CN104818338A - 一种直接实时荧光定量pcr的方法 - Google Patents

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Abstract

一种直接实时荧光定量PCR的方法，该方法包括如下步骤：1)用熔点为58℃～60℃的石蜡油混合物包被聚苯乙烯微球，并置于PCR扩增管管底；所述石蜡油混合物包括石蜡油和树脂；2)混合热启动DNA聚合酶、引物和探针、pH值3.5～4.5乙酸缓冲液、氯化镁、氯化钾和dNTP即制得荧光PCR扩增试剂；3)用所述石蜡油混合物封闭所述荧光PCR扩增试剂于步骤1)的PCR扩增管管底；4)石蜡油冷凝后，加入核酸裂解试剂；5)检测样品。本发明的方法，无需核酸制备的过程，可将微量样本直接加到PCR反应管中，直接在荧光PCR仪器上进行检测，具有操作简便、快速的优点。

Description

一种直接实时荧光定量PCR的方法
技术领域
本发明属于临床分子生物学技术领域，具体地属于临床分子生物学检测领域。
背景技术
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是一种根据生物体内DNA复制性质而设计的体外快速扩增特定DNA序列的技术。PCR反应体系主要由核酸引物、4种dNTP、DNA聚合酶、模板DNA和PCR反应缓冲液体系组成。自美国Cetus公司人类遗传室Kary Mullis及其同事于1985年发明聚合酶链式反应(PCR)以来，PCR技术及其衍生技术就被快速开发出来，并在多种核酸检测中得到了广泛的运用。尤其是病毒或其他病原体的检测，当知道待检病原某一特定基因片段时，即可利用特异性的引物对样品中微量的目标DNA进行PCR扩增，使其达到检测量，通过适当的检测手段进行检测，即可确定病原体的存在与否。
实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用DNA扩增过程中荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。与普通的PCR相比。实时荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点，实现了PCR的定量分析。
目前，无论临床实验室检测还是疫情处理，传染病病原的核酸荧光PCR检测技术，均需经过核酸提取或纯化过程，该过程需要专门的实验室环境和相应设备，实验操作人员需经专业培训；另外，这样的操作增加了实验操作步骤，并延长了检测时间。
因此，需要提供一种操作简便、定量准确的荧光定量PCR方法。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题在于提供一种操作简便、定量准确的病原检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案：
一种直接实时荧光定量PCR的方法，其包括如下步骤：
1)用熔点为58℃～60℃的石蜡油混合物包被聚苯乙烯微球，并置于PCR扩增管管底；所述石蜡油混合物包括石蜡油和树脂；
2)混合热启动DNA聚合酶、引物和探针、pH值3.5～4.5乙酸缓冲液、氯化镁、氯化钾和dNTP即制得荧光PCR扩增试剂；
3)用所述石蜡油混合物封闭所述荧光PCR扩增试剂于步骤1)的PCR扩增管管底；
4)石蜡油冷凝后，加入核酸裂解试剂；
5)检测样品。
优选地，聚苯乙烯微球直径为1～2mm。优选地，每个PCR管中微球数量为5-25个，更优选地为8-15个。
优选地，所述石蜡油为优质石蜡油；所述树脂为安息香，石蜡油和安息香混合成熔点为58℃～60℃的石蜡油混合物。
其中所述热启动DNA聚合酶为热启动Taq DNA聚合酶。
荧光PCR扩增试剂的封闭方法为：将20～30μl所述荧光PCR扩增试剂分装到步骤1)的PCR扩增管底，加入20～30μl 95℃溶化的固态石蜡油，来封闭荧光PCR扩增试剂。
步骤2)中荧光PCR扩增试剂中各成分的具体浓度范围为本领域常规用量。
所述核酸裂解液位于已经封闭完好的固态石蜡油上层。所述核酸裂解液包括0.25N的氢氧化钠和1％曲通100。优选地，核酸裂解液的加入量为20～30μl，更优选地为25μl。
完成步骤4)后，PCR管可以封盖冷藏备用也可以立即使用。
利用本发明的直接实时荧光定量PCR的方法进行PCR定量检测，包括如下步骤：
1)将待测样本加入上述方法制备的PCR管的核酸裂解液中。
2)将PCR管放置于PCR仪中进行PCR扩增，并实时监测荧光信号。
为了更好的裂解样品，低速离心PCR管，以减少管壁和管盖上黏附的核酸裂解液，以充分裂解样品，所述低速离心的转速为100～500rpm/min。
所述待测样品包括但不限于培养的细胞、细菌、血清、血浆、唾液、尿液或胸腹水等。优选地所述待测样本体积为5～10μl。优选地，所述样品加入核酸裂解液后，轻轻晃动使所述核酸裂解液与待测样本充分混匀。
优选所述PCR扩增程序：56℃，5min；95℃，10分钟；然后进行50循环的95℃，10秒钟和61℃，30秒钟。在61℃检测荧光信号。PCR扩增程序主要依赖于DNA聚合酶和引物的退火温度，扩增程序包括但不限于上述扩增程序。
在本发明中采用熔点为58℃～60℃的石蜡油混合物将PCR扩增试剂和核酸裂解液隔离。所述核酸裂解液位于混合物的上层，可实现样品核酸的彻底裂解和释放；当PCR温度升至95℃时，隔离荧光PCR扩增试剂和核酸裂解液的固态石蜡油混合物熔化，聚苯乙烯微球随即漂浮至扩增液上层，同时实现荧光PCR扩增试剂和上层核酸的有效混匀，通过热运动原理实现pH值的均匀化。
本发明的有益效果如下：
本发明的直接实时荧光定量PCR的方法，无需核酸制备的过程，可将采集的血清、血浆、唾液、尿液或胸腹水等微量样本直接加到PCR反应管中，直接在荧光PCR仪器上进行检测，具有操作简便、快速的优点。
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
附图说明
图1、示出本发明方法检测HBV DNA敏感性的结果。
图2、示出商用试剂盒检测HBV DNA敏感性的结果。
图3、示出发明方法检测HBV DNA重复性性的结果。
图4、示出商用试剂盒检测HBV DNA重复性性的结果。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1：
聚苯乙烯微球包被的PCR扩增试剂部分：
1.聚苯乙烯微球的包被：
取10个直径为1～2mm的聚苯乙烯微球，用10μl熔点为58℃～60℃的石蜡油混合物经熔解和冷凝过程包被在PCR扩增管底。
2.荧光PCR扩增试剂的配制：
20μl的荧光PCR扩增试剂中含有：1μl的1.5U/μl的热启动Taq DNA聚合酶；1μl的20μmol/L的上游引物、1μl的20μmol/L的下游引物和1μl的10μmol/L的探针；4μl的25mmol/L的氯化镁；2μl的500mmol/L的氯化钾；1μl混匀的四种dNTP(每种为10mmol/L)；9μl的乙酸缓冲液(PH值4.0)，以上成分混匀制成荧光PCR扩增试剂。该荧光PCR扩增试剂的配制与本领域PCR扩增试剂的配制方法相同。
3.荧光PCR扩增试剂的封闭：
将20μl所述荧光PCR扩增试剂分装到步骤1的PCR扩增管管底，加入30μl 95℃熔化的固态石蜡油来封闭荧光PCR扩增试剂。
4.核酸裂解试剂的加入：
将25μl核酸裂解液加入到已包被PCR扩增管的石蜡油上层，封盖冷藏备用。所述核酸裂解液包含0.25N的氢氧化钠和1％曲通100。
实施例2：直接荧光定量PCR的方法的敏感性测试
取临床HBV DNA定量检测值为1×109IU/ml的乙肝患者血清，采用HBVDNA检测为阴性的标本作为稀释液，然后依次进行10倍稀释，即获得HBVDNA浓度从1×109IU/ML～1×102IU/ml的样品。
1)将5μl样品加入到实施例1制备的PCR管中，轻轻摇动PCR扩增管，使管内的核酸裂解液和加入的待测血清进行混匀。然后以200g/min离心将液体甩到底部。
2)将PCR管放置于PCR仪内进行扩增；
PCR扩增程序为：56℃，5min；95℃，10分钟；进行50循环的95℃，10秒钟和61℃，30秒钟PCR扩增。在61℃检测荧光信号。
所述商品试剂盒购自上海科华生物工程股份有限公司。
试验结果见图1、2，结果表明本发明的方法的灵敏度100IU/ml。
实施例3：直接荧光定量PCR的方法的重复性测试及变异系数分析
实验方法与实施例2相同，不同之处在于仅制备HBV DNA浓度为5×103IU/ml、5×106IU/ml和5×108IU/ml的样品，将其用于重复性。采用专利方法对上述样品分别进行5复孔检测。同时用商品试剂盒对采用相同的方案进行对比试验。从附图3和4和表1数据看出，专利方法的重复性明显优于商品试剂，其CV值比商品试剂低3～11倍。
表1：重复性测试及变异系数分析数据
      
实施例4：直接荧光定量PCR的方法的便捷性
实验方法与实施例2相同，不同之处为仅制备HBV DNA浓度为1×107IU/ml的样本，分别制备24份、48份和96份。然后采用本发明方法和常规方法进行检测，然后对比两种检测方法所用时间、操作步骤等进行对比，见表2。
表2：常规方法与本发明方法便捷性对比
      
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (7)

1.一种直接实时荧光定量PCR的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)用熔点为58℃～60℃的石蜡油混合物包被聚苯乙烯微球，并置于PCR扩增管管底；所述石蜡油混合物包括石蜡油和树脂；
2)混合热启动DNA聚合酶、引物和探针、pH值3.5～4.5乙酸缓冲液、氯化镁、氯化钾和dNTP即制得荧光PCR扩增试剂；
3)用所述石蜡油混合物封闭所述荧光PCR扩增试剂于步骤1)的PCR扩增管管底；
4)石蜡油冷凝后，加入核酸裂解试剂；
5)检测样品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述聚苯乙烯微球直径为1-2mm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述树脂为安息香。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述聚合酶为热启动TaqDNA聚合酶。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述核酸裂解液包括0.25N的氢氧化钠和1％曲通100。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：每个PCR管中聚乙烯微球的数量为5-25个。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：每个PCR管中聚乙烯微球的数量为8-15个。
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