン ジェネティック シグネチャーズ ピーティーワイ リミテッド 改良された等温鎖置換増幅
US9365892B2 (en) 2009-10-16 2016-06-14 National University Of Singapore Screening method for trinucleotide repeat sequences

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009088987A2 (en) 2008-01-03 2009-07-16 The Johns Hopkins University Compositions and methods for polynucleotide extraction and methylation detection

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Applied Biosystems, 'Cells-to-CpG™ Bisulfite Conversion Kit (50) Protocol', Part Number 4448998 Rev. C (2010)
Liu, C. et al., 'Direct Bisulfite Conversion from Archived Tumor Samples for Methylation Detection', 101 th AACR PB# 182 (2010)
Liu, C. et al., 'Direct Bisulfite Conversion from Biological Samples for High Resolution Methylation Detection', 2009 Science and Technology Symposium, P209 (2009)

Also Published As

Publication number Publication date
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