CN102839169B - 肠道病毒rna提取试剂盒及相应提取纯化肠道病毒rna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明首先提供一种肠道病毒RNA提取试剂盒，它包含如下组分，①RNA提取溶液Ⅰ：含十二烷基硫酸钠、曲拉通、异硫氰酸胍和100~400μg/ml的磁珠；②RNA提取溶液Ⅱ：含4-羟乙基哌嗪乙磺酸和氯化钠；③RNA提取溶液Ⅲ：含曲拉通和氯化钠；和④RNA提取溶液Ⅳ：硅油。本发明提供的提取试剂盒能配合自动化仪器使用，进行肠道病毒RNA定量检测；该试剂盒RNA提取得率高、检测灵敏度高；能对各样本中的RNA浓度进行快速、准确测定，为早期诊断各类病原体感染提供可靠的实验依据。本发明还提供一种包含RNA洗脱液的磁珠法RNA提取试剂盒和一种一步法提取RNA的试剂盒。本发明提供的三种试剂盒都能有效提取含有各种抑制物的肛拭子、粪便、咽拭子等不同类型样本的肠道病毒RNA。
Description
技术领域
本发明提供一种肠道病毒（Enterovirus，EV）RNA提取试剂盒，具体是一种磁珠法提取RNA的试剂盒，本发明还提供相应提取纯化肠道病毒RNA的方法。
背景技术
目前，国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术定量检测RNA的试剂盒应用于临床检测中，这些试剂盒所提供的RNA提取方法主要是酚-氯仿法和柱提取法。该类试剂盒具有一定的优点，但存在很多不足之处：1）检测灵敏度低，约在500~1000copies/ml左右；检测线性检测范围窄，一般在1.00E+03copies/ml~1.00E+07copies/ml之间，对于临床高值（大于5.00E+07copies/ml）和低值（小于1.00E+03copies/ml）的样本无法检测；2）酚-氯仿法是最经典的RNA提取方法，但是操作繁琐，对于设备和人员操作要求高，低病毒载量的标本检出率低，且所用试剂具有一定的毒性；柱提取方法无需高速离心，但是需频繁更换离心管，用时长，特异性较差；3）现有试剂无法与自动化仪器配套使用，大大增加了检测成本；4）国外性能优异的试剂有QAGEN、PROMEGA和OMEGA等公司产品，但试剂成本和耗材成本太高，很难在临床广泛开展。
磁珠（免疫磁珠）法是近年发展迅速且被广泛应用的一种核酸提取方法，其系列试剂不含氯仿、苯酚等毒性大的有机溶剂；提取纯化的核酸质量好、产量高；提取步骤更简单，不需要离心，易于实现自动化；该技术中核酸可以从磁珠上洗脱下来进行后续检测和作其他用途；如需要对核酸进行准确定量，则核酸也可不与磁珠分离便进行后续检测。这些优点使其有替代其它核酸提取和纯化方法的发展趋势。然而目前磁珠法所用核酸提取试剂基本上为国外开发和垄断，价格非常昂贵，从而限制了其在我国的广泛应用。
发明内容
因此，本发明的目地在于开发一种磁珠法提取肠道病毒RNA的试剂盒，该试剂盒中的试剂易于获取，有利于磁珠法用于RNA提取的大范围推广。
本发明首先提供一种肠道病毒RNA的提取试剂盒，它包含如下组分，①RNA提取溶液Ⅰ：包含十二烷基硫酸钠、曲拉通、异硫氰酸胍和磁珠，且所述十二烷基硫酸钠可以以SDS、LLS、Chelex-100、Tween 20和NP-40中的任意一种或多种替代；②RNA提取溶液Ⅱ：含4-羟乙基哌嗪乙磺酸和氯化钠；③RNA提取溶液Ⅲ：含曲拉通和氯化钠，且所述氯化钠可以以氯化钾或氯化锂替代；和④RNA提取溶液Ⅳ：硅油。本发明提供的上述提取试剂盒能配合自动化仪器（如荧光定量PCR扩增仪）使用，进行肠道病毒RNA的定量检测；该试剂盒RNA提取得率高、检测灵敏度高；能对肛拭子、粪便、和咽拭子等样本中的病原体RNA浓度进行快速、准确测定，为早期诊断各类病原体感染提供可靠的实验依据。
在本发明的试剂盒中，针对肠道病毒RNA的提取，使用了RNA提取溶液Ⅳ：硅油；该组分的使用能使得RNA病毒样本中的杂质得到更好的去除。另外，本发明的试剂盒为专门针对RNA的提取试剂盒，其中的磁珠置于RNA提取溶液Ⅰ中能取得更好的提取效果；而在磁珠法用于DNA提取时，磁珠均置于RNA提取溶液Ⅱ中以取得更好的提取效果。
本发明还提供一种肠道病毒RNA提取试剂盒，它包含上述试剂盒中的组分①~④，还包括RNA洗脱液，所述RNA洗脱液包含Tris-HCl和EDTA。在该RNA提取试剂盒中，增加的组分RNA洗脱液可使得RNA从磁珠上洗脱，一方面有利于待测样本RNA的定性检测（如上机进行荧光PCR检测），另一方面从磁珠上洗脱下来的纯化RNA可作其它用途。
本发明还提供另一种RNA提取试剂盒，该试剂盒中还包括用于快速提取肠道病毒RNA的核酸释放剂水溶液，所述核酸释放剂包括莎梵婷（surfactin）0.01~0.2mM/L，氯化钾20~300mM/L，十二烷基磺酸钠0.05~30g/L，和乙醇0.1~1%（v/v）。使用该核酸释放剂可对RNA进行一步法快速提取，使用该核酸释放剂时可不用上述RNA提取溶液Ⅰ~Ⅳ，而仅使用该核酸释放剂来满足某些病毒RNA的快速提取；该核酸释放剂相应的器材简单，操作简便，提取过程耗时短，成本低。当本发明的RNA提取试剂盒中既包括RNA提取溶液Ⅰ~Ⅳ、又包括该核酸释放剂，还选择性地包括RNA洗脱液时，基本上能满足在RNA核酸提取过程中不同的需求，且都能实现自动化。
在本发明试剂盒用于EV RNA的检测时，使用磁珠法相应的RNA提取溶液或使用一步法相应的核酸释放剂均能准确快速地提取EV RNA；但在实际应用中，若只需检测EV中的具体某种病毒，如肠道病毒71型（Human enterovirus 71，EV71）或柯萨奇病毒A16型（Coxsackievirus A16，CA16），则使用一步法相应的核酸释放剂能有更快的核酸释放速度；而若需分别同时检测EV中的多种病毒，则使用磁珠法相应的RNA提取溶液会更加方便快捷。另外，该试剂盒中磁珠法相应的RNA提取溶液提取核酸的灵敏度会略高于一步法相应的核酸释放剂提取核酸的灵敏度，因而也可以从这个角度去选择具体的RNA提取方法。
本发明提供一种肠道病毒RNA检测试剂盒，它包括上述任意一种RNA提取试剂盒中的组分，还包括PCR反应液、酶混合液、阳性对照和阴性对照；所述PCR反应液中包括5×PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、和用于靶多核苷酸扩增和检测的引物和探针，所述酶混合液中包含mMLV酶和H-Taq DNA聚合酶，所述阳性对照为标定已知浓度的慢病毒，所述阴性对照为灭菌生理盐水。
根据本发明所述的检测试剂盒，所述检测试剂盒中还优选包括内标即阳性内对照，此时所述PCR反应液中还包含用于内标扩增和检测的引物和探针。
一种如上所述试剂盒（磁珠法，RNA不洗脱）的提取纯化肠道病毒RNA的方法，包括如下步骤：步骤A，裂解病毒：每支离心管加入含磁珠的RNA提取溶液Ⅰ和待测样本，混匀后离心；步骤B，磁珠吸附核酸：每管加入RNA提取溶液Ⅱ，混匀后静置；步骤C，去除杂质：经离心后将离心管置于磁珠分离器上进行磁珠分离，再缓慢将溶液吸出；步骤D，洗涤：每管加入RNA提取溶液Ⅲ和RNA提取溶液Ⅳ，混匀后离心，将离心管置于磁珠分离器上进行磁珠分离，静置分层后将液体吸出丢弃。
一种如上所述试剂盒（磁珠法，RNA洗脱）的提取纯化肠道病毒RNA的方法，它包括上述的步骤A~D，还包括步骤D后的步骤E，即RNA洗脱：加入所述RNA洗脱液将离心管壁上的磁珠洗脱到管底，混匀并静置后将离心管再次置于磁珠分离器上，然后将从磁珠上洗脱下来的RNA吸至新的灭菌离心管中。
具体实施方式
通过以下实施例来具体说明本发明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1
本实施例为磁珠法提取纯化试剂盒（核酸不洗脱）用于提取纯化肠道病毒RNA，结合荧光PCR扩增仪进行肠道病毒RNA的检测。
本实施例中的核酸提取试剂包括：
①RNA提取溶液Ⅰ：由十二烷基硫酸钠0.6（质量/体积）%、曲拉通3.5（v/v）%，异硫氰酸胍0.8mol/L和300μg/ml的磁珠组成；
②RNA提取溶液Ⅱ：包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸100mmol/L、氯化钠200mmol/L，溶液Ⅱ的pH值为6.5±0.2；
③RNA提取溶液Ⅲ：曲拉通0.5（v/v）%、氯化钠300mmol/L；
④RNA提取溶液Ⅳ：硅油；
本实施例所述核酸提取试剂盒用于肠道病毒RNA的提取和检测步骤如下：
一、试剂准备
1）按比例取相应量的RNA提取溶液Ⅰ（200μl~1ml/人份）及内标（1μl/人份）充分混匀成RNA提取溶液1-mix，瞬时离心后备用。
2）根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，按比例取相应量的PCR反应液（43μl/人份）及酶混合液（2μl/人份），充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用。
二、RNA提取操作
1）裂解病毒：每管加入200μl~1ml RNA提取溶液1-mix，然后加入100μl~1ml待测样本（如咽拭子），盖上管盖，震荡混匀10秒钟，瞬时离心；阴性对照和阳性对照参照与待测样本相同方法作RNA提取和纯化处理；
2）磁珠吸附核酸：每管加入50~400μl RNA提取溶液Ⅱ，震荡混匀10秒钟后，室温静置10~30分钟；
3）去除杂质：瞬时离心后，将离心管置于磁珠分离器上进行磁珠分离，2~5分钟后缓慢将溶液吸出；
4）洗涤：每管加入400μl~1ml RNA提取溶液Ⅲ和100~500μl RNA提取溶液Ⅳ，震荡混匀3~7秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于磁珠分离器上进行磁珠分离；静置分层后将液体吸出丢弃。
为了更准确地对肠道病毒RNA定量，其RNA并不从磁珠上洗脱下来，而是将连接有磁珠的肠道病毒RNA直接进行荧光PCR定量检测。
5）荧光PCR分析：每个反应管加入50μl PCR-mix，用吸头吸取PCR-mix冲洗吸附于离心管壁的棕色残留物，反复几次尽量将该RNA与磁珠的连接物完全洗下，然后将洗下的全部棕色混合液转移至PCR反应管中，盖上管盖，在荧光定量PCR扩增仪上进行PCR反应，并分析结果。阴性对照和阳性对照参照与待测样本相同的方法进行操作。
通过对不同来源和不同浓度样本中肠道病毒RNA检测的结果表明：不同样本的肠道病毒检测结果均有Ct值（即为阳性），体系中没有PCR抑制物的存在；而目前常用的酚-氯仿法和柱提取法中，均存在低浓度样本的肠道病毒检测无Ct值（Undet）的情况（即为阴性），由于三种提取方法使用的是同一种PCR扩增体系，由此说明，酚-氯仿法和柱提取法提取的RNA中有PCR抑制物存在，而导致肠道病毒阳性样本检测为阴性，即为假阴性，提示应该进行重新检测或者改进方法进行检测。因此，本试剂盒所采用的磁珠法提取核酸，能够有效去除复杂样本中的PCR抑制物，适合于肛拭子、粪便、咽拭子等样本的RNA提取和PCR检测。
实施例2
本实施例为磁珠法提取纯化试剂盒（核酸从磁珠上洗脱）用于提取纯化肠道病毒RNA，结合荧光PCR扩增仪进行肠道病毒RNA的定性检测。
本实施例中的核酸提取试剂包括：与实施例1相同的RNA提取溶液Ⅰ~Ⅳ，还包括由Tris-HCl 1.2mol/L（pH8.0）和EDTA1.0mol/L（pH8.0）组成的RNA洗脱液。
本实施例所述核酸提取试剂盒用于肠道病毒RNA的提取和检测步骤如下：
一、试剂准备：该步骤与实施例1中相应步骤相同；
二、RNA提取操作：该步骤中的步骤1）裂解病毒至步骤4）洗涤均与实施例1中步骤相同；本实施例中肠道病毒RNA的检测还包括如下步骤5）和6）；
5）RNA洗脱：加入30μl RNA洗脱液，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀3~4次，室温静置10分钟后将离心管再次置于分离器上3分钟，然后将从磁珠上洗脱下来的RNA放于新的灭菌离心管中；
从磁珠上洗脱下来的经提取和纯化的RNA中一部分可用于后续的荧光PCR分析，而另一部分纯化的RNA可作其他用途。
6）荧光PCR分析：将洗脱磁珠后的待测样本RNA、阴性对照、阳性对照中每个反应管均加入45μl的PCR-mix，吸取已经洗脱磁珠后的待测样本RNA、阴性对照、阳性对照各5μl加入PCR-mix中，盖好管盖。在荧光定量PCR扩增仪上进行PCR反应，并分析结果。
通过对不同浓度样本中肠道病毒RNA检测的结果表明：咽拭子样本的肠道病毒检测和内标检测的结均有Ct值（即为阳性），体系中没有PCR抑制物的存在；而目前常用的酚-氯仿法和柱提取法中，均存在如实施例1中所述的假阴性情况出现。因此，本试剂盒所采用的磁珠法提取核酸，能够有效去除复杂样本中的PCR抑制物，适合于不同浓度的咽拭子样本的RNA提取和PCR检测。
另外，临床样本的检测试验表明：本发明的磁珠法提取纯化试剂盒（核酸洗脱）检测肠道病毒RNA的线性检测范围为2.00E+02~2.00E+08copies/mL，检测下限即灵敏度为2.00E+02copies/mL。
实施例3
本实施例为一步法提取纯化试剂盒用于提取纯化肠道病毒RNA，结合荧光PCR扩增仪进行肠道病毒RNA的定性检测。本实施例中不需用到磁珠法提取RNA所用的RNA提取溶液Ⅰ~Ⅳ。
本实施例中所用的核酸提取试剂为核酸释放剂水溶液，所述核酸释放剂包括莎梵婷（surfactin）0.2mM/L，氯化钾100mM/L，十二烷基磺酸钠10g/L，和乙醇0.08%（v/v）。
本实施例所述核酸释放剂用于肠道病毒RNA的提取和检测步骤如下：取出核酸释放剂中的各组分，室温放置，待其温度平衡至室温后，混匀备用；每个PCR反应管中加入核酸释放剂2~5μl（建议深吸浅打，避免出现气泡），加入待测样本3~5μl，吸打3~5次混匀（轻轻吸打，避免出现气泡）；间隔10分钟以上，每管加入与实施例2中相同的PCR-mix溶液40~45μl，吸打混匀2~3次，盖上管盖（去除气泡后），2000rpm离心30秒，继续进行PCR反应和检测。
本发明的快速提取试剂得到检测结果的速度更快，处理50个样本用时不到30分钟，而煮沸裂解法与柱提取法试剂的样本处理时间分别为60分钟和75分钟。在灵敏度上本发明的快速检测试剂盒与其他试剂盒结果差别不大，对于浓度为1.00E+03copies/mL的样本均检测为阳性，而煮沸裂解法和柱提取法的灵敏度均为5.00E+02copies/mL。
另外，临床样本的检测试验表明：本发明的快速检测试剂盒（含核酸释放剂）的线性范围为1.00E+03~2.00E+08copies/mL，检测下限即灵敏度为1.00E+03copies/mL。
本发明提供的三种提取纯化试剂盒和相应的三种提取方法都能有效提取含有各种抑制物成分的肛拭子、粪便、咽拭子等不同类型样本的肠道病毒RNA。
Claims (4)
1.一种肠道病毒RNA检测试剂盒，它包含如下组分，
①RNA提取溶液Ⅰ：包含十二烷基硫酸钠0.2～1.0%（质量/体积）、曲拉通1.0～4.0%（体积/体积）、异硫氰酸胍0.2～1.0mol/L和磁珠100～400μg/ml；
②RNA提取溶液Ⅱ：含4-羟乙基哌嗪乙磺酸100～300mmol/L和氯化钠100～300mmol/L，溶液Ⅱ的pH值为6.5±0.2；
③RNA提取溶液Ⅲ：含曲拉通0.1～1.0%（体积/体积）和氯化钠100～300mmol/L；
④RNA提取溶液Ⅳ：硅油；
还包括PCR反应液、酶混合液、阳性对照和阴性对照；所述PCR反应液中包括5×PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、和用于靶多核苷酸扩增和检测的引物和探针，所述酶混合液中包含mMLV酶和H-Taq DNA聚合酶，所述阳性对照为标定已知浓度的慢病毒，所述阴性对照为灭菌生理盐水。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中还包括RNA洗脱液，所述RNA洗脱液包含Tris-HCl和EDTA。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中还包括用于快速提取RNA的核酸释放剂水溶液，所述核酸释放剂包括莎梵婷0.01～0.2mmol/L，氯化钾20～300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.05～30g/L，和乙醇0.1～1%（v/v）。
4.根据权利要求1或2所述的检测试剂盒，所述检测试剂盒中还包括内标即阳性内对照，且所述PCR反应液中还包含用于内标扩增和检测的引物和探针。
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