ES2815684T3

ES2815684T3 - Detección mejorada de ADN metilado

Info

Publication number: ES2815684T3
Application number: ES16732250T
Authority: ES
Inventors: David Nauwelaers; Hannah Kenens
Original assignee: Biocartis NV
Current assignee: Biocartis NV
Priority date: 2015-06-10
Filing date: 2016-06-10
Publication date: 2021-03-30
Anticipated expiration: 2036-06-10
Also published as: CN107667179A; EP3307438A1; CA2981940A1; EP3307438B1; US20200199653A1; JP2018524976A; US10533210B2; EP3782731A1; JP6681414B2; US20180201973A1; CN107667179B; WO2016198582A1; US11634749B2

Abstract

Un método para la detección de un estado de metilación de ácido nucleico en un sistema automatizado que comprende una cámara de extracción que comprende una membrana de extracción, comprendiendo dicho método las etapas de: - introducir una fuente del ácido nucleico en el sistema automatizado, añadir bisulfito al mismo e inmediatamente seguido de calentar la fuente del ácido nucleico para producir un lisado que comprenda el ácido nucleico y desaminar una base de citosina no metilada presente en dicho ácido nucleico; - añadir tampón de unión al lisado para producir una solución de lisado y tampón de unión; - unir el ácido nucleico a la membrana de extracción y eliminar el bisulfito transportando la solución de lisado y tampón de unión sobre la membrana de extracción; - añadir tampón de desulfonación a la cámara de extracción y transportar el tampón de desulfonación sobre la membrana de extracción para desulfonar la base desaminada en una etapa previa en el ácido nucleico y convertir dicha base en una base de uracilo, - eluir el ácido nucleico convertido de la membrana de extracción; y analizar el ácido nucleico convertido.

Description

DESCRIPCIÓN

Detección mejorada de ADN metilado

Campo de la invención

La presente solicitud se refiere a métodos de detección de citosinas metiladas en ácidos nucleicos en un sistema automatizado, y a los usos de dicho sistema y cartuchos para dicho sistema en la detección y análisis de ácidos nucleicos metilados.

Introducción

La metilación del ADN es uno de los mecanismos que se utilizan para el control epigenético de la expresión génica. Las alteraciones en el estado de metilación del ADN genómico pueden dar como resultado el silenciamiento de los genes. Tal control es importante para una amplia gama de procesos biológicos, incluida la proliferación celular, p. ej. mediante el silenciamiento transcripcional de reguladores de crecimiento críticos como los genes supresores de tumores. Cada vez se reconoce más la importancia biológica de la metilación del ADN en la regulación de la expresión génica y su papel en el cáncer.

La metilación del ADN ocurre mediante la adición covalente de un grupo metilo en el carbono 5' del anillo de citosina, convirtiendo la citosina en el ADN genómico en 5-metilcitosina. En el ADN de los mamíferos, la 5-metilcitosina se encuentra en aproximadamente el 4% del ADN genómico, principalmente en cadenas de secuencia enriquecidas en dinucleótidos de citosina-guanosina (CpG), las llamadas "islas CpG". La hipermetilación de algunas islas CpG en el ADN genómico podría resultar en el silenciamiento de genes y la hipometilación puede conducir a la transcripción y expresión de genes.

Ha habido un gran interés en desarrollar técnicas moleculares para analizar la metilación del ADN genómico en las islas CpG. El descubrimiento de que el tratamiento del ADN con bisulfito de sodio convierte la citosina en uracilo mientras mantiene intacta la 5-metitosina ha abierto la puerta a una serie de estrategias para investigar la metilación del ADN genómico tanto a nivel regional como global (Frommer et al.). Normalmente, el proceso implica los pasos básicos de:

1) purificación de ADN de una muestra,

2) desnaturalización del ADN (paso de calentamiento del ADN a 98°C durante al menos 10 min),

3) desaminación con sulfonación mediante la incubación del ADN con bisulfito (reactivo de conversión) a una temperatura elevada (1 hora o más a 54°C como mínimo) para producir ADN convertido,

4) eliminación del bisulfito por purificación, generalmente en una columna con un medio de unión al ADN (una resina o una membrana),

5) desulfonación, es decir, adición de tampón de desulfonación, seguida de incubación durante 20 min a temperatura ambiente, y eliminación del tampón de desulfonación por centrifugación,

6) una o más etapas de lavado,

7) elución del ADN, normalmente mediante la adición de un tampón de elución y una etapa de centrifugación (en una columna).

La detección de metilación del ADN se aplica actualmente de forma destacada en los métodos de diagnóstico de enfermedades. En particular, dichos métodos se pueden aplicar en el diagnóstico del cáncer.

Para preparar de manera eficaz y eficiente el ADN convertido para su uso en varios análisis posteriores, un método de modificación de bisulfito de ADN ideal debe ser: (1) muy preciso para permitir la conversión completa de citosina en uracilo sin desaminar la metilcitosina en timina; (2) lo suficientemente conservador para minimizar la degradación del ADN y (3) lo más rápido posible para permitir que el proceso del bisulfito sea lo más breve posible. Desafortunadamente, la mayoría de los métodos actuales de conversión de ADN muestran grandes variaciones debido al control insuficiente de la manipulación manual y al tiempo de incubación del bisulfito, que es una consideración clave para la conversión exitosa del bisulfito.

Una limitación adicional de muchos kits disponibles comercialmente actuales es que normalmente incluyen un paso de eliminación de bisulfito después de la conversión y antes de que pueda tener lugar un análisis posterior de la muestra. Esto inevitablemente introduce pasos de manipulación manual adicionales, como la adición de varios tampones, incluidos tampones de lavado y tampones de elución, realizar pasos de centrifugación adicionales, pasar la muestra por columnas de centrifugación de baja elución, etc. Además, dado que muchos de los kits disponibles actualmente requieren la preparación de la muestra del paciente de antemano, p. ej. la purificación del ADN y/o la desnaturalización del ADN en un paso de calentamiento, los métodos de modificación del bisulfito del ADN existentes implican una gran cantidad de operaciones manuales, lo que los hace difíciles de automatizar y que también requieran mucho tiempo. El documento WO2011/036609 describe un análisis de metilación del ADN en un dispositivo sensor continuo y el documento WO2007/068437 muestra un método para el tratamiento con bisulfito que implica la unión del ácido nucleico a una fase sólida.

Los factores descritos limitan la conversión óptima del bisulfito de ADN y, además, lo convierten en un proceso lento que debe realizar personal analítico capacitado. En consecuencia, parece existir la necesidad de un sistema de detección de ADN metilado que proporcione una solución a los problemas planteados.

Sumario de la invención

El alcance de la invención está definido por las reivindicaciones adjuntas y se basa en el descubrimiento de la detección de metilación sensible y específica mediante a) el control de la degradación excesiva del ADN antes de la conversión mediante la incubación del reactivo de conversión del ADN (por ejemplo, el reactivo bisulfito) directamente con una muestra que contiene ácido nucleico sin necesidad de purificación de ácido nucleico de la muestra y sin requerir desnaturalización previa de ácido nucleico a temperaturas elevadas de 98°C y, b) la optimización de la eliminación de bisulfito controlando el caudal de bombeo de la muestra tratada con bisulfito sobre una membrana de extracción dentro de un sistema automatizado.

En consecuencia, la descripción proporciona en un primer aspecto un método para la detección de un estado de metilación de ácido nucleico en un sistema automatizado que comprende una cámara de extracción que comprende una membrana de extracción, comprendiendo dicho método las etapas de:

- introducir una fuente de ácido nucleico en el sistema automatizado, añadir bisulfito al ácido nucleico y seguido de calentar inmediatamente de la fuente del ácido nucleico para producir un lisado que comprende el ácido nucleico y para desaminar una base de citosina no metilada presente en dicho ácido nucleico;

- añadir tampón de unión al lisado para producir una solución de lisado y tampón de unión;

- unir el ácido nucleico a la membrana de extracción y eliminar el bisulfito transportando la solución de lisado y tampón de unión sobre la membrana de extracción;

- añadir tampón de desulfonación a la cámara de extracción y transportar el tampón de desulfonación sobre la membrana de extracción para desulfonar la base desaminada en un paso previo en el ácido nucleico y convertir dicha base en una base de uracilo,

- eluir el ácido nucleico convertido de la membrana de extracción; y

- analizar el ácido nucleico convertido.

En un aspecto más específico, se proporciona un método para la detección de un estado de metilación de ácido nucleico en un sistema automatizado que comprende una cámara de extracción que comprende una membrana de extracción, comprendiendo dicho método los pasos de:

- introducir una fuente de ácido nucleico en el sistema automatizado, añadir bisulfito al ácido nucleico e inmediatamente calentar la fuente del ácido nucleico a una temperatura entre 40°C y 80°C para producir un lisado que comprende el ácido nucleico y para desaminar una base de citosina no metilada presente en dicho ácido nucleico;

- unir el ácido nucleico a la membrana de extracción y eliminar el bisulfito mediante bombeo controlado de la solución de lisado y tampón de unión sobre la membrana de extracción;

- añadir tampón de desulfonación a la cámara de extracción y bombeo controlado del tampón de desulfonación sobre la membrana de extracción para desulfonar la base desaminada en un paso previo en el ácido nucleico y convertir dicha base en una base de uracilo,

- eluir el ácido nucleico convertido de la membrana de extracción; y

- analizar el ácido nucleico convertido en el sistema automatizado.

- introducir una fuente de ácido nucleico en el sistema automatizado, añadir bisulfito al ácido nucleico y seguido inmediatamente por el calentamiento de la fuente del ácido nucleico a una temperatura entre 40°C y 60°C para producir un lisado que comprende el ácido nucleico y para desaminar una base de citosina no metilada presente en dicho ácido nucleico;

- unir el ácido nucleico a la membrana de extracción y eliminar el bisulfito bombeando la solución de lisado y tampón de unión sobre la membrana de extracción con un caudal menor o igual a 0,1 ml/s;

- agregar tampón de desulfonación a la cámara de extracción y bombear el tampón de desulfonación sobre la membrana de extracción con un caudal menor o igual a 0,1 ml/s para desulfonar la base desaminada en el primer paso en el ácido nucleico y convertir dicha base en una base de uracilo;

- eluir el ácido nucleico convertido de la membrana de extracción; y

- analizar el ácido nucleico convertido en el sistema automatizado.

Los métodos de la descripción se pueden aplicar en un cartucho, que a su vez se puede cargar en un sistema automatizado. Por tanto, en un aspecto adicional, se proporciona el uso de un cartucho para la detección de un estado de metilación de ácido nucleico, comprendiendo el cartucho:

- una cámara de lisis susceptible de alojar a una fuente del ácido nucleico, añadir una solución de bisulfito a la fuente del ácido nucleico e inmediatamente seguido calentar la fuente del ácido nucleico a una temperatura entre 40°C y 802C para producir un lisado que comprende el ácido nucleico y para desaminar una base de citosina no metilada presente en dicho ácido nucleico, y agregar tampón de unión al lisado convertido para formar una solución de lisado y tampón de unión,

- una cámara de extracción que comprende una membrana de extracción susceptible de alojar a la solución de lisado y tampón de unión, lo que permite la posterior eliminación del bisulfito mediante el bombeo controlado de la solución de lisado y tampón de unión sobre la membrana de extracción, lo que permite la adición posterior de tampón de desulfonación a la cámara de extracción y bombeo controlado del tampón de desulfonación sobre la membrana de extracción para realizar la desulfonación alcalina de la base desaminada en el primer paso en el ácido nucleico y convertir dicha base en una base de uracilo, y permitir la posterior elución del ácido nucleico convertido de la membrana de extracción,

donde hay un canal entre la cámara de lisis y la cámara de extracción para transportar fluidos desde la cámara de lisis a la cámara de extracción, y

- una cámara de PCR que permite el análisis aguas abajo del ácido nucleico convertido, donde hay un canal entre la cámara de extracción y la cámara de PCR para el transporte del ácido nucleico convertido de la cámara de extracción a la cámara de PCR.

En un aspecto más específico, se prevé el uso de un cartucho para la detección de un estado de metilación de ácido nucleico, comprendiendo el cartucho:

- una cámara de lisis susceptible de alojar a una fuente del ácido nucleico, añadiendo solución de bisulfito a la fuente del ácido nucleico y seguido inmediatamente por el calentamiento de la fuente del ácido nucleico a una temperatura entre 40°C y 60°C para producir un lisado que comprende el ácido nucleico y para desaminar una base de citosina no metilada presente en dicho ácido nucleico, y agregar tampón de unión al lisado convertido para formar una solución de lisado y tampón de unión,

- una cámara de extracción que comprende una membrana de extracción susceptible de alojar a la solución de lisado y tampón de unión, lo que permite la posterior eliminación del bisulfito bombeando la solución de lisado y tampón de unión sobre la membrana de extracción con un caudal más lento o igual a 0,1 ml/s, permitiendo la posterior adición de tampón de desulfonación a la cámara de extracción y bombeando el tampón de desulfonación sobre la membrana de extracción con un caudal menor o igual a 0,1 ml/s para realizar la desulfonación alcalina de la base desaminada en el primer paso del ácido nucleico y convertir dicha base en una base de uracilo, y permitir la posterior elución del ácido nucleico convertido de la membrana de extracción,

En un aspecto siguiente de la descripción se proporciona el uso de un sistema automatizado para la detección de un estado de metilación de ácido nucleico en una fuente de ácido nucleico, el sistema automático adaptado para alojar a un cartucho de acuerdo con la invención, el sistema que controla los pasos de:

- agregar bisulfito a una fuente de un ácido nucleico introducido en el sistema y seguido inmediatamente por calentar la fuente del ácido nucleico a una temperatura entre 40°C y 80°C para producir un lisado que comprende el ácido nucleico y para desaminar una base de citosina no metilada presente en dicho ácido nucleico,

- añadir tampón de unión al lisado que comprende el ácido nucleico para producir una solución de lisado y tampón de unión,

- unir el ácido nucleico a la membrana de extracción y eliminar el bisulfito mediante el bombeo controlado de la solución de lisado y tampón de unión sobre la membrana de extracción,

- eluir el ácido nucleico convertido de la membrana de extracción y

- analizar el ácido nucleico convertido.

En un aspecto más específico de la descripción, se proporciona el uso de un sistema automatizado para la detección de un estado de metilación de ácido nucleico en una fuente de ácido nucleico, el sistema automatizado está adaptado para alojar a un cartucho como se define en esta solicitud, el sistema que controla los pasos de:

- agregar bisulfito a una fuente de un ácido nucleico introducido en el sistema automatizado y seguido inmediatamente por el calentamiento de la fuente del ácido nucleico a una temperatura entre 40°C y 602C para producir un lisado que comprende el ácido nucleico y para desaminar una base de citosina no metilada presente en dicho ácido nucleico,

- unir el ácido nucleico a la membrana de extracción y eliminar el bisulfito bombeando la solución de lisado y tampón de unión sobre la membrana de extracción con un caudal menor o igual a 0,1 ml/s,

- añadir tampón de desulfonación a la cámara de extracción y bombear el tampón de desulfonación sobre la membrana de extracción con un caudal menor o igual a 0,1 ml/s para desulfonar la base desaminada en el primer paso en el ácido nucleico y convertir dicha base en una base de uracilo,

- eluir el ácido nucleico convertido de la membrana de extracción y

- analizar el ácido nucleico convertido.

También, un aspecto de la presente descripción es proporcionar un kit para la detección de ADN metilado mediante la conversión del bisulfito del ADN en una muestra, el kit que comprende:

- un cartucho de acuerdo con la invención para su uso en un sistema automatizado, que comprende bisulfito, tampón de unión y tampón de desulfonación, e

- instrucciones de uso.

La invención en todos sus aspectos y realizaciones permite la automatización del procedimiento mediante la omisión de operaciones manuales incontroladas realizadas por personal de laboratorio capacitado y mediante el uso de equipos de laboratorio. Más particularmente, la invención omite la purificación de ADN, la desnaturalización del ADN, elución sobre columnas y centrifugadoras por separado, pero en cambio todos los pasos necesarios para la conversión de bisulfito del ADN en una muestra se realizan dentro de un sistema automatizado que controla todos los pasos de operación de ácidos nucleicos, incluidos los pasos de flujo automatizado y temporalización.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Gráfico que demuestra los resultados de la amplificación por PCR de A) ADN metilado después de la conversión de bisulfito y B) ADN no metilado después de la conversión de bisulfito en el cartucho. El ADN no metilado convertido da una señal HEX debido al hecho de que la sonda específica no metilada tiene un fluoróforo VIC agregado. El ADN metilado convertido da una PCR con una señal FAM, debido al hecho de que la sonda específica metilada tiene un fluoróforo FAM agregado.

Figura 2: Representación visual de los resultados de secuenciación del amplicón de ADN convertido metilado y no metilado. Parte del amplicón de secuenciación se indica en gris. La primera secuencia es del ADN no metilado; todas las citosinas están no metiladas y cambiarán a timina durante la conversión del bisulfito. Téngase en cuenta que la hebra complementaria del amplicón después de la conversión es complementaria a la secuencia del amplicón. Para el ADN convertido metilado, sabiendo que todas las citosinas están metiladas y no serán cambiadas por la conversión del bisulfito, la hebra complementaria antes de la reacción del bisulfito es la misma que después de la reacción.

Descripción detallada de la invención

Generalmente, los métodos de la invención están dirigidos a analizar el estado de metilación de uno o más nucleótidos diana en una o más secuencias diana en una muestra. La presente invención facilita el análisis del estado de metilación del ADN en una muestra de paciente. La descripción proporciona en un primer aspecto un método para la conversión de bisulfito de ADN (en una muestra) en un sistema automatizado que contiene una membrana de extracción, mediante la cual la muestra tratada se bombea sobre la membrana de extracción en varios pasos de bombeo automatizados. Al combinar la purificación y la desnaturalización del ADN anteriores en una muestra de paciente obsoleta, y al bombear la muestra tratada con bisulfito sobre una membrana de extracción dentro del sistema automatizado, se mejora la eficacia y facilidad de uso del proceso de conversión de bisulfito. En una realización de la descripción se proporciona un método para la detección de un estado de metilación de ácido nucleico en un sistema automatizado que comprende una cámara de extracción que comprende una membrana de extracción, comprendiendo dicho método las etapas de, o caracterizado por:

- introducir una fuente del ácido nucleico en el sistema automatizado, agregando bisulfito al ácido nucleico y seguido inmediatamente por el calentamiento de la fuente del ácido nucleico a una temperatura entre 40°C y 802C para producir un lisado que comprende el ácido nucleico y para desaminar una base de citosina no metilada presente en dicho ácido nucleico;

- añadir tampón de desulfonación a la cámara de extracción y bombear de forma controlada el tampón de desulfonación sobre la membrana de extracción para desulfonar la base desaminada en el primer paso en el ácido nucleico y convertir dicha base en una base de uracilo;

- eluir el ácido nucleico convertido de la membrana de extracción; y

- analizar el ácido nucleico convertido en el sistema automatizado.

Alternativamente, el ácido nucleico convertido se puede analizar en otro sistema automatizado que el sistema automatizado que se usa para realizar la conversión de bisulfito. Después de eluir el ácido nucleico convertido de la membrana de extracción en un sistema automático, el ácido nucleico convertido puede analizarse en otro sistema, por ejemplo, en un secuenciador (ADN).

En el contexto de la descripción, el ácido nucleico es ADN genómico que puede comprender bases de citosina metilada en sitios CpG. El tratamiento del ADN con bisulfito (conversión de bisulfito o reacción de bisulfito) modifica químicamente las citosinas no metiladas en uracilo, mientras que las citosinas (5-) metiladas permanecen sin cambios. La química de la desaminación de la citosina (no metilada) por el bisulfito de sodio implica tres pasos: (1) sulfonación: la adición de bisulfito al doble enlace 5-6 de la citosina, (2) desaminación hidrolítica: desaminación hidrolítica del derivado de citosina-bisulfito resultante para dar un derivado de uracilo-bisulfito, (3) desulfonación alcalina: eliminación del grupo sulfonato mediante un tratamiento alcalino para dar uracilo. Una vez convertido, el perfil de metilación del ADN se puede determinar utilizando la aplicación posterior deseada (amplificación posterior con cebadores específicos para ADN metilado frente a ADN no metilado). La expresión "ADN convertido" y "ácido nucleico convertido" como se usa en este documento significa "ADN tratado con bisulfito" y "ácido nucleico tratado con bisulfito". Considerado estrictamente, solo las citosinas no metiladas en el ADN/ácido nucleico serán químicamente modificadas o convertidas en uracilo por el tratamiento con bisulfito, mientras que las citosinas (5-) metiladas no serán modificadas o convertidas por el tratamiento con bisulfito. Sin embargo, cuando se han tratado ADN/ácidos nucleicos con bisulfito, esto se describe como ADN convertido/ácido nucleico convertido en todo el texto.

En una realización relacionada, se proporciona un método alternativo para la detección de ADN metilado mediante conversión de bisulfito de ADN en una muestra en un sistema automatizado que comprende una cámara de extracción que comprende una membrana de extracción, comprendiendo dicho método las etapas de, o caracterizado por:

- introducir una muestra en el sistema automatizado, agregando bisulfito a la muestra y calentando inmediatamente la muestra a una temperatura entre 40°C y 80°C para producir un lisado que comprende ADN y realizar la conversión de bisulfito del ADN;

- añadir tampón de unión al lisado que comprende ADN para producir una solución de lisado y tampón de unión; - unir el ADN a la membrana de extracción y eliminar el bisulfito mediante el bombeo controlado de la solución de lisado y tampón de unión sobre la membrana de extracción;

- añadir tampón de desulfonación a la cámara de extracción y controlar el bombeo del tampón de desulfonación sobre la membrana de extracción;

- eluir el ADN convertido de la membrana de extracción; y

- analizar el ADN convertido en el sistema automatizado.

La descripción también incluye un método de preparación de una muestra para el análisis de metilación mediante conversión de bisulfito de ADN en una muestra en un sistema automatizado que comprende una cámara de extracción que comprende una membrana de extracción, dicho método comprende las etapas de, o se caracteriza por:

- introducir una muestra en el sistema automatizado, añadiendo bisulfito a la muestra y calentando inmediatamente la muestra a una temperatura entre 40°C y 802C para producir un lisado que comprende ADN y realizar la conversión de bisulfito del ADN;

- añadir tampón de unión al lisado que comprende ADN para producir una solución de lisado y tampón de unión; - unir el ADN a una membrana de extracción y eliminar el bisulfito mediante el bombeo controlado de la solución de lisado y tampón de unión sobre la membrana de extracción;

- añadir tampón de desulfonación a la cámara de extracción y bombear con control el tampón de desulfonación sobre la membrana de extracción para realizar la desulfonación alcalina del ADN convertido; y

- eluir el ADN convertido de la membrana de extracción.

En realizaciones preferidas de la presente descripción, el calentamiento inmediato de la fuente de ácido nucleico se realiza a una temperatura entre 40°C y 60°C, y/o el bombeo controlado se realiza preferiblemente con un caudal menor o igual a 0,1 ml/s, entre 0,001 ml/s y 0,1 ml/s, más preferiblemente entre 0,001 y 0,0017 ml/s.

Lisado: es un aspecto de la presente invención liberar ácido(s) nucleico(s) o ADN en una muestra biológica, lo que permite la conversión y análisis directo de ácido nucleico/ADN en un sistema automatizado. Según la presente invención, la adición de bisulfito a un ácido nucleico o muestra biológica, por ejemplo una muestra de tejido, y el calentamiento del ácido nucleico o muestra que contiene ADN produce un lisado. Es importante destacar que el lisado debe poder transportarse a través del sistema automatizado. El lisado comprende ADN que debe incubarse con bisulfito y analizarse en el sistema automatizado (análisis de ácido nucleico/ADN posterior).

Cámara de lisis o cámara de preparación de muestras: aquí se añade la muestra a un sistema automatizado y se realiza la lisis de la muestra, en los métodos de la invención con bisulfito a temperatura elevada. La cámara de lisis es el primer paso en la ruta fluídica a través del cartucho. En una realización particular, el fondo de la cámara de lisis está ubicado directamente encima de un elemento calefactor ("peltier") en el sistema. Preferiblemente, la cámara de lisis está diseñada para transducir de manera óptima el calor al líquido de arriba en la cámara de lisis. En una realización preferida, todas las temperaturas de reacción dentro de la cámara de lisis se controlan directamente mediante una medición de temperatura infrarroja de la superficie exterior de la cámara de lisis. También pueden usarse otros medios para medir la temperatura de reacción de la cámara de lisis. La fuente de un ácido nucleico puede ser cualquier fuente que comprenda un ácido nucleico; puede ser una fuente biológica de un ácido nucleico o cualquier solución que comprenda un ácido nucleico, por ejemplo, ADN en una solución tampón.

La muestra es una muestra biológica de un cuerpo humano o animal, preferiblemente una muestra de un paciente. La muestra biológica comprende ácidos nucleicos o células que comprenden ADN a analizar según los métodos de la invención. La muestra puede ser una muestra de tejido, una muestra de frotis, un líquido corporal, un precipitado de líquido corporal o una muestra de lavado. Los ejemplos no limitantes incluyen muestras de tejido fresco humano o animal, muestras de tejido congelado, muestras de tejido incrustadas en FFpE (tejido incrustado en parafina fijado con formalina), sangre completa, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, orina, heces, saliva, líquido cefalorraquídeo, líquido peritoneal, líquido pleural, líquido linfático, aspirado del pezón, esputo y eyaculación. Las muestras pueden recolectarse usando cualquier método adecuado conocido en la técnica.

La presente descripción implica el uso de una membrana de extracción, p. ej. para unir el ADN convertido con bisulfito y para la eliminación de la reacción de conversión de bisulfito antes de las aplicaciones posteriores. La membrana de extracción está presente en la cámara de extracción de un cartucho. Los ácidos nucleicos se pueden retener en la membrana de extracción para su posterior purificación, concentración o procesamiento. Las membranas de extracción adecuadas incluyen membranas de vidrio y sílice. En realizaciones preferidas, la membrana de extracción es una membrana de sílice. Se pueden utilizar una o más membranas de sílice según sea apropiado, tales como 2, 3, 4 o 5 membranas de sílice, o una membrana compuesta que comprende 2 o 3 capas de membrana de sílice. En una realización particular, la membrana de extracción según la invención consta de 2 o 3 membranas de sílice separadas y distintas apiladas (estrechamente) entre sí para formar una membrana de extracción, por lo que el bombeo de fluidos en la cámara de extracción se realiza sobre/a través de dicha membranas de sílice apiladas.

En un sistema automatizado el método se lleva a cabo en un proceso automatizado, lo que significa que el método o los pasos del proceso se llevan a cabo con un aparato o máquina capaz de operar con poco o ningún control externo o influencia por parte de algún ser humano. Se han descrito sistemas automatizados adecuados en los documentos EP1896180, EP1904234 y EP2419705 y, por consiguiente, se incorporan en determinadas realizaciones que describen la presente invención. Preferiblemente, se utilizan sistemas basados en cartuchos que contienen una o más cámaras de reacción y una o más cámaras de fluido. Algunas de las cámaras de fluido pueden contener fluido que se utiliza para producir un lisado a partir de la muestra. Otras cámaras pueden contener fluidos como tampones de reacción, fluidos de lavado y soluciones de amplificación. Las cámaras de reacción se utilizan para realizar los diferentes pasos de la detección como lavado, lisis y amplificación.

El término "cartucho" debe entenderse como un conjunto autónomo de cámaras y/o canales que se forma como un solo objeto que se puede transferir o mover como un accesorio dentro o fuera de un instrumento más grande adecuado para recoger (es decir, alojar o conectar a) dicho cartucho. Algunas partes contenidas en el cartucho pueden estar conectadas firmemente mientras que otras pueden estar conectadas de manera flexible y móviles con respecto a los diferentes componentes del cartucho. Como se usa en este documento, el término "cartucho" se referirá principalmente a un "cartucho fluídico" que es un cartucho que incluye al menos una cámara o canal adecuado para tratar, procesar, descargar o analizar un fluido, preferiblemente un líquido.

El sistema automatizado puede ser un sistema automatizado abierto o cerrado. Cuando se ha agregado o insertado una muestra en el sistema basado en cartuchos, el sistema basado en cartuchos se cierra y permanece cerrado durante el funcionamiento del sistema. El sistema cerrado contiene todos los reactivos necesarios dentro, por lo que la configuración cerrada proporciona la ventaja de que el sistema realiza una detección libre de contaminación. Alternativamente, se puede utilizar un cartucho accesible abierto en un sistema automatizado. Los reactivos necesarios se agregan en el cartucho abierto según se requiera, luego se puede insertar una muestra en el cartucho abierto y el cartucho se puede procesar en un sistema automático cerrado.

En un entorno particular, el sistema automatizado consta de los siguientes elementos: un instrumento, una consola y cartuchos. El instrumento y la consola funcionan en combinación con los cartuchos consumibles. El instrumento comprende módulos de control para realizar ensayos. La consola es una computadora para controlar y monitorear las acciones del instrumento y el estado del cartucho durante los ensayos. En el cartucho se llevará a cabo el ensayo. Después de insertar una muestra en un cartucho, precargado con reactivos, el cartucho se carga en el instrumento y el instrumento controla el ensayo que se realiza de forma autónoma en el cartucho. Una vez realizado el ensayo, el software de la consola procesa los resultados y genera un informe accesible para el usuario final del sistema automatizado.

En realizaciones preferidas que describen la presente descripción, todos los reactivos necesarios para realizar un ensayo de detección de ADN metilado se colocan previamente dentro del cartucho de modo que el cartucho sea un aparato desechable autónomo para realizar ensayos de ácido nucleico. Los medios adecuados incluyen biochips basados en una micromatriz de ADN o una micromatriz de proteínas y/o dispositivos para realizar termociclado (p. ej. PCR, LCR y otros) y/o medios para secuenciar. Preferiblemente, el cartucho incorporará medios para realizar el termociclado, preferiblemente la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR). Los métodos de PCR son habituales en la técnica y se basan en ciclos térmicos, que consisten en ciclos de calentamiento y enfriamiento repetidos de la reacción para la fusión del ácido nucleico y la replicación enzimática del ácido nucleico. Tales reacciones de amplificación emplean típicamente ácidos nucleicos diana y componentes de reacción tales como una ADN polimerasa termoestable (por ejemplo polimerasa Taq), nucleótidos y oligonucleótidos (por ejemplo, cebadores, sondas, bloqueadores,...) necesarios para el inicio de la síntesis de ácidos nucleicos. En aplicaciones preferidas, el sistema automatizado aplicará termociclado utilizando reactivos en forma seca presentes en el sistema. La muestra se tratará como se describe en la presente invención para formar un lisado que comprenda ácido nucleico, y los reactivos preposicionados en el sistema automatizado se reconstituyen en el momento de llevar a cabo un ensayo en la muestra/analizar la muestra en el sistema automatizado. El ácido nucleico se eluirá (de una membrana de extracción) en el sistema automatizado. Por consiguiente, el eluido permite el análisis de ácido nucleico/PCR aguas abajo directamente en el sistema automatizado. Normalmente, se utilizan controladores microneumáticos para dirigir ("bombear") el lisado, los reactivos y el eluido según se requiera para completar el ensayo. Los ensayos pueden incluir detección de punto final o en tiempo real; ambos métodos son habituales en la técnica.

Bombeo: en una realización particular de la invención "bombeo" significa el transporte o movimiento de fluidos (líquidos o gases) a través de la cámara de extracción/a través de la membrana de extracción. "Bombeo controlado" significa bombeo controlado en un sistema automatizado o significa que el flujo se puede especificar en un sistema. El sistema automatizado controla así el caudal de bombeo de fluidos en el sistema automatizado (que es diferente en comparación con el uso, por ejemplo, de la gravedad o fuerza(s) centrífuga(s) para mover fluidos de un lugar a otro). El bombeo controlado (control de flujo) permite la unión óptima de un ácido nucleico a una membrana de extracción y la eliminación de reactivos o tampones de una fuente que contiene ácido nucleico. Las aplicaciones incluyen la eliminación óptima del reactivo bisulfito mediante el bombeo controlado de una solución de lisado y tampón de unión sobre una membrana de extracción y la desulfonación óptima de una base desaminada en un ácido nucleico y la conversión de dicha base en una base de uracilo mediante la adición de tampón de desulfonación y bombeo controlado del tampón de desulfonación sobre una membrana de extracción. El bombeo controlado tiene la ventaja de que un sistema puede aplicar bombeo de velocidad variable según se requiera en dicho sistema. Esto es especialmente útil para controlar las etapas del método de la descripción como se describe en este documento. Caudal: en una realización particular de la invención el "caudal" significa la velocidad de bombeo de los fluidos que atraviesan la cámara de extracción/a través de la membrana de extracción. En una realización preferida, el caudal se expresa en ml/s.

Los kits disponibles actualmente para la detección de ADN metilado requieren la preparación de la muestra, como la purificación de ADN (por ejemplo, purificación de ADN de sangre, tejido o células) y un paso de desnaturalización del ADN (generalmente calentando la muestra que contiene ADN a 98°C durante 10 minutos). Estos pasos preparativos se han eliminado en los métodos de la presente invención. Por lo tanto, al contrario de los métodos y sistemas de conversión de ácidos nucleicos existentes, que implican una purificación de ácidos nucleicos y una etapa de desnaturalización nucleica posterior, el calentamiento de 10 min de 95°C a 98°C antes del tratamiento con reactivo de conversión de ácidos nucleicos, la presente invención mantiene la muestra a una temperatura de reacción inferior a 98°C, preferiblemente inferior a 95°C, inferior a 94°C, inferior a 93°C, inferior a 92°C, inferior a 91°C, inferior a 90°C, inferior a 85°C, inferior a 80°C, por debajo de 70°C, por debajo de 60°C sin afectar en gran medida la detección de metilación posterior sensible y específica. De hecho, el reactivo de conversión de ácido nucleico se agrega directamente al ácido nucleico o muestra y se calienta directamente a una temperatura de reacción entre 40°C y 60°C, entre 45°C y 55°C, más preferiblemente entre 49°C y 53°C para producir un lisado. Más preferiblemente, la temperatura de reacción para producir el lisado es 40°C, 42°C, 44°C, 46°C, 48°C, 49°C, 50°C, 50,5°C, 51 °C, 51,5°C, 522C, 53°C, 54°C, 56°C, 58°C, 59°C, 60°C, 62°C, 64°C, 66°C, 68°C, 70°C, 72°C, 74°C, 76°C, 78°C, 80°C. En una realización particular, la temperatura de reacción para producir el lisado es 51°C.

El ácido nucleico/muestra se calienta en la cámara de lisis. El sistema automatizado, más particularmente el instrumento, contiene un elemento calefactor que puede calentar la cámara de lisis a través de la pared de la cámara de lisis a una temperatura de reacción dada. El tiempo necesario para alcanzar una temperatura de reacción en la cámara de lisis está relacionado o es proporcional a la temperatura solicitada y al volumen de los fluidos dentro de la cámara de lisis (el lisado) a calentar. Según la altura de la temperatura de reacción requerida y el volumen a calentar, puede llevar hasta 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 25 minutos o 30 minutos para alcanzar la temperatura solicitada. El sistema automatizado controla la temperatura de reacción dentro de la cámara de lisis mediante una medición de temperatura de la superficie exterior de la cámara de lisis. Sin embargo, puede ser hasta 25°C más caliente dentro de la cámara de lisis que la temperatura de la superficie exterior de la cámara de lisis. Se estima que cuando la temperatura de la pared de la cámara de lisis se establece en 40°C y con 700 gl del reactivo de conversión presente dentro de la cámara de lisis, la temperatura de reacción dentro de la cámara de lisis será de 51 °C.

De manera similar, la cámara de extracción, con una membrana de extracción en su interior, se puede calentar mediante un elemento calefactor ubicado dentro del sistema automatizado, más particularmente dentro del instrumento, y ubicado muy cerca de la cámara de extracción. El elemento calefactor puede calentar la cámara de extracción a través de la pared de la cámara de extracción. En una realización de la invención, se realiza un paso de lavado después del paso de eliminación de bisulfito añadiendo tampón de lavado a la cámara de extracción y bombeando el tampón de lavado sobre la membrana de extracción con una temperatura de 40°C con un caudal más lento o igual a 0,1 ml/s. En otra realización de la invención, la desulfonación se realiza añadiendo tampón de desulfonación a la cámara de extracción y bombeando el tampón de desulfonación sobre la membrana de extracción a una temperatura de 20°C con un caudal como se describe en el presente documento.

Todos los métodos, cartuchos y sistemas de la presente descripción añaden directamente solución de bisulfito al ácido nucleico/muestra y controlan la degradación del ácido nucleico empleando una temperatura de calor más baja y un tiempo de incubación más largo para producir un lisado que comprende ácido nucleico/ADN. En realizaciones preferidas, el calentamiento es de 30 minutos a 1 hora a una temperatura de reacción adecuada, preferiblemente a una temperatura de reacción de 40 a 60°C. Para lograr una sensibilidad y especificidad óptimas, el tiempo de calentamiento es de alrededor 1 hora a una temperatura de 40 a 60°C, el tiempo de calentamiento es preferiblemente de 30 min, 35 min, 40 min, 45 min, 50 min, 51 min, 52 min, 53 min, 54 min, 55 min, 56 min, 57 min, 58 min, 59 min, 60 min, 61 min, 62 min, 63 min, 64 min, 65 min, 66 min, 67 min, 68 min, 69 min, 70 min, 75 minutos, 80 minutos a la temperatura adecuada. La medición de la temperatura se detalla en otra parte de la presente descripción.

La descripción requiere que se bombeen soluciones sobre la membrana de extracción y, por lo general, los pasos de bombeo implican un bombeo controlado en un sistema automatizado, más preferiblemente un bombeo lento, por ejemplo, un bombeo con un caudal menor o igual a 0,1 ml/s, preferiblemente con un caudal entre 0,001 ml/s y 0,1 ml/s, más preferiblemente con un caudal entre 0,001 y 0,0017 ml/s. En una realización particular, en los métodos según la invención existe al menos un caudal entre 0,001 y 0,0017 ml/s.

Varios de los kits actualmente disponibles para la detección de ADN metilado realizan la eliminación de bisulfito usando una columna de centrifugación de baja elución que se lava primero con tampón de unión, después de lo cual la solución de ADN convertido se agrega a la columna para eliminar el reactivo de conversión de bisulfito. De acuerdo con la presente invención, después de añadir el tampón de unión de conversión de bisulfito al lisado y la solución de lisado y tampón de unión se bombea sobre una membrana de extracción con un caudal menor o igual a

0,1 ml/s, preferiblemente con un caudal entre 0,001 ml/s y 0,1 ml/s, más preferiblemente entre 0,001 y 0,0017 ml/s

para eliminar el reactivo de conversión de bisulfito, sin necesidad de un paso de columna de elución.

Varios de los kits disponibles actualmente para la detección de ADN metilado requieren múltiples pasos de

centrifugación. En estos kits, la etapa de desulfonación se realiza incubando la solución de ADN convertida con

tampón de desulfonación durante 20 minutos a temperatura ambiente, seguido de una etapa de centrifugación;

luego se agrega el tampón de lavado, seguido de una siguiente etapa de centrifugación; luego se agrega un tampón

de elución, seguido nuevamente por un paso de centrifugación para eluir el ADN convertido. Según la presente

invención, la etapa de desulfonación se realiza añadiendo tampón de desulfonación a la solución de ADN convertido

en el sistema automatizado y bombeando el tampón de desulfonación sobre la membrana de extracción con un

caudal menor o igual a 0,1 ml/s, preferiblemente con un caudal entre 0,001 ml/s y 0,1 ml/s, más preferiblemente

entre 0,001 y 0,0017 ml/s, sin una etapa de centrifugación. De manera similar, los pasos de lavado y la elución del

ADN convertido de la membrana de extracción se realizan bombeando tampón de elución sobre la membrana de

extracción con un caudal menor o igual a 0,1 ml/s, sin necesidad de ningún paso de centrifugación.

La unión óptima del ácido nucleico de la solución de lisado y tampón de unión a la membrana de extracción

implicará un caudal menor o igual a 0,1 ml/s, o entre 0,001 ml/s y 0,1 ml/s, o entre 0,001 y 0,0017 ml/s,

preferiblemente un caudal no superior a 0,1 ml/s, 0,090 ml/s, 0,080 ml/s, 0,075 ml/s, 0,070 ml/s, 0,0625 ml/s,

0,060 ml/s, 0,050 ml/s, 0,040 ml/s, 0,030 ml/s, 0,020 ml/s, 0,01 ml/s, 0,0090 ml/s, 0,0080 ml/s, 0,0070 ml/s,

0,0060 ml/s, 0,0050 ml/s, 0,0040 ml/s, 0,0030 ml/s, 0,0020 ml/s, 0,0019 ml/s, 0,0018 ml/s, 0,0017 ml/s, 0,0016 ml/s,

0,0015 ml/s, 0,0014 ml/s, 0,0013 ml/s, 0,0012 ml/s, 0,0011 ml/s o 0,0010 ml/s. Lo más preferiblemente, la unión

óptima del ácido nucleico de la solución de lisado y tampón de unión a la membrana de extracción implicará un

caudal de 0,1 ml/s.

La eliminación de bisulfito de la solución de lisado y tampón de unión mediante el bombeo de la solución de lisado y

tampón de unión sobre la membrana de extracción implicará un caudal más lento o igual a 0,1 ml/s, o entre

0,001 ml/s y 0,1 ml/s, o entre 0,001 y 0,0017 ml/s, preferiblemente un caudal no superior a 0,1 ml/s, 0,090 ml/s,

0,080 ml/s, 0,075 ml/s, 0,070 ml/s, 0,0625 ml/s, 0,060 ml/s, 0,050 ml/s, 0,040 ml/s, 0,030 ml/s, 0,020 ml/s, 0,01 ml/s,

0,0090 ml/s, 0,0080 ml/s, 0,0075 ml/s, 0,0070 ml/s, 0,0060 ml/s, 0,0050 ml/s, 0,0040 ml/s, 0,0030 ml/s, 0,0020 ml/s,

0,0019 ml/s, 0,0018 ml/s, 0,0017 ml/s, 0,0016 ml/s, 0,0015 ml/s, 0,0014 ml/s, 0,0013 ml/s, 0,0012 ml/s, 0,0011 ml/s o

0,0010 ml/s. Lo más preferiblemente, la eliminación óptima de bisulfito de la solución de lisado y tampón de unión

sobre la membrana de extracción implicará un caudal de 0,1 ml/s.

La desulfonación óptima del ácido nucleico bombeando tampón de desulfonación sobre la membrana de extracción

implicará un caudal menor o igual a 0,1 ml/s, o entre 0,001 ml/s y 0,1 ml/s, o entre 0,001 y 0,0017 ml/s, es preferible

un caudal no superior a 0,1 ml/s, 0,090 ml/s, 0,080 ml/s, 0,075 ml/s, 0,070 ml/s, 0,0625 ml/s, 0,060 ml/s, 0,050 ml/s,

0,040 ml/s, 0,030 ml/s, 0,020 ml/s, 0,01 ml/s, 0,0090 ml/s, 0,0080 ml/s, 0,0075 ml/s, 0,0070 ml/s, 0,0060 ml/s,

0,0050 ml/s, 0,0040 ml/s, 0,0030 ml/s, 0,0020 ml/s, 0,0019 ml/s, 0,0018 ml/s, 0,0017 ml/s, 0,0016 ml/s, 0,0014 ml/s, 0,0013 ml/s, 0,0012 ml/s, 0,0011 ml/s o 0,0010 ml/s. Más preferiblemente, la desulfonación ácido nucleico bombeando tampón de desulfonación sobre la membrana de extracción implicará un caudal de

0,0017 ml/s.

La desulfonación (alcalina) se realiza bombeando el tampón de desulfonación sobre una membrana de extracción

con un caudal menor o igual a 0,1 ml/s. Para la desulfonación alcalina de la etapa de bombeo de ADN convertido, el

caudal debe mantenerse preferiblemente muy lento, preferiblemente no superior a 0,01 ml/s, 0,075 ml/s,

0,0625 ml/s, 0,0090 ml/s, 0,0080 ml/s, 0,0075 ml/s, 0,0070 ml/s, 0,0060 ml/s, 0,0050 ml/s, 0,0040 ml/s, 0,0020 ml/s, más preferiblemente no superior a 0,0017 ml/s, incluso más preferiblemente entre 0,001 y 0,0017 ml/s.

Manteniendo bajo el caudal del bombeo sobre la membrana de extracción, las impurezas y los elementos no

deseados en la muestra, que pueden formarse durante la conversión de bisulfito, por ejemplo, se eliminan

adecuadamente de la muestra tratada cuando se bombea sobre la membrana. La eliminación del bisulfito de la

etapa de bombeo de lisado puede realizarse algo más rápido que la desulfonación (alcalina) de la etapa de bombeo

de ADN convertido.

En una realización preferida de la descripción, se proporciona un método para la detección de un estado de

metilación de ácido nucleico en un sistema automatizado que comprende una cámara de extracción que comprende

una membrana de extracción, comprendiendo dicho método las etapas de, o caracterizado por:

- introducir una fuente del ácido nucleico en el sistema automatizado, agregando bisulfito al ácido nucleico y seguido

inmediatamente por el calentamiento de la fuente del ácido nucleico a una temperatura entre 40°C y 60°C para

producir un lisado que comprende el ácido nucleico y para desaminar una base de citosina no metilada presente en

dicho ácido nucleico presente en dicho lisado;

- unir el ácido nucleico a la membrana de extracción y eliminar el bisulfito bombeando la solución de lisado y tampón

de unión sobre la extracción con un caudal de entre 0,001 ml/s y 0,0017 ml/s,

- añadir tampón de desulfonación a la cámara de extracción y bombear el tampón de desulfonación sobre la membrana de extracción con un caudal entre 0,001 ml/s y 0,0017 ml/s para desulfonar la base desaminada en el primer paso en el ácido nucleico y convertir dicha base en una base de uracilo;

- eluir el ácido nucleico convertido de la membrana de extracción; y

- analizar el ácido nucleico convertido en el sistema automatizado.

En una realización preferida adicional, se proporciona un método para la detección de ADN metilado mediante conversión de ADN con bisulfito en una muestra en un sistema automatizado que comprende una cámara de extracción que comprende una membrana de extracción, comprendiendo dicho método las etapas de, o caracterizado por:

- introducir una muestra en el sistema automatizado, agregando bisulfito a la muestra y calentando inmediatamente la muestra a una temperatura entre 40°C y 602C para producir un lisado que comprende ADN y realizar la conversión de bisulfito de dicho ADN;

- añadir tampón de unión al lisado que comprende ADN para producir una solución de lisado y tampón de unión; - unir el ADN a la membrana de extracción y eliminar el bisulfito bombeando la solución de lisado y tampón de unión sobre la membrana de extracción con un caudal entre 0,001 ml/s y 0,0017 ml/s;

- añadir tampón de desulfonación a la cámara de extracción y bombear el tampón de desulfonación sobre la membrana de extracción con un caudal entre 0,001 ml/s y 0,0017 ml/s para realizar la desulfonación alcalina del ADN convertido;

- eluir el ADN convertido de la membrana de extracción; y

- analizar el ADN convertido en el sistema automatizado.

De acuerdo con la invención, la etapa de eliminación de bisulfito y la etapa de desulfonación (alcalina) se realizan bombeando respectivamente la solución de lisado y tampón de unión y el tampón de desulfonación sobre una membrana de extracción secuencialmente en dos etapas de bombeo separadas y distintas sobre dicha (una y otra) membrana de extracción. En una realización aún más preferida, la etapa de eliminación de bisulfito y la etapa de desulfonación (álcali) se realizan bombeando una membrana de extracción secuencialmente, por lo que la etapa de desulfonación-bombeo se realiza más lentamente que la etapa de eliminación de bisulfito-bombeo. Además, el tampón de lavado se puede bombear sobre la membrana de extracción en una o más etapas de lavado, que preferiblemente se encuentran entre la etapa de remoción de bisulfito-bombeo y la etapa de desulfonación-bombeo (álcali), y nuevamente después de la etapa de desulfonación (álcali)-bombeo. En una realización preferida, el tampón de lavado se bombea sobre la membrana de extracción con un caudal de 0,0625 ml/s.

En una realización de la descripción, se proporciona un método para la detección de un estado de metilación de ácido nucleico en un sistema automatizado que comprende una cámara de extracción que comprende una membrana de extracción, comprendiendo dicho método las etapas de, o caracterizado por:

- introducir una fuente del ácido nucleico ácido en el sistema automatizado, agregando bisulfito al ácido nucleico y seguido inmediatamente por el calentamiento de la fuente del ácido nucleico a una temperatura entre 40°C y 60°C para producir un lisado que comprenda el ácido nucleico y para desaminar una base de citosina no metilada presente en dicho ácido nucleico;

- unir el ácido nucleico a la membrana de extracción y eliminar el bisulfito bombeando la solución de lisado y tampón de unión sobre la membrana de extracción con un caudal menor o igual a 0,1 ml/s y en un período de tiempo entre 2 y 15 minutos;

- añadir tampón de desulfonación a la cámara de extracción y bombear el tampón de desulfonación sobre la membrana de extracción con un caudal menor o igual a 0,1 ml/s y en un período de tiempo entre 6 y 20 minutos, para desulfonar la base desaminada en el primer paso en el ácido nucleico y convertir dicha base en una base de uracilo;

- eluir el ácido nucleico convertido de la membrana de extracción; y

- analizar el ácido nucleico convertido en el sistema automatizado.

De una manera similar a la ya descrita en este documento, se proporciona un método para la detección de ADN metilado mediante conversión de bisulfito de ADN en una muestra en un sistema automatizado que comprende una cámara de extracción que comprende una membrana de extracción, comprendiendo dicho método las etapas de: - introducir una muestra en el sistema automatizado, agregando bisulfito a la muestra e inmediatamente después calentando la muestra a una temperatura entre 40°C y 60°C para producir un lisado que comprende el ADN y realizar la conversión de bisulfito del ADN,

- añadir tampón de unión al lisado que comprende ADN para producir una solución de lisado y tampón de unión; - unir el ADN a la membrana de extracción y eliminar el bisulfito bombeando la solución de lisado y tampón de unión sobre la membrana de extracción con un caudal menor o igual a 0,1 ml/s y en un período de tiempo entre 2 y 15 minutos;

- añadir tampón de desulfonación a la cámara de extracción y bombear el tampón de desulfonación sobre la membrana de extracción con un caudal menor o igual a 0,1 ml/s y en un período de tiempo entre 6 y 20 minutos para realizar la desulfonación alcalina del ADN convertido;

- eluir el ADN convertido de la membrana de extracción; y

- analizar el ADN convertido en el sistema automatizado.

Como se describe, la eficacia del proceso de conversión de bisulfito se mejora y permite una degradación mínima del ADN. Por tanto, los métodos de la invención son particularmente útiles para el análisis de metilación de muestras con cantidades relativamente pequeñas de ADN genómico. Por ejemplo, algunas muestras pueden incluir 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 nanogramos de ADN. Otras muestras pueden incluir tan solo 500, 400, 300, 200 o 100 picogramos de ADN. Ejemplos de estas muestras son la orina y el plasma, que incluyen cantidades relativamente pequeñas de ADN circulante. En este sentido, los métodos de la invención son útiles para el análisis de muestras que incluyen ADN genómico escaso o empobrecido.

Los métodos de la descripción encuentran su aplicación en sistemas automatizados. En ciertas realizaciones, los sistemas automatizados contendrán un cartucho para la detección de ADN metilado en una muestra. En una realización de la presente invención, se usa un cartucho para la detección de ADN metilado en una muestra de acuerdo con los métodos de la invención, por ejemplo en una muestra de tejido humano. Preferiblemente, el cartucho comprende una cámara de extracción, cámara de extracción que contiene una membrana de extracción. Incluso más preferiblemente, el cartucho comprende una cámara de lisis y una cámara de extracción, cuya cámara de extracción contiene una membrana de extracción, y en la que hay un canal entre la cámara de lisis y la cámara de extracción para transportar fluidos desde la cámara de lisis a la cámara de extracción. El canal es un camino fluídico dentro del cartucho que conecta la cámara de lisis con la cámara de extracción. El canal puede ser un canal simple o un canal que contenga cámaras adicionales entre la cámara de lisis y la cámara de extracción. Incluso más preferiblemente, el cartucho comprende una cámara de lisis, una cámara de extracción, cuya cámara de extracción contiene una membrana de extracción, y en el que hay un canal entre la cámara de lisis y la cámara de extracción para transportar fluidos desde la cámara de lisis a la cámara de extracción, y un módulo de PCR para los pasos del proceso de PCR en el cartucho.

Por tanto, los cartuchos adecuados comprenden una pluralidad de cámaras, preferiblemente al menos tres cámaras: una cámara de lisis, una cámara de extracción, cuya cámara de extracción contiene una membrana de extracción y una cámara de PCR que permite el análisis de ADN posterior. Pueden ser necesarias otras cámaras para el almacenamiento de reactivos adecuados para su uso en el procedimiento de detección de metilación del ácido nucleico. Los canales fluídicos proporcionan conexión entre las diferentes cámaras y permiten el transporte de fluidos (líquidos y gases) de una cámara a otra según lo requieran los métodos descritos en la presente invención. Normalmente, la cámara de lisis del cartucho es susceptible de:

- alojar una muestra,

- añadir una solución de bisulfito a la muestra,

- calentar la muestra directamente entre 40°C y 60°C para producir un lisado que comprenda ADN y realizar la conversión de bisulfito del ADN en el lisado,

- añadir tampón de unión al lisado.

La solución de bisulfito y el tampón de unión se almacenarán en cámaras o recipientes adicionales en el cartucho y las cámaras o recipientes adicionales estarán en conexión con la cámara de lisis a través de un canal fluídico.

Como se detalla en otra parte de la descripción, la cámara de extracción del cartucho contiene una membrana de extracción. La cámara de extracción del cartucho es susceptible de:

- alojar el lisado,

- permitir la posterior eliminación del bisulfito bombeando la solución de lisado y tampón de unión sobre la membrana de extracción con un caudal menor o igual a 0,1 ml/s, entre 0,001 ml/s y 0,1 ml/s, más preferiblemente entre 0,001 y 0,0017 ml/s,

- permitir la posterior adición de tampón de desulfonación a la cámara de extracción y bombear el tampón de desulfonación sobre la membrana de extracción con un caudal menor o igual a 0,1 ml/s, entre 0,001 ml/s y 0,1 ml/s, más preferiblemente entre 0,001 y 0,0017 ml/s para realizar la desulfonación alcalina del ADN convertido, y - permitir la posterior elución del ADN convertido de la membrana de extracción.

Para permitir la realización de los diferentes pasos, existe un canal entre la cámara de lisis y la cámara de extracción para transportar los fluidos desde la cámara de lisis a la cámara de extracción. El cartucho también contiene una cámara de PCR que permite el análisis posterior del ADN convertido. Entre la cámara de extracción y la cámara de PCR existe un canal de fluido para transportar el ADN convertido desde la cámara de extracción a la cámara de PCR.

La descripción proporciona un cartucho para la detección de un estado de metilación de ácido nucleico según los métodos de la invención en un sistema automatizado, comprendiendo dicho cartucho una cámara de extracción que comprende una membrana de extracción, bisulfito, tampón de unión y tampón de desulfonación. La membrana de extracción en la cámara de extracción del cartucho es susceptible de unir el ácido nucleico y eliminar el bisulfito cuando la solución de lisado y tampón de unión se transporta sobre la membrana de extracción.

La descripción también proporciona un cartucho para la detección de un estado de metilación de ácido nucleico, el cartucho que comprende:

- una cámara de lisis susceptible de alojar a una fuente del ácido nucleico, agregar una solución de bisulfito a la fuente del ácido nucleico, y seguido inmediatamente por el calentamiento de la fuente del ácido nucleico a una temperatura entre 40°C y 60°C para producir un lisado que comprende el ácido nucleico y para desaminar una base de citosina no metilada presente en dicho ácido nucleico, y agregar tampón de unión al lisado para formar una solución de lisado y tampón de unión;

- una cámara de extracción que comprende una membrana de extracción susceptible de alojar a la solución de lisado y tampón de unión, lo que permite la posterior eliminación del bisulfito bombeando la solución de lisado y tampón de unión sobre la membrana de extracción con un caudal más lento o igual a 0,1 ml/s, entre 0,001 ml/s y 0,1 ml/s, más preferiblemente entre 0,001 y 0,0017 ml/s, permitiendo la posterior adición de tampón de desulfonación a la cámara de extracción y bombeando el tampón de desulfonación sobre la membrana de extracción con un caudal más lento superior o igual a 0,1 ml/s, entre 0,001 ml/s y 0,1 ml/s, más preferentemente entre 0,001 y 0,0017 ml/s, para desulfonar la base desaminada en el primer paso en el ácido nucleico y convertir dicha base en un base de uracilo, y permitiendo la elución posterior del ácido nucleico convertido de la membrana de extracción, donde hay un canal entre la cámara de lisis y la cámara de extracción para transportar fluidos desde la cámara de lisis a la cámara de extracción, y

La descripción también proporciona un cartucho para la detección de ADN metilado en una muestra, el cartucho que comprende:

- una cámara de lisis susceptible de alojar a una muestra, agregando solución de bisulfito a la muestra, calentando la muestra para producir un lisado que comprende ADN y para realizar la conversión de bisulfito del ADN en el lisado, y añadiendo tampón de unión al lisado convertido para formar una solución de lisado y tampón de unión,

- una cámara de extracción con una membrana de extracción susceptible de alojar a la solución de lisado y tampón de unión, lo que permite la eliminación posterior del bisulfito bombeando la solución de lisado y tampón de unión sobre la membrana de extracción con un caudal más lento o igual que a 0,1 ml/s, entre 0,001 ml/s y 0,1 ml/s, más preferiblemente entre 0,001 y 0,0017 ml/s, permitiendo la posterior adición de tampón de desulfonación a la cámara de extracción y bombeando el tampón de desulfonación sobre la membrana de extracción con un caudal más lento o igual que 0,1 ml/s, entre 0,001 ml/s y 0,1 ml/s, más preferiblemente entre 0,001 y 0,0017 ml/s, para realizar la desulfonación alcalina del ADN convertido y permitir la elución posterior del ADN convertido de la membrana de extracción,

- una cámara de PCR que permite el análisis aguas abajo del ADN convertido, donde hay un canal entre la cámara de extracción y la cámara de PCR para transportar el ADN convertido de la cámara de extracción a la cámara de PCR.

En una realización más preferida, el cartucho contiene una cámara de lisis, 8 recipientes con reactivos, un área de filtro, una cámara de extracción con una membrana de extracción en ésta, una cámara de PCR y una cámara de desechos y todos los canales de conexión. Los recipientes de reactivos almacenan los reactivos necesarios para la detección de ácido nucleico metilado o ADN (tampón de desulfonación, tampones de lavado, etc.).

La invención también proporciona un sistema para la detección automática de ADN metilado, sistema que es adecuado para llevar a cabo los métodos de la presente invención. La aplicación de los métodos descritos puede requerir que el sistema automático aloje a un cartucho como se ha descrito.

En una realización particular de la descripción, en el sistema automatizado se inserta/carga un cartucho, cuyo cartucho comprende una cámara de lisis y una cámara de extracción, con una membrana de extracción en su interior, y donde hay un canal fluídico entre la cámara de lisis y la cámara de extracción, en la que el canal fluídico contiene un filtro. El instrumento, que es uno de los elementos del sistema automatizado, controla los pasos del ensayo (la conversión de bisulfito del ADN en una muestra) que se realizarán dentro del cartucho. El cartucho está precargado con los reactivos y tampones necesarios. Después de introducir la muestra en la cámara de lisis del cartucho, el cartucho se carga en el instrumento y el instrumento controla el ensayo que se realiza de forma autónoma en el cartucho. Se añade bisulfito a la muestra en la cámara de lisis del cartucho y la temperatura de reacción en la cámara de lisis se eleva entre al menos 40 y 60°C para realizar la conversión de bisulfito del ADN en la muestra. Después de la conversión del bisulfito en la cámara de lisis, se agrega tampón de unión a la cámara de lisis para producir una solución de lisado y tampón de unión. Desde la cámara de lisis, la solución de lisado y tampón de unión se conduce a través de un canal hacia la cámara de extracción en el cartucho. El canal puede estar provisto de uno o más filtros. La función principal de esos filtros es limpiar el lisado, eliminar los residuos formados en la cámara de lisis, eliminar cualquier partícula que pueda ser lo suficientemente grande como para bloquear cualquiera de los canales estrechos aguas abajo en el sistema automático o cartucho. En la cámara de extracción, el ADN del lisado se une a la membrana de extracción y el bisulfito se elimina bombeando la solución de lisado y tampón de unión sobre la membrana de extracción con un caudal como se describe. A continuación, se bombea el tampón de lavado que comprende etanol sobre la membrana de extracción con un caudal de entre 0,001 ml/s y 0,1 ml/s para eliminar cualquier posible solución de lisado y tampón de unión restante. Se añade tampón de desulfonación a la cámara de extracción y se bombea sobre la membrana de extracción con un caudal como se describe para realizar la desulfonación alcalina del ADN convertido. A partir de esta realización particular, el experto en la materia entenderá que el sistema automático o cartucho de la invención también puede comprender un filtro. En una realización particular, el cartucho comprende así un filtro en el canal entre la cámara de lisis y la cámara de extracción, y una membrana de extracción en la cámara de extracción. Está claro que dicho filtro realiza una función de filtro cuando los fluidos pasan a través de dicho filtro. El filtro puede tener una configuración de filtro único o una configuración de filtro de tres pilas para muestras más difíciles.

Así, en otro aspecto, la presente descripción se refiere a un sistema automatizado para la detección de un estado de metilación de ácido nucleico en una fuente de ácido nucleico, el sistema automatizado adaptado para alojar a un cartucho que comprende una cámara de extracción que comprende una membrana de extracción, dicho sistema que controla los pasos de:

- agregar bisulfito a una fuente de un ácido nucleico introducido en el sistema automatizado y seguido inmediatamente por el calentamiento de la fuente del ácido nucleico a una temperatura entre 40°C y 60°C para producir un lisado que comprende el ácido nucleico y para desaminar una base de citosina no metilada presente en dicho ácido nucleico,

- unir el ácido nucleico a la membrana de extracción y eliminar el bisulfito bombeando la solución de lisado y tampón de unión sobre la membrana de extracción con un caudal menor o igual a 0,1 ml/s, o entre 0,001 ml/s y 0,1 ml/s, más preferiblemente entre 0,001 y 0,0017 ml/s,

- añadir tampón de desulfonación a la cámara de extracción y bombear el tampón de desulfonación sobre la membrana de extracción con un caudal menor o igual a 0,1 ml/s, entre 0,001 ml/s y 0,1 ml/s, más preferiblemente entre 0,001 y 0,0017 ml/s, para desulfonar la base desaminada en el primer paso en el ácido nucleico y convertir dicha base en una base de uracilo,

- eluir el ácido nucleico convertido de la membrana de extracción y

- analizar el ácido nucleico convertido.

La presente descripción también prevé un sistema para la detección automática de ADN metilado mediante conversión de bisulfito de ADN en una muestra, el sistema adaptado para alojar a un cartucho con al menos una cámara de extracción, con una membrana de extracción en la misma, el sistema que controla las etapas de:

- añadir bisulfito a una muestra introducida en el sistema automatizado y calentando la muestra directamente entre 40°C y 602C para producir un lisado que comprende ADN y realizar la conversión de bisulfito del ADN;

- añadir tampón de unión al lisado que comprende ADN para producir una solución de lisado y tampón de unión; - unir el ADN a la membrana de extracción y eliminar el bisulfito bombeando la solución de lisado y tampón de unión sobre la membrana de extracción con un caudal menor o igual a 0,1 ml/s, o entre 0,001 ml/s y 0,1 ml/s, más preferiblemente entre 0,001 y 0,0017 ml/s;

- añadir tampón de desulfonación a la cámara de extracción y bombear el tampón de desulfonación sobre la membrana de extracción con un caudal menor o igual a 0,1 ml/s, entre 0,001 ml/s y 0,1 ml/s, más preferiblemente entre 0,001 y 0,0017 ml/s , para realizar la desulfonación alcalina del ADN convertido;

- eluir el ADN convertido de la membrana de extracción; y

- analizar el ADN convertido.

El sistema automatizado contiene elementos para bombear fluidos de un lugar a otro. Los sistemas de bombeo del sistema se pueden ajustar para bombear líquidos sobre una membrana de extracción dentro del cartucho con una tasa de crecimiento específica según sea necesario. Los pasos de bombeo sobre una membrana de extracción se realizan mecánicamente según lo programado en el sistema automatizado y reemplazan la limpieza manual de la muestra (por ejemplo, los pasos de eliminación de bisulfito, desulfonación y lavado) procesando la muestra en columnas de centrifugación de baja elución y/o mediante centrífuga. Tal automatización permite un alto rendimiento de muestras en poco tiempo sin ninguna interacción humana durante las etapas del método de la invención.

En una realización de la descripción, los pasos de bombeo sobre una membrana de extracción se pueden realizar en 2 o más pasos de bombeo sobre la membrana de extracción, por ejemplo bombeando un volumen de tampón de desulfonación en 2 veces la mitad del volumen original del tampón de desulfonación sobre una membrana de extracción. De manera similar, el bombeo durante los pasos de lavado, p. ej. el bombeo de la muestra con el tampón de lavado sobre una membrana de extracción se puede realizar en más de 1 paso de bombeo. En una realización, el primer paso de lavado se realiza en 1 paso de bombeo y el último paso de lavado se realiza en 3 pasos de bombeo. En otro ejemplo, el primer paso de lavado se realiza en 3 bombas y el último paso de lavado se realiza en 7 bombas. En una realización preferida, la muestra utilizada en los métodos, cartuchos y sistemas de la invención es una muestra de tejido humano.

En una realización preferida de la descripción, el análisis de ADN/análisis de ácido nucleico en el sistema automatizado comprende amplificación de ADN/amplificación de ácido nucleico. Los métodos de amplificación particularmente preferidos de acuerdo con la invención son los métodos de PCR específicos de metilación (MSP) que son conocidos en la técnica, por ejemplo, una reacción de PCR en tiempo real (RT-PCR) usando un ensayo específico convertido con bisulfito. En una realización preferida, el método puede comprender además la etapa de detectar el ácido nucleico amplificado. Hay ensayos basados en sondas que aprovechan la hibridación de oligonucleótidos con secuencias específicas y la posterior detección del híbrido. También es posible secuenciar el ácido nucleico diana después de otras etapas conocidas por los expertos en la técnica. En una realización particularmente preferida de la invención, el ácido nucleico se detecta midiendo la intensidad de la luz de fluorescencia durante la amplificación, por ejemplo, con una señal específica para detectar el ADN convertido no metilado y una señal específica para detectar el ADN metilado. Este método implica el seguimiento de la fluorescencia en tiempo real.

Por lo general, se evalúa el estado de metilación de un panel de genes que comprende al menos uno de los genes junto con uno, dos, tres, cuatro o cinco genes adicionales, en el que un cambio en el estado de metilación en al menos uno de los genes del panel es indicativo de una predisposición hacia una enfermedad o de su incidencia, como el cáncer. La expresión "estado de metilación" se refiere a la presencia o ausencia de un residuo de citosina metilado en uno o más dinucleótidos CpG dentro del ácido nucleico o gen de interés. En muchos genes, las islas CpG se encuentran en la región promotora y pueden comenzar (solo) corriente arriba de un promotor y extenderse corriente abajo en la región transcrita. Cuando la distribución de CpG en la región promotora es bastante escasa, los niveles de metilación pueden evaluarse en las regiones de intrones y/o exones. La región para la evaluación puede ser una región que comprenda secuencias tanto de intrones como de exones y, por tanto, que se superponga a ambas regiones.

Preferiblemente, los métodos de acuerdo con la invención se usan en diagnósticos, para el cribado de tejidos o fluidos del cuerpo humano o incluso animal para detectar la presencia de ciertos patrones de metilación. La presencia o ausencia de bases de citosina metiladas en el ácido nucleico o en el ADN es indicativa de un trastorno de proliferación celular. Los métodos de acuerdo con la invención se utilizan para mejorar la velocidad y facilidad de uso (sin operaciones manuales) de la detección de sitios de metilación en ácidos nucleicos.

Alternativamente, los métodos de acuerdo con la invención se utilizan para detectar una predisposición o la incidencia de cáncer en una muestra, en donde la detección de un cambio en el estado del ADN metilado es indicativa de una predisposición o la incidencia del cáncer. El método descrito se puede usar para predecir la probabilidad de resistencia al tratamiento del cáncer con un inhibidor del cáncer o para seleccionar un régimen de tratamiento adecuado para el cáncer. O los métodos pueden usarse para predecir la probabilidad de resistencia o el tratamiento exitoso del cáncer con un inhibidor del cáncer, en donde la detección del cambio de metilación es indicativa de que la probabilidad de resistencia al tratamiento sea menor/mayor que si la modificación de metilación no fuera detectada. Un uso adicional puede implicar la selección de un régimen de tratamiento adecuado para el cáncer en el que la detección del cambio del estado de metilación da como resultado la selección de un inhibidor del cáncer y en el que si no se detecta el cambio de metilación, el inhibidor del cáncer no se selecciona para el tratamiento, o al revés.

Además de los sistemas automatizados ya ampliamente descritos de la presente descripción en una realización más preferida el sistema automatizado aplica un método para la detección de ADN metilado en una muestra de paciente en un sistema automatizado que contiene un cartucho que incluye una cámara de lisis, una cámara de extracción, con una membrana de extracción en su interior que comprende los pasos de:

- introducir una muestra del paciente en la cámara de lisis del sistema automatizado,

- añadir bisulfito a la muestra en la cámara de lisis e inmediatamente calentar durante 1 hora a una temperatura entre 40°C y 602C dentro de la cámara de lisis para producir un lisado que comprende ADN y realizar la conversión de bisulfito del ADN,

- agregar tampón de unión al lisado que comprende ADN para producir una solución de lisado y tampón de unión, - transportar la solución de lisado y tampón de unión desde la cámara de lisis a la cámara de extracción, cuya cámara de extracción contiene una membrana de extracción,

- unir el ADN del lisado a la membrana de extracción y eliminar el bisulfito bombeando el lisado y la solución de lisado y tampón de unión sobre la membrana de extracción con un caudal entre 0,001 ml/s y 0,1 ml/s, más preferiblemente entre 0,001 y 0,0017 ml/s, para eliminar el bisulfito, el tampón de unión y el lisado mientras se está extrayendo el ADN del lisado retenido sobre la membrana de extracción,

- bombear tampón de lavado que comprende etanol sobre la membrana de extracción con un caudal entre 0,001 ml/s y 0,1 ml/s para eliminar cualquier posible solución de lisado y tampón de unión restante,

- añadir tampón de desulfonación a la cámara de extracción y bombear el tampón de desulfonación sobre la membrana de extracción con un caudal de entre 0,001 ml/s y 0,1 ml/s, más preferiblemente entre 0,001 y 0,0017 ml/s para realizar la desulfonación alcalina del ADN convertido,

- agregar tampón de lavado que comprende etanol a la cámara de extracción y bombear el tampón de lavado sobre la membrana de extracción en al menos 3 pasos de bombeo, más preferiblemente 7 pasos de bombeo, con un caudal entre 0,001 ml/s y 0,1 ml/s para eliminar cualquier posible tampón de desulfonación restante,

- realizar la evaporación de etanol bombeando aire con un caudal de 0,1 ml/s sobre la membrana de extracción, - eluir el ADN convertido de la membrana de extracción bombeando un tampón de elución o agua con un caudal de entre 0,001 ml/s y 0,1 ml/s sobre la membrana de extracción, y

- analizar el ADN convertido en el sistema automatizado.

La temperatura de la cámara de lisis en un cartucho en el sistema automatizado se puede regular ajustando la temperatura de la pared de la cámara de lisis a una temperatura específica de elección. En una realización particular, la temperatura de la pared de la cámara de lisis se elevó a al menos 40°C calentando el peltier del sistema automatizado a 40°C. El peltier es un elemento que se utiliza para calentar (los líquidos dentro) en la cámara de lisis, que se encuentra en la superficie exterior de la cámara de lisis. El ajuste de la temperatura de la pared a 40°C significa que la temperatura de reacción real dentro de la cámara de lisis del cartucho es de al menos 40°C, o incluso alrededor de entre 50°C y 60°C dentro de la cámara de lisis. Entonces, en los métodos de la invención, la temperatura pasa directamente de la temperatura ambiente a una temperatura de reacción de al menos 40°C o igual a esta: cuando se agrega el reactivo de conversión (bisulfito) a la muestra del paciente en la cámara de lisis, la temperatura de reacción se eleva inmediatamente a al menos 40°C o incluso alrededor de 50 a 60°C en la cámara de lisis durante 1 hora para producir un lisado y desaminar la base de citosina en el ácido nucleico en dicha muestra de paciente (para realizar la conversión de bisulfito del ADN en dicha muestra de paciente). En el protocolo del kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning™ se indica que el reactivo de conversión de bisulfito se agrega a la muestra de ADN y luego la temperatura se eleva a 98°C durante 8 minutos, y en el siguiente paso a 54°C durante 60 minutos. Así que en el sistema automatizado se ha eliminado este primer paso, a saber, el calentamiento a 982C. Alternativamente, el reactivo de conversión (bisulfito) ya está presente en la cámara de lisis al insertar la muestra. Entonces, cuando la muestra del paciente se agrega a la cámara de lisis, que contiene reactivos de conversión precargados (bisulfito), la temperatura de reacción se eleva inmediatamente a al menos 40°C o incluso a alrededor de 50 a 60°C en la cámara de lisis durante 1 hora para producir un lisado y desaminar la base de citosina en el ácido nucleico en dicha muestra de paciente (para realizar la conversión de bisulfito del ADN en dicha muestra de paciente). El experto en la técnica entenderá que se pueden realizar varias etapas de la invención en otro orden, por ejemplo, el tampón de unión se puede añadir al ácido nucleico después, simultáneamente o antes de añadir el reactivo bisulfito al ácido nucleico.

El volumen requerido del reactivo de conversión depende del volumen de la cámara de lisis. En una realización particular, se utiliza un volumen de 700 pl del reactivo de conversión (por ejemplo, reactivo bisulfito) en la cámara de lisis para asegurarse de que el bombeo de los fluidos en el sistema automatizado funciona correctamente. En el kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning™ que está actualmente disponible en el mercado, se utiliza un volumen de 130 pl del reactivo de conversión para 20 pl de una muestra de ADN. Por lo tanto, de acuerdo con una realización específica de la presente invención, el volumen del reactivo de conversión, en comparación con el kit, aumenta a 700 pl para rellenar la cámara de lisis en el sistema automatizado lo suficiente como para permitir el funcionamiento adecuado de los sistemas de bombeo en el cartucho. Alternativamente, se pueden agregar otras cantidades (mayores) de volúmenes del reactivo de conversión a la muestra en la cámara de lisis según sea necesario (dependiendo de la muestra utilizada), por ejemplo, se pueden añadir 700 pl, 800 pl, 900 pl, 1 ml, 1100 pl, 1200 pl, 1300 pl, 1400 pl, 1500 pl, 1600 pl, 1700 pl, 1800 pl, 1900 pl, 2 ml, 2100 pl, 2200 pl, 2300 pl, 2400 pl, 2500 pl, 2600 pl, 2700 pl, 2800 pl, 2900 pl o 3 ml de reactivos de bisulfito a la muestra introducida en el sistema automatizado para realizar la conversión de bisulfito del ácido nucleico/ADN de acuerdo con los métodos de la presente invención.

En otra realización, la presente descripción está dirigida a un kit para realizar una reacción de bisulfito en un sistema automatizado que comprende:

- un cartucho según la invención para su uso en un sistema automatizado, que comprende bisulfito, tampón de unión y tampón de desulfonación, e

- instrucciones de uso.

En otra realización más, la presente descripción proporciona un kit para realizar una reacción de bisulfito en un sistema automatizado que comprende:

- un cartucho de acuerdo con la invención para su uso en un sistema automatizado que comprende una cámara de extracción que comprende una membrana de extracción, bisulfito, tampón de unión y tampón de desulfonación, e - instrucciones de uso.

Preferiblemente, los métodos, cartuchos y kits de acuerdo con la invención se usan en diagnósticos, por ejemplo, para el cribado de tejidos o fluidos del cuerpo humano o incluso animal para detectar la presencia de ciertos patrones de metilación, p. ej. para predecir el riesgo de desarrollo de un trastorno proliferativo celular. Los métodos, los sistemas de detección, los cartuchos y los kits de la invención, y los usos de los mismos, se pueden poner en práctica para el cribado, la detección temprana, la progresión de la enfermedad y la predicción del resultado de la respuesta a la terapia contra el cáncer.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ayudar a la comprensión de la presente invención, el verdadero alcance de la cual se establece en las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos

Ejemplo 1. Realización de la conversión de bisulfito de muestras de ADN enriquecidas en un cartucho Idylla™ utilizando el sistema Idylla™

Los diferentes recipientes de un cartucho Idylla™ abierto (incluida una membrana de extracción) se rellenaron con los tampones del EZ DNA Methylation Lightning Kit de ZymoResearch (Cat. N.° D5031). El recipiente 1 del cartucho contenía 2 ml del reactivo de conversión de rayos. El recipiente 2 contenía 2,5 ml de tampón de unión a M. En los recipientes 3 y 4 se añadieron 2 ml de tampón de lavado M. Antes de usar el tampón de lavado de ZymoResearch, se confirmó que se estaban añadiendo 24 ml de etanol al 100% a los 6 ml de tampón de lavado concentrado. El recipiente 5 del cartucho contenía 1,5 ml de tampón de L-desulfonación y el recipiente 6 contenía 1,5 ml de tampón de elución, que en este caso es agua ultrapura. 5 pl del ADN no metilado (proporcionado por ZymoResearch Cat. N.° D5014-1) y ADN metilado (proporcionado por Millipore Cat. N.° S7821) se añadieron en la cámara de lisis del cartucho Idylla™. Al realizar el protocolo de conversión de bisulfito en el sistema Idylla™, se bombearon 700 pl del reactivo de conversión a la cámara de lisis. En la cámara de lisis, la temperatura se elevó a al menos 40°C calentando el peltier. El ajuste de la temperatura de la pared a 40°C significa que la temperatura real dentro de la cámara de lisis del cartucho era alrededor de 50°C. El ADN y los reactivos de conversión se incubaron en la cámara de lisis a 40°C (temperatura de la pared) durante 1 hora. Después de la incubación, se bombearon 2 ml del tampón de unión a M (recipiente 2) a la cámara de lisis. Todo el contenido de la cámara de lisis se bombeó sobre la membrana de extracción con un caudal de 0,1 ml/s. Luego se realizó el primer paso de lavado, bombeando 3 veces 0,2 ml de tampón de lavado M fuera del recipiente 3 sobre la membrana de extracción con una temperatura de 40°C. Después de la etapa de lavado tuvo lugar la etapa de L-desulfonación, bombeando 0,9 ml (2 veces 0,45 ml) de tampón de L-desulfonación con un caudal de 0,0017 ml/s sobre la membrana de extracción con una temperatura de 20°C. Este paso de L-desulfonación duró alrededor de 9 minutos. El último paso de lavado se realizó bombeando 7 veces 0,3 ml de tampón de lavado (2,1 ml en total) del recipiente 4 sobre la membrana de extracción con un caudal de 0,1 ml/s. Después de esta última etapa de lavado, se realizó la evaporación del etanol bombeando 20 ml de aire (usando la entrada de aire) con un caudal de 0,1 ml/s sobre la membrana (la temperatura de la membrana es 110°C). La elución del ADN a la cámara de mezcla se realizó añadiendo 0,25 ml de tampón de elución (recipiente 6) sobre la membrana con un caudal de 0,1 ml/s.

Ejemplo 2. Verificación de la conversión de bisulfito mediante PCR en tiempo real (RT-PCR) y secuenciación

Se analizaron 5 gl de las eluciones obtenidas en una reacción de RT-PCR de 25 gl utilizando un ensayo específico convertido con bisulfito proporcionado por Qiagen (el ensayo EpitectMethyLight: Hs_ONECUT2.) y según las instrucciones del fabricante. La Figura 1 indica los resultados de la PCR en tiempo real para el ADN convertido metilado y no metilado. El ADN convertido no metilado muestra una amplificación por PCR con una seña1HEX en Biorad (sonda VIC en el kit de Qiagen para detectar ADN convertido con bisulfito no metilado). El ADN convertido metilado muestra una buena amplificación por PCR con una señal FAM en Biorad (sonda FAM, en el kit de Qiagen para detectar ADN convertido con bisulfito metilado). Si no hubiera habido conversión en el cartucho Idylla™, no se habría conseguido ningún resultado de PCR, debido al hecho de que el ensayo Qiagen es un ensayo específico para ADN convertido con bisulfito. Los cebadores y la sonda no se unirían al ADN no convertido.

También se secuenciaron los amplicones proporcionados después de la RT-PCR para investigar la conversión de las citosinas no metiladas en comparación con las citosinas metiladas. Como se muestra en la Figura 2, todas las citosinas no metiladas del ADN no metilado se convirtieron en timinas y se detectaron en la secuencia del amplicón como una adenina.

Ejemplo 3. Realización de la conversión de bisulfito de una muestra de tejido FFPE en un cartucho Idylla™ utilizando el sistema Idylla™

Los diferentes recipientes de un cartucho Idylla™ (incluida una membrana de extracción) se rellenan con los tampones del EZ DNA Methylation Lightning Kit de ZymoResearch (Cat. N.° D5031). El recipiente 1 del cartucho contiene 3 ml del reactivo de conversión de rayos. El recipiente 2 contiene 2,5 ml de tampón de unión a M. Los recipientes 3 y 4 contienen cada uno 2 ml de tampón de lavado M. Antes de utilizar el tampón de lavado de ZymoResearch, se confirmó que se habían añadido 24 ml de etanol al 100% a los 6 ml de tampón de lavado concentrado. El recipiente 5 del cartucho contiene 1,5 ml de tampón de L-desulfonación y el recipiente 6 contiene 1,5 ml de tampón de elución, que en este caso es agua ultrapura. Una muestra de cáncer de tejido embebido en parafina fijada con formalina (que comprende células cancerosas humanas) de un paciente que tiene cáncer colorrectal se inserta a través de la abertura de introducción en la cámara de lisis de un cartucho Idylla™. La primera licuefacción de la muestra de FFPE se realiza con un tampón patentado de Biocartis en la cámara de lisis (preparación de la muestra). Para realizar el protocolo de conversión de bisulfito en el sistema Idylla™, se bombean 3 ml del reactivo de conversión a la cámara de lisis. La temperatura de reacción dentro de la cámara de lisis se eleva a una temperatura entre 50°C y 55°C calentando el peltier, y el ADN (de la muestra FFPE) y el reactivo de conversión se incuban en la cámara de lisis durante 1 hora. Después de la incubación, se bombean 2 ml del tampón de unión a M (recipiente 2) a la cámara de lisis. Todo el contenido de la cámara de lisis se bombea sobre la membrana de extracción con un caudal de 0,0017 ml/s. Luego se realiza el primer paso de lavado, bombeando 3 veces 0,2 ml de tampón de lavado M fuera del recipiente 3 sobre la membrana de extracción a una temperatura de 40°C. Después de la etapa de lavado tiene lugar la etapa de L-desulfonación, bombeando 0,9 ml (2 veces 0,45 ml) de tampón de L-desulfonación con un caudal de 0,0017 ml/s sobre la membrana de extracción a una temperatura de 20°C. Este paso de L - desulfonación dura alrededor de 9 minutos. El último paso de lavado se realiza bombeando 7 veces 0,3 ml de tampón de lavado (un total de 2,1 ml) del recipiente 4 sobre la membrana de extracción con un caudal de 0,1 ml/s. Después de este último paso de lavado, la evaporación del etanol se realiza bombeando 20 ml de aire (utilizando la entrada de aire) con un caudal de 0,1 ml/s sobre la membrana (la temperatura de la membrana es 110°C). La elución del ADN a la cámara de mezcla se realiza añadiendo 0,25 ml de tampón de elución (recipiente 6) sobre la membrana con un caudal de 0,1 ml/s.

Otras realizaciones de la invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la consideración de la memoria descriptiva y la práctica de la invención descrita en este documento. Se pretende que la memoria descriptiva y los ejemplos se consideren únicamente a modo de ejemplo, indicando el verdadero alcance y espíritu de la invención mediante las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para la detección de un estado de metilación de ácido nucleico en un sistema automatizado que comprende una cámara de extracción que comprende una membrana de extracción, comprendiendo dicho método las etapas de:

- introducir una fuente del ácido nucleico en el sistema automatizado, añadir bisulfito al mismo e inmediatamente seguido de calentar la fuente del ácido nucleico para producir un lisado que comprenda el ácido nucleico y desaminar una base de citosina no metilada presente en dicho ácido nucleico;

- añadir tampón de desulfonación a la cámara de extracción y transportar el tampón de desulfonación sobre la membrana de extracción para desulfonar la base desaminada en una etapa previa en el ácido nucleico y convertir dicha base en una base de uracilo,

- eluir el ácido nucleico convertido de la membrana de extracción; y

analizar el ácido nucleico convertido.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el calentamiento se realiza a una temperatura de entre 40°C y 802C.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, en el que el transporte se realiza mediante bombeo, preferentemente bombeo controlado.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el análisis del ácido nucleico convertido se realiza en dicho sistema automatizado.

5. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo dicho método las etapas de: a) introducir una fuente del ácido nucleico en el sistema automatizado, añadir bisulfito al mismo e inmediatamente seguido de calentar la fuente del ácido nucleico a una temperatura de entre 40°C y 80°C para producir un lisado que comprenda el ácido nucleico y para desaminar una base de citosina no metilada presente en dicho ácido nucleico; b) añadir tampón de unión al lisado para producir una solución de lisado y tampón de unión;

c) unir el ácido nucleico a la membrana de extracción y eliminar el bisulfito mediante bombeo controlado de la solución de lisado y tampón de unión sobre la membrana de extracción;

d) añadir tampón de desulfonación a la cámara de extracción y bombeo controlado del tampón de desulfonación sobre la membrana de extracción para desulfonar la base desaminada en la etapa a) en el ácido nucleico y convertir dicha base en una base de uracilo,

e) eluir el ácido nucleico convertido de la membrana de extracción; y analizar el ácido nucleico convertido en el sistema automatizado.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el calentamiento inmediato de la fuente del ácido nucleico es a una temperatura de entre 40°C y 60°C, y/o el bombeo controlado se realiza con un caudal más lento que o igual a 0,1 ml/s.

7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el caudal de la etapa c) y el caudal de la etapa d) está comprendido entre 0,001 ml/s y 0,1 ml/s.

8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el caudal en la etapa d) es más lento que el caudal en la etapa c).

9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la membrana de extracción es una membrana de sílice, o una membrana compuesta que comprende 2 o 3 capas de membrana de sílice.

10. Uso de un cartucho para la detección de un estado de metilación de ácido nucleico según el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Uso de un cartucho según la reivindicación 10, comprendiendo dicho cartucho una cámara de extracción que comprende una membrana de extracción.

12. Uso de un cartucho según la reivindicación 10 u 11, caracterizado por que el cartucho comprende una cámara de lisis en donde se realizan las etapas a) a b) del método según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, y una cámara de extracción en donde se realizan las etapas c) a e) del método según las reivindicaciones 5 a 9, en el que existe un canal entre la cámara de lisis y la cámara de extracción para transportar fluidos desde la cámara de lisis a la cámara de extracción.

13. Uso de un sistema automatizado para la detección de un estado de metilación de ácido nucleico en una fuente de un ácido nucleico, el sistema automatizado adaptado para alojar a un cartucho según se define en cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, controlando el sistema las etapas de:

a) añadir bisulfito a una fuente de un ácido nucleico introducido en el sistema e inmediatamente seguido de calentar la fuente del ácido nucleico hasta una temperatura de entre 40°C y 802C para producir un lisado que comprenda el ácido nucleico y desaminar una base de citosina no metilada en dicho ácido nucleico,

b) añadir tampón de unión al lisado que comprende ácido nucleico para producir una solución de lisado y tampón de unión,

c) unir el ácido nucleico a la membrana de extracción y eliminar el bisulfito mediante bombeo controlado de la solución de lisado y tampón de unión sobre la membrana de extracción,

d) añadir tampón de desulfonación a la cámara de extracción y bombeo controlado del tampón de desulfonación sobre la membrana de extracción para desulfonar la base desaminada en la etapa a) en el ácido nucleico y para convertir dicha base en una base de uracilo,

e) eluir el ácido nucleico convertido de la membrana de extracción, y

f) analizar el ácido nucleico convertido.

14. Un kit para realizar una reacción de bisulfito en un sistema automatizado que comprende:

a. un cartucho según se define en cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 para su uso en un sistema automatizado, comprendiendo el cartucho una cámara de lisis, una cámara de extracción que comprende una membrana de extracción, bisulfito, tampón de unión y tampón de desulfonación, en donde se almacenan el bisulfito y el tampón de unión en recipientes y los recipientes están en conexión con la cámara de lisis a través de un canal fluídico, en donde existe un canal entre la cámara de lisis y la cámara de extracción para transportar fluidos desde la cámara de lisis a la cámara de extracción, y en donde el tampón de desulfonación se almacena en un recipiente de reactivos, y el recipiente de reactivos está en conexión con la cámara de extracción, y

b. instrucciones de uso.

15. Un cartucho configurado para la detección de un estado de metilación de ácido nucleico según el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, comprendiendo dicho cartucho una cámara de lisis, una cámara de extracción que comprende una membrana de extracción, bisulfito, tampón de unión y tampón de desulfonación, en donde el bisulfito y el tampón de unión se almacenan en recipientes y los recipientes están en conexión con la cámara de lisis a través de un canal fluídico, en donde existe un canal entre la cámara de lisis y la cámara de extracción para transportar fluidos desde la cámara de lisis a la cámara de extracción, y en donde el tampón de desulfonación se almacena en un recipiente de reactivos, y el recipiente de reactivos está en conexión con la cámara de extracción.

16. Un kit para realizar una reacción de bisulfito en un sistema automatizado que comprende:

a. un cartucho según se define en la reivindicación 15 para su uso en un sistema automatizado, y

b. instrucciones de uso.