CN107488721B - 消除pcr产物污染的甲基化扩增方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及消除PCR产物污染的甲基化扩增方法及其应用。本发明通过在PCR反应前进行分体系、分步热处理，有效应用尿嘧啶‑DNA‑糖基化酶，有效地解决了甲基化扩增PCR产物的污染问题。

Description

消除PCR产物污染的甲基化扩增方法及其应用

技术领域

本发明属于基因检测领域，更具体地，本发明涉及一种可有效消除PCR产物污染的甲基化扩增方法及其应用。

背景技术

DNA甲基化是基因表观修饰方式之一，可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。哺乳动物中，DNA的甲基化仅发生于CpG的胞嘧啶上，在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸中的胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶(^mC)。这种DNA修饰方式并没有改变基因序列，但是它可以调控基因的表达。DNA甲基化是研究最为深入的表观遗传学机制，其在维持正常细胞功能、染色质结构修饰、X染色体失活、基因组印迹、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用。

哺乳动物基因组中的CpG序列出现的频率仅有1％左右，远低于基因组中的其它双核苷酸序列。但在某些区域中，CpG序列密度很高，可以达均值的5倍以上，成为胞嘧啶和鸟嘌呤的富集区，形成所谓的CpG岛。CpG岛通常位于基因的启动子区或是第一个外显子区。健康人基因组中，CpG岛中的CpG位点通常是处于非甲基化状态。当肿瘤发生时，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，以至于染色体螺旋程度增加及抑癌基因表达的丢失。

重亚硫酸盐转化法是目前应用最为广泛的CpG甲基化检测方法。该方法采用Na₂S₂O₅处理样本DNA，将没有发生甲基化的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，而发生甲基化的胞嘧啶(^mC)保持不变；经过PCR扩增后，U转变为T，而^mC转变为C，从而将基因组上的甲基化和非甲基化的差异转变成为C/T碱基的多态性，通过检测目标位点上的C/T碱基状态，就可以确定是否存在基因的甲基化。

基于重亚硫酸盐转化的甲基化检测方法多种多样，比如BSP克隆测序、甲基化特异性PCR(MSP)、焦磷酸测序(Pyrosequencing)等。它们都需要先通过特异性的引物对目标基因进行PCR扩增后，再进行后续的分析检测。由于PCR技术的高度敏感性，使得PCR反应特别容易受到污染，极其微量的污染即可能造成假阳性结果。造成PCR污染的DNA可能有两种来源：(1)测试样品之间的DNA污染，(2)PCR扩增产物的污染。由于PCR扩增产物中包含极高浓度的目标基因片段，检测实验室中一旦发生PCR产物污染，将会严重干扰后续的PCR扩增结果，且难以彻底消除。为了预防和消除PCR产物的污染，人们在PCR体系中添加尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UDG)。

UDG酶的作用原理：在PCR反应体系中，用dUTP代替dTTP，使扩增产物链中掺入大量的U碱基。在再次进行PCR扩增前，用UDG酶处理PCR反应液。因为UDG酶可以裂解PCR扩增产物中尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，从而消除PCR产物污染对后续扩增的影响。

但是，在检测基因甲基化的PCR体系中，UDG酶的使用就遇到了困难。这是因为DNA经过重亚硫酸盐转化后，没有发生甲基化的胞嘧啶(C)转变成为尿嘧啶(U)，所以重亚硫酸盐转化产物可以被UDG酶降解。如果在PCR体系中添加UDG酶，将无法扩增出目标基因片段。在重亚硫酸盐转化过程中，胞嘧啶(C)先变成为6-磺酰-尿嘧啶，然后经过NaOH脱硫处理，最后变成尿嘧啶(U)。包含6-磺酰-尿嘧啶的转化中间产物，不能被UDG酶降解，也不能被TaqDNA聚合酶扩增。

因此，重亚硫酸盐转化产物中包含的尿嘧啶，使得在甲基化扩增体系中UDG酶无法被应用，目前本领域中难以解决甲基化扩增PCR产物的污染问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可消除PCR产物污染的甲基化扩增方法及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种消除PCR产物污染的甲基化扩增方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提供PCR反应管，在该反应管中含有碱性溶液，以热熔材料将碱性溶液密封于管底；该热熔材料的熔点为50～65℃；

(2)在(1)的PCR反应管中加入PCR反应液和尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UDG)；该PCR反应液中，模板为-经过重亚硫酸盐转化但未经过脱硫处理的DNA；

(3)将(2)的PCR反应管依次进行：低温温育、高温温育和PCR扩增，获得PCR扩增产物；其中，低温温育为适宜尿嘧啶-DNA-糖基化酶作用但不导致热熔材料熔化的温度，高温温育为使尿嘧啶-DNA-糖基化酶灭活、热熔材料熔化、以及模板DNA发生脱硫反应的温度。

在一个优选例中，步骤(1)中，所述的热熔材料是疏水材料(不与PCR反应液、碱性溶液互溶)，其熔点为52～60℃；更佳地，所述的热熔材料为熔点54～56℃的石蜡。

在另一优选例中，步骤(1)中，所述的碱性溶液是pH值为12.5～13.3的溶液；较佳地，所述的碱性溶液包括(但不限于)：氢氧化钠，氢氧化钾。

在另一优选例中，所述的碱性溶液的浓度为50～100mmol/L；较佳地，所述的碱性溶液的体积不超过PCR反应液体积的50％。

在另一优选例中，步骤(2)中，所述的PCR反应液包括：dNTPs，DNA聚合酶，与所述模板对应的引物和/或探针。

在另一优选例中，所述的dNTPs为dATP、dCTP、dGTP、和dUTP的混合物。

在另一优选例中，所述的经过重亚硫酸盐转化但未经过脱硫处理DNA模板上的尿嘧啶保留6-磺酰修饰基团。

在另一优选例中，所述的方法为非诊断性的方法。

在另一优选例中，步骤(2)中，所述的PCR反应液的pH值不高于8.0(室温)；较佳地，pH值为7.2～7.8(室温)；更佳地，pH值为7.4～7.6(室温)。

在另一优选例中，步骤(3)中，所述的低温温育的温度不超过50℃，较佳地为35-42℃；较佳地，低温温育5～15分钟。

在另一优选例中，步骤(3)中，所述的高温温育的温度不低于90℃，较佳地为90-98℃；较佳地，高温温育5～15分钟。

在另一优选例中，步骤(3)中，PCR扩增阶段中，退火温度不低于所述热熔材料的熔点。

在另一优选例中，步骤(3)中，步骤(3)中，经高温温育后，热熔材料熔化，碱性溶液和PCR反应液混合，混合体系的pH值为9.0-9.5(室温)，模板DNA上的6-磺酰-尿嘧啶发生脱硫反应。

在本发明的另一方面，提供一种用于基因甲基化扩增的PCR反应管，所述的PCR反应管中含有碱性溶液，以热熔材料将碱性溶液密封于管底；该热熔材料的熔点为50～65℃；较佳地，所述的PCR反应管适用于使用UDG酶消除PCR产物污染的甲基化扩增体系。

在本发明的另一方面，提供一种用于检测基因甲基化的试剂盒，所述的试剂盒使用UDG酶消除可能存在的PCR产物污染，其中包括：所述的用于基因甲基化扩增的PCR反应管和PCR反应液；较佳地其中还含有尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UDG)，经过重亚硫酸盐转化但未经过脱硫处理的DNA模板；更佳地其中还含有对应于所述模板的引物和/或探针、dNTP、DNA聚合酶。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、本发明甲基化扩增技术方案示意图。

①PCR反应管；

②热熔材料隔离层；

③下层碱性溶液；

④上层PCR反应液；

⑤熔化后的热熔材料层；

⑥混合后的扩增反应液。

图2、三种PCR反应体系对脱硫和不脱硫样本的扩增曲线。

A：常规PCR体系；

B：本发明PCR体系(不加UDG酶)；

C：本发明完整PCR体系。

①脱硫样本；

②不脱硫样本。

图3、本发明PCR反应体系消除PCR污染物的效果分析。

A：本发明PCR体系(不加UDG酶)；

B：本发明PCR体系。

①样本S1；

②样本S2；

③样本S3；

④样本S4。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，通过在PCR反应前进行分体系、分步热处理，有效应用尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UDG)，提供了一种可有效消除PCR产物污染的甲基化扩增方法。

如本文所用，“样本”或“样品”需进行DNA甲基化状态检测的核酸物质，其可以来自于个体(如人或动物)，也可以是其它来源的，例如一些经扩增或未经扩增的实验室核酸材料，或人工合成的测试品。应理解，对“样本”或“样品”的检测并非仅涉及诊断目的，还可涉及其它非诊断目的。

本发明基于重亚硫酸盐转化的甲基化检测方法，DNA样本经过Na₂S₂O₅处理后，未发生甲基化的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，而发生甲基化的胞嘧啶(^mC)保持不变，经过PCR扩增后，U转变为T，而^mC转变为C，从而将甲基化和非甲基化的差异转变为C/T碱基的多态性，通过检测目标位点的C/T碱基状态，可以明确样本DNA是否发生了甲基化。

本发明的技术方案如图1所示：甲基化扩增反应在预先包埋碱性溶液的PCR反应管中进行，其下层是碱性溶液，中间是由热熔材料组成的隔离层，上层是PCR反应液。PCR反应液中包含用于扩增目标基因片段的引物和/或探针、dNTP(含dUTP)、Taq DNA聚合酶、尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UDG)，和经过重亚硫酸盐转化但未经过脱硫处理的DNA等组分。因为没有经过脱硫处理，所以重亚硫酸盐转化产物中的尿嘧啶碱基保留了6-磺酰修饰基团。首先反应管经过低温温育阶段，UDG酶可以降解反应体系中的PCR污染物；在此过程中，样本DNA模板上的尿嘧啶因为6-磺酰基团的保护作用而不被降解。然后反应管经过高温温育阶段，UDG酶被迅速灭活；同时，反应管中的热熔材料熔化，并与PCR反应液不互溶；下层碱性溶液和上层PCR反应液自动混合，使整个PCR反应体系的pH值升高。在相对较高的pH条件和高温的共同作用下，样本DNA模板上的6-磺酰-尿嘧啶发生脱硫反应，转变成尿嘧啶。最后运行PCR扩增程序，对甲基化目标基因片段进行特异性扩增。

一般情况下，用于PCR扩增的重亚硫酸盐转化产物都需要经过脱硫处理，因为只有脱硫后的DNA才能被Taq DNA聚合酶所识别，才能作为PCR扩增的有效模板。而脱硫后产生的尿嘧啶又可以被UDG酶降解，这就限制了UDG酶在甲基化检测体系中的应用。本发明充分利用了UDG酶不能降解6-磺酰-尿嘧啶的特性，通过热熔材料和温育条件的巧妙结合，配合pH值的合理设计，在一个封闭的反应管中依次完成UDG酶消化→6-磺酰-尿嘧啶脱硫→甲基化PCR扩增的过程，可以有效消除扩增体系中存在的PCR产物污染。

本发明中，所述的热熔材料是疏水材料，其不与PCR反应液、碱性溶液互溶。较佳地，所述的热熔材料的熔点为52～60℃。较佳地，所述的热熔材料为熔点54～56℃的石蜡。应理解，本发明所述的热熔材料不限于举例的材料，其它的多种熔点合适的疏水材料也适合于被应用于本发明的方法中。

作为本发明的优选方式，所述的碱性溶液是pH值为12.5～13.3的溶液；较佳地，所述的碱性溶液包括但不限于：氢氧化钠，氢氧化钾等。较佳地，所述的碱性溶液的浓度为50～100mmol/L；较佳地，所述的碱性溶液的体积不超过PCR反应液体积的50％。

在常规的PCR反应中，一般采用pH8.3(室温)的Tris-HCl缓冲体系。由于Tris-HCl缓冲液随温度的升高pH值会逐渐降低，在PCR反应延伸阶段(通常是72℃)，反应体系的pH值会下降至7.2附近(参考《分子克隆实验指南》)。

而本发明中，上层PCR反应液并不是最终的PCR扩增体系，而只是用于UDG酶降解PCR污染物，所以上层反应液的pH值要求不高于8.0(室温)，较佳地pH范围为7.4-7.6(室温)。在低温温育阶段(通常是35-42℃)，上层反应液的pH值会下降约0.3个单位，使反应体系的pH值在7.1-7.3附近。在此pH条件下，重亚硫酸盐转化产物上的6-磺酰-尿嘧啶能够保持稳定，不会发生脱硫反应，所以不会被UDG酶降解。如果反应体系中存在PCR产物污染，UDG酶可以将污染物完全消除，从而保证反应体系中的DNA模板全部来源于待测样本，使检测结果准确可靠。

本发明中，上层PCR反应液和下层碱性溶液通过热熔材料隔离，UDG酶消化步骤完成后，通过高温温育(不低于90℃)将UDG酶完全灭活，同时使热熔材料熔化，上下层溶液自动混合，混合后反应体系的pH值升高。在最终形成的反应体系中，pH值约为9.0-9.5(室温)，显著高于常规PCR扩增体系的pH值(通常在8.0-8.5)。由于Tris缓冲液随温度的升高pH值逐渐降低，所以在高温温育阶段，反应体系的实际pH值在7.8-8.2附近。在偏碱性条件和高温温育的协同作用下，DNA模板上的6-磺酰-尿嘧啶可以在10分钟内完成脱硫反应，转变成为可以被Taq DNA聚合酶所识别的尿嘧啶。因为常规PCR反应的起始阶段，都会设定5-10分钟的DNA预变性步骤，本发明将6-磺酰-尿嘧啶的脱硫步骤和DNA预变性步骤结合在一起，在不增加反应时间的情况下，同步完成脱硫和预变性步骤。

尽管在最终形成的PCR扩增体系中，pH值提高到了9.0-9.5(室温)，但是并不会影响Taq DNA聚合酶活性。因为后续PCR扩增的退火和延伸温度通常设定在60-72℃，此时反应体系中的实际pH值约为8.2-8.6，Taq DNA聚合酶可以有效发挥作用，对目标基因片段进行特异性扩增。

本发明通过合理的设计，通过下层碱性溶液和上层PCR反应液的自动混合来调节反应体系的pH值。作为本发明的优选方式，本发明人将上层PCR反应液中缓冲液的浓度提高到30～50mmol/L，从而有效地避免了上下层溶液混合时pH值的剧烈变化，缓冲液浓度的提高不影响Taq DNA聚合酶对目标基因的扩增。较佳地，所述的缓冲液为Tris-HCl缓冲液。

所述PCR扩增步骤中，退火温度不低于热熔材料的熔点，保证整个PCR扩增过程中，热熔材料始终呈液态。

依照本发明的甲基化扩增反应体系，特别适用于需要对扩增片段进行电泳、测序等后续分析的甲基化检测方法。因为PCR扩增产物包含极高浓度的目标基因片段(通常可达到10¹¹～10¹²拷贝/微升)，后续操作容易产生PCR产物污染。即使是在不需要开盖的荧光PCR检测体系中，也可能因为反应管破裂等原因造成扩增产物的泄漏。所以本发明适用于所有基于重亚硫酸盐转化的甲基化扩增方法。

在获得了本发明的方法后，很显然，本领域人员可以将之应用于任何藉由重亚硫酸盐转化的甲基化检测方法中。所述方法包括但不限于：甲基化特异性PCR(MSP)、克隆测序分析(BSP)、焦磷酸测序分析(Pyrosequencing)、荧光PCR检测等多种甲基化检测方法。

在获得了本发明后，为了便于使用和商品化，可以预制成专用于甲基化扩增的PCR反应管，其特征在于反应管中预先采用热熔材料(如石蜡)包埋特定浓度和体积的碱性溶液。使用者只需将一定体积包含UDG酶的PCR反应液加入反应管中，运行相关程序，即可在一个封闭的反应管中，完成UDG酶消化和甲基化扩增的整个过程。

本发明还包括了包含本发明的甲基化检测试剂盒。所述的试剂盒中还可包含其它配合甲基化检测的试剂。例如当该试剂盒是一种荧光PCR试剂盒时，其中还可包括特异性扩增待测基因的特定甲基化区域的引物对，荧光探针、以及PCR缓冲液、质控品等试剂。较佳地，所述的试剂盒中还可包括说明使用方法的使用说明书，以用于指导本领域技术人员正确地使用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、MGMT基因的甲基化扩增实例

本实施例中，以本发明方法检测O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)基因的甲基化。MGMT基因位于第10号染色体10q26位置，其功能是将O⁶-鸟嘌呤加合物从DNA上移除，对损伤的DNA进行修复。当MGMT基因启动子区的CpG位点发生甲基化时，MGMT转录停止，鸟嘌呤-O⁶上的甲基基团转移失败，导致不能有效修复DNA烷化损伤，与肿瘤发生密切相关。研究结果表明：MGMT启动子甲基化与一线化疗药物替莫唑胺的临床效果密切相关。一般认为，MGMT甲基化的肿瘤细胞对烷化剂类药物有效；而MGMT基因非甲基化则意味着对烷化剂耐药。MGMT基因的甲基化水平可作为胶质瘤患者化疗敏感及预后好的预测指标。

1、MGMT甲基化荧光PCR扩增体系

依据通用引物设计原则，设计一对PCR引物和一条荧光探针，分别为：

正向引物：5’-GTTTYGGATATGTTGGGATAG-3’(SEQ ID NO:1)；

反向引物：5’-CRACCCAAACACTCACCAAAT-3’(SEQ ID NO:2)；和

荧光探针：5’-CGCGAAAACCTACGAACGTCGA-3’(SEQ ID NO:3)，该探针带有FAM荧光标记，可以和甲基化扩增产物特异性结合。

采用荧光PCR法检测样本中MGMT基因的甲基化状态，共配制三种荧光PCR体系，具体情况如下：

A.常规PCR体系

30μL PCR反应体系中包含：30mM Tris-HCl(pH8.3，室温)、50mM KCl、4mM MgCl₂、200μM dNTP(含dATP、dCTP、dGTP和dUTP)，0.4μM PCR引物、0.2μM荧光探针、1.25U Taq DNA聚合酶和10ng模板DNA。

B.本发明PCR体系(不加UDG酶)

上层PCR反应体系共20μL，其中包括：45mM Tris-HCl(pH7.5，室温)、75mM KCl、6mMMgCl₂、300μM dNTP(含dATP、dCTP、dGTP和dUTP)，0.6μM PCR引物、0.3μM荧光探针、1.25UTaq DNA聚合酶和10ng模板DNA。

下层碱性溶液为75mM NaOH，体积为10μL。

中间隔离层为熔点在54-56℃的高纯度石蜡，体积为20μL。

隔离层熔化后，上下层溶液自动混合，形成pH值约为9.2(室温)的PCR扩增体系，总体积30μL，其它各组份的终浓度与常规PCR体系完全一致。

C.本发明完整PCR体系

在上述B项的PCR反应液中，添加1个单位的UDG酶，形成本发明完整的甲基化扩增体系。

2、扩增样本

使用来源于结直肠癌的SW480细胞系DNA，经过重亚硫酸盐转化处理后，分成两组，其中一组经过0.2mol/L NaOH脱硫处理15分钟，另一组不做脱硫处理，两组产物经过纯化后用于PCR扩增。

3、温育及扩增反应程序

运行如下温育及扩增程序：

第一阶段：37℃温育10分钟；

第二阶段：95℃温育10分钟；

第三阶段：95℃温育15秒，60℃温育60秒，共计45个循环；

信号收集：第三阶段60℃时收集荧光信号，每个循环收集一次荧光。

4、三种荧光PCR体系对脱硫和不脱硫样本的扩增结果

采用三种荧光PCR体系，分别扩增：①脱硫样本和②不脱硫样本，结果见图2。

常规PCR体系可以有效扩增脱硫样本，但是对不脱硫样本的扩增效率低，Ct值增加5个循环以上(图2A)。

采用PCR体系(不加UDG)，无论是脱硫样本，还是不脱硫样本，都能得到有效扩增(图2B)，说明在该PCR体系中，不脱硫样本经过95℃温育10分钟处理，可以有效完成脱硫步骤，转变成可被Taq DNA聚合酶识别的DNA模板。

而在完整的PCR体系中，不脱硫样本可以有效扩增，脱硫样本则完全检测不到扩增信号(图2C)；说明在反应的开始阶段(37℃温育10分钟)，UDG酶可以降解脱硫样本中的尿嘧啶，导致脱硫样本无法扩增；而不脱硫样本中的6-磺酰-尿嘧啶不能被UDG酶降解，所以不受UDG酶的影响。

实验结果表明，本发明的PCR扩增方法可以在存在UDG酶的情况下，对不脱硫样本进行有效的甲基化扩增。

实施例2、MGMT基因甲基化检测中消除PCR产物污染的应用实例

采用本发明的PCR扩增方法消除MGMT基因甲基化扩增体系中的PCR产物污染问题。

1、测试样本

测试样本为MGMT甲基化阴性样本(HT29细胞系DNA)和MGMT甲基化阳性样本(SW480细胞系DNA)，经过重亚硫酸盐转化后，不做脱硫处理，转化产物经过纯化后稀释至终浓度为10ng/μL，用作PCR扩增的DNA模板。

PCR扩增污染物为甲基化阳性细胞系(SW480)的扩增产物，经过纯化后稀释至终浓度为10000拷贝/微升。

配制4种包含或不包含PCR扩增污染物的样本，具体见表1。

表1

2、PCR扩增体系

配制两种荧光PCR体系，具体情况如下：

A.本发明PCR体系(不加UDG酶)：

上层PCR反应体系共20μL，其中包括：45mM Tris-HCl(pH7.5，室温)、75mM KCl、6mMMgCl₂、300μM dNTP(含dATP、dCTP、dGTP和dUTP)，0.6μM PCR引物、0.3μM荧光探针、1.25UTaq DNA聚合酶和待测样本。

下层碱性溶液为75mM NaOH，体积为10μL。

中间隔离层为熔点在54-56℃的高纯度石蜡，体积为20μL。

隔离层熔化后，上下层溶液自动混合，形成pH值约为9.2(室温)的PCR扩增体系，总体积30μL。

B.本发明完整PCR体系

在上述A项的PCR反应液中，添加1个单位的UDG酶，形成本发明完整的甲基化扩增体系。

3、温育及扩增反应程序

运行如下温育及扩增程序：

第一阶段：37℃温育10分钟；

第二阶段：95℃温育10分钟；

第三阶段：95℃温育15秒，60℃温育60秒，共计45个循环；

信号收集：第三阶段60℃时收集荧光信号，每个循环收集一次荧光。

4、本发明PCR体系消除PCR产物污染的效果分析

对比分析本发明中不添加和添加UDG酶的扩增效果，结果见图3。

在不添加UDG酶的反应体系中，PCR污染物对目标基因的扩增产生了明显的影响(图3A)。不含污染物的阳性样本S1，扩增Ct值为31.5；加入10000拷贝污染物的样本S2，扩增Ct值减小了3个循环以上。而不含污染物的阴性样本S3，检测不到甲基化荧光扩增信号；但是加入10000拷贝污染物的样本S4，就可以检测到很强的甲基化荧光扩增信号。说明在没有UDG酶存在的情况下，如果发生PCR产物污染，会影响样本甲基化检测结果的准确性。

在添加UDG酶的反应体系中，PCR污染物对目标基因的扩增无明显的影响(图3B)。不含污染物的阳性样本S1，扩增Ct值为31.3，加入10000拷贝污染物的样本S2，扩增Ct值为31.6，二者之间无明显的差异。而对于不含污染物的阴性样本S3，检测不到甲基化荧光扩增曲线；加入10000拷贝污染物的样本S4，同样检测不到甲基化荧光扩增信号。

该结果说明，在本发明的甲基化扩增方法中，UDG酶可以有效消除PCR产物的污染，保证甲基化检测结果的准确性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 基因科技（上海）股份有限公司

<120> 消除PCR产物污染的甲基化扩增方法及其应用

<130> 175867

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 1

gtttyggata tgttgggata g 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 2

cracccaaac actcaccaaa t 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 3

cgcgaaaacc tacgaacgtc ga 22

Claims (14)

1.一种消除PCR产物污染的甲基化扩增方法，其特征在于，所述方法包括：

(1) 提供PCR反应管，在该反应管中含有pH为12.5～13.3的碱性溶液，以热熔材料将碱性溶液密封于管底；该热熔材料的熔点为50～65℃；

(2) 在(1)的PCR反应管中加入PCR反应液和尿嘧啶-DNA-糖基化酶；该PCR反应液中模板为-经过重亚硫酸盐转化但未经过脱硫处理的DNA，该PCR反应液pH为7.4～7.6；

(3) 将(2)的PCR反应管依次进行：低温温育、高温温育和PCR扩增，获得PCR扩增产物；

其中，低温温育为适宜尿嘧啶-DNA-糖基化酶作用但不导致热熔材料熔化的温度、不超过50℃，pH为7.1-7.3；

其中，高温温育为使尿嘧啶-DNA-糖基化酶灭活、热熔材料熔化、以及模板DNA发生脱硫反应的温度，该温度为90～98℃，温育时间为10～15分钟；

经高温温育后，热熔材料熔化，碱性溶液和PCR反应液混合，混合体系的pH值为9.0～9.5，模板DNA上的6-磺酰-尿嘧啶发生脱硫反应。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的热熔材料是疏水材料，其熔点为52～60℃。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的热熔材料为熔点54～56℃的石蜡。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的碱性溶液包括：氢氧化钠，氢氧化钾。

5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的碱性溶液的浓度为50～100 mmol/L。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的碱性溶液的体积不超过PCR反应液体积的50%。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的PCR反应液包括：dNTPs，DNA聚合酶，与所述模板对应的引物和/或探针。

8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的PCR反应液的pH值为7.5。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的高温温育的温度为95℃；或

PCR扩增阶段中，退火温度不低于所述热熔材料的熔点。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低温温育的温度为35-42℃；或

低温温育时间为10分钟。

11.用于基因甲基化扩增的PCR反应管和PCR反应液在制备检测基因甲基化的试剂盒中的应用，所述的试剂盒使用UDG酶消除PCR产物污染；其中，所述用于基因甲基化扩增的PCR反应管中含有pH值为12.5～13.3的碱性溶液，以热熔材料将碱性溶液密封于管底，该热熔材料的熔点为50～65℃；所述PCR反应液中模板为经过重亚硫酸盐转化但未经过脱硫处理的DNA，该PCR反应液pH为7.4～7.6；

其中，所述应用包括以下步骤的应用：

(1) 提供PCR反应管，在该反应管中含有pH为12.5～13.3的碱性溶液，以热熔材料将碱性溶液密封于管底；该热熔材料的熔点为50～65℃；

(2) 在(1)的PCR反应管中加入PCR反应液和尿嘧啶-DNA-糖基化酶；该PCR反应液中模板为-经过重亚硫酸盐转化但未经过脱硫处理的DNA，该PCR反应液pH为7.4～7.6；

(3) 将(2)的PCR反应管依次进行：低温温育、高温温育和PCR扩增，获得PCR扩增产物；

其中，低温温育为适宜尿嘧啶-DNA-糖基化酶作用但不导致热熔材料熔化的温度、不超过50℃，pH为7.1～7.3；

其中，高温温育为使尿嘧啶-DNA-糖基化酶灭活、热熔材料熔化、以及模板DNA发生脱硫反应的温度，该温度为90～98℃，温育时间为10～15分钟；

经高温温育后，热熔材料熔化，碱性溶液和PCR反应液混合，混合体系的pH值为9.0～9.5，模板DNA上的6-磺酰-尿嘧啶发生脱硫反应。

12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，该PCR反应液pH为7.5。

13.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中还含有尿嘧啶-DNA-糖基化酶，经过重亚硫酸盐转化但未经过脱硫处理的DNA模板。

14.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中还含有对应于所述模板的引物和/或探针、dNTP、DNA聚合酶。

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