CN108753767A - 一种病毒核酸提取试剂盒及提取方法 - Google Patents

一种病毒核酸提取试剂盒及提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种病毒核酸提取试剂盒，包含以下组分：裂解液、漂洗液1、漂洗液2、洗脱液、蛋白酶K和磁珠；所述裂解液包含以下浓度的组分：1.0～5.0mol/L高氯酸钠、10～200mmol/L Tris‑HCl、1～50mmol/L EDTA和50～100uL/mL Triton X‑100；所述漂洗液1为2.0～2.5mol/L高氯酸钠溶液，且所述高氯酸钠溶液的溶剂为70～80％乙醇；所述漂洗液2包含以下组分：DEPC水和无水乙醇，且所述DEPC水和无水乙醇的体积比为(3～4)：(6～7)；所述洗脱液为8～12mmol/L Tris‑HCl‑DEPC水溶液。本发明还公开了利用所述试剂盒进行病毒核酸提取的方法。本发明试剂盒通过试剂配方的优化，具有快速、高效且避免污染的优点，可以节省大量时间和试剂，提高病毒核酸提取效率。

Description

一种病毒核酸提取试剂盒及提取方法
技术领域
本发明属于核酸提取技术领域，具体涉及一种病毒核酸提取试剂盒及提取方法。
背景技术
病毒核酸提取纯化经PCR扩增鉴定后，检测的结果可以作为临床参考的依据之一。但由于外源及内源性核酸酶的存在及其酶活性相当稳定等原因，使得在外周血中提取和纯化高质量的病毒核酸相对比较困难。核酸提取试剂配方对核酸的质量和得率有很大的影响，因此研发高效快速、得率高的核酸提取试剂是本领域不断探索的课题。磁珠法作为可应用自动化的核酸提取方法，主要原理是基于磁珠在高盐溶液中对核酸进行特异性的吸附，经过磁性分离和漂洗蛋白质和多糖等杂质后，在低盐溶液中被洗脱下来，从而达到对核酸进行提取纯化的目的。
目前对于外周血病毒的核酸提取纯化大多使用煮沸法、碱裂解法、离心吸附柱法等。传统的病毒核酸提取方法用时操作繁琐、费时，如煮沸裂解法，高温处理样本容易产生气溶胶，存在污染检测环境风险；硅胶膜吸附法需要多次离心，容易出现交叉污染等问题。然而，目前市面上的病毒核酸提取试剂盒主要用作定性筛查，实际应用中由于灵敏度低等原因容易造成漏检，或者由于提取核酸不完全造成定量偏差，不能很好地反映样本的真实浓度。
发明内容
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种病毒核酸提取试剂盒，具有快速、高效且避免污染的优点，可以节省大量时间和试剂，提高病毒核酸提取效率。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种病毒核酸提取试剂盒，包含以下组分：裂解液、漂洗液1、漂洗液2、洗脱液、蛋白酶K和磁珠；
所述裂解液包含以下浓度的组分：1.0～5.0mol/L高氯酸钠、10～200mmol/LTris-HCl、1～50mmol/L EDTA和50～100uL/mL Triton X-100；所述Tris-HCl的pH值为7.5～8.5，EDTA的pH值为7.5～8.5；
所述漂洗液1为2.0～5.0mol/L高氯酸钠溶液，且所述高氯酸钠溶液的溶剂为70～80％乙醇；
所述漂洗液2包含以下组分：DEPC水和无水乙醇，且所述DEPC水和无水乙醇的体积比为(3～4)：(6～7)；
所述洗脱液为8～12mmol/L Tris-HCl-DEPC水溶液，且pH值为7.5～8.5。
优选地，所述裂解液包含以下组分：1.74mol/L高氯酸钠、35mmol/L Tris-HCl、7mmol/L EDTA和70uL/mL Triton X-100；所述Tris-HCl的pH值为8.0，EDTA的pH值为8.0。
优选地，所述漂洗液1为2.0mol/L高氯酸钠溶液，且所述高氯酸钠溶液的溶剂为75％乙醇。
优选地，所述漂洗液2中DEPC水和无水乙醇的体积比为3:7。
优选地，所述洗脱液为10mmol/L Tris-HCl-DEPC水溶液，且pH值为8.0。
本发明所述Tris-HCl-DEPC水溶液是指使用DEPC水配制的Tris-HCl溶液。
优选地，所述蛋白酶K的浓度为15～25mg/mL。
更优选地，所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL。
优选地，所述磁珠为二氧化硅磁珠。
本申请发明人经过大量的研究和统计分析发现，当所述试剂盒各组分组成选取上述优选值时能取得更好的病毒核酸提取效果。
本发明还提供了利用所述病毒核酸提取试剂盒进行病毒核酸提取的方法，包括以下步骤：
(1)向提取容器中依次加入蛋白酶K、待提取样本、裂解液和磁珠，混合均匀进行裂解；
(2)向步骤(1)获得的裂解液中加入漂洗液1，混合均匀，弃液体，保留磁珠；
(3)向步骤(2)获得的磁珠中加入漂洗液2，混合均匀，弃液体；重复漂洗一次，弃液体，保留磁珠；
(4)向步骤(3)获得的磁珠中加入洗脱液进行洗脱，弃磁珠，即得所述病毒核酸。
优选地，所述步骤(1)中蛋白酶K、待提取样本、裂解液和磁珠的体积比为5:20:40:1。
优选地，所述步骤(1)中裂解条件为：于50～60℃裂解10～30min，
更优选地，所述步骤(1)中裂解条件为：于55℃裂解15min。
优选地，所述步骤(4)中洗脱条件为：于50～60℃洗脱5～15min
更优选地，所述步骤(4)中洗脱条件为：于55℃洗脱8min。
采用本发明试剂盒进行病毒核酸提取时，可以采用手动法进行提取，也可以采用核酸提取仪器进行自动提取。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：(1)本发明试剂盒通过试剂配方的优化，在特定的pH下可以从样本中轻松捕获微量病毒核酸，操作流程简洁，45min内即可完成病毒核酸的提取纯化，所需的样本体积仅为200ul；(2)利用本发明试剂盒进行病毒核酸提取可以节省大量时间和试剂，提高提取效率；(3)本发明提取方法具有快速、高效且避免污染等优点。
说明书附图
图1为实验组1和对照组1EB病毒核酸样本的扩增曲线图，其中，1、2和3号曲线为实验组1样本的扩增曲线；4、5和6号曲线为对照组1样本的扩增曲线。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明病毒核酸提取试剂盒的一种实施例，所述试剂盒包含以下组分：裂解液、漂洗液1、漂洗液2、洗脱液、蛋白酶K和磁珠；
所述裂解液包含以下浓度的组分：1.0mol/L高氯酸钠、10mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA和50uL/mL Triton X-100；所述Tris-HCl的pH值为7.5，EDTA的pH值为7.5；
所述漂洗液1为2.0mol/L高氯酸钠溶液，且所述高氯酸钠溶液的溶剂为70％乙醇；
所述漂洗液2包含以下组分：DEPC水和无水乙醇，且所述DEPC水和无水乙醇的体积比为4：6；
所述洗脱液为12mmol/L Tris-HCl-DEPC水溶液，且pH值为7.5；
所述蛋白酶K为商业化产品，用DEPC水溶解，浓度为15mg/mL；
所述磁珠为商业化的二氧化硅磁珠。
实施例2
本发明病毒核酸提取试剂盒的一种实施例，所述试剂盒包含以下组分：裂解液、漂洗液1、漂洗液2、洗脱液、蛋白酶K和磁珠；
所述裂解液包含以下浓度的组分：2.5mol/L高氯酸钠、50mmol/L Tris-HCl、20mmol/L EDTA和80uL/mL Triton X-100；所述Tris-HCl的pH值为8.5，EDTA的pH值为8.5；
所述漂洗液1为2.5mol/L高氯酸钠溶液，且所述高氯酸钠溶液的溶剂为80％乙醇；
所述漂洗液2包含以下组分：DEPC水和无水乙醇，且所述DEPC水和无水乙醇的体积比为3.5：6.5；
所述洗脱液为8mmol/L Tris-HCl-DEPC水溶液，且pH值为8.5；
所述蛋白酶K为商业化产品，用DEPC水溶解，浓度为20mg/mL；
所述磁珠为商业化的二氧化硅磁珠。
实施例3
本发明病毒核酸提取试剂盒的一种实施例，所述试剂盒包含以下组分：裂解液、漂洗液1、漂洗液2、洗脱液、蛋白酶K和磁珠；
所述裂解液包含以下浓度的组分：5.0mol/L高氯酸钠、200mmol/L Tris-HCl、50mmol/L EDTA和100uL/mL Triton X-100；所述Tris-HCl的pH值为8.0，EDTA的pH值为8.0；
所述漂洗液1为5.0mol/L高氯酸钠溶液，且所述高氯酸钠溶液的溶剂为75％乙醇；
所述漂洗液2包含以下组分：DEPC水和无水乙醇，且所述DEPC水和无水乙醇的体积比为3.2：6.8；
所述洗脱液为11mmol/L Tris-HCl-DEPC水溶液，且pH值为8.0；
所述蛋白酶K为商业化产品，用DEPC水溶解，浓度为25mg/mL；
所述磁珠为商业化的二氧化硅磁珠。
实施例4
本发明病毒核酸提取试剂盒的一种实施例，所述试剂盒包含以下组分：裂解液、漂洗液1、漂洗液2、洗脱液、蛋白酶K和磁珠；
所述裂解液包含以下组分：1.74mol/L高氯酸钠、35mmol/L Tris-HCl、7mmol/LEDTA和70uL/mL Triton X-100；所述Tris-HCl的pH值为8.0，EDTA的pH值为8.0；
所述漂洗液1为2.0mol/L高氯酸钠溶液，且所述高氯酸钠溶液的溶剂为75％乙醇；
所述漂洗液2包含以下组分：DEPC水和无水乙醇，且所述DEPC水和无水乙醇的体积比为3：7；
所述洗脱液为10mmol/L Tris-HCl-DEPC水溶液，且pH值为8.0；
实施例5
利用本发明试剂盒进行病毒核酸提取的方法的一种实施例，所述方法为手动提取方法，包括以下步骤：
(1)向1.5mL离心管中依次加入50ul蛋白酶K、200ul外周血样本、400ul裂解液和10ul二氧化硅磁珠，混合均匀，于50℃裂解30min；
(2)向步骤(1)获得的裂解液中加入500ul漂洗液1，混合均匀，放置于磁力架上进行磁分离1min，弃液体，保留二氧化硅磁珠；
(3)向步骤(2)获得的磁珠中加入500ul漂洗液2，混合均匀，放置于磁力架上进行磁分离1min，弃液体；重复漂洗一次，放置于磁力架上进行磁分离1min，弃液体，保留二氧化硅磁珠；
(4)向步骤(3)获得的二氧化硅磁珠中加入100ul洗脱液，于60℃洗脱5min，放置于磁力架上进行磁分离1min，弃二氧化硅磁珠，即得所述病毒核酸。
实施例6
利用本发明试剂盒进行病毒核酸提取的方法的一种实施例，所述方法为手动提取方法，包括以下步骤：
(1)向1.5mL离心管中依次加入50ul蛋白酶K、200ul外周血样本、400ul裂解液和10ul二氧化硅磁珠，混合均匀，于60℃裂解10min；
(2)向步骤(1)获得的裂解液中加入500ul漂洗液1，混合均匀，放置于磁力架上进行磁分离1min，弃液体，保留二氧化硅磁珠；
(3)向步骤(2)获得的磁珠中加入500ul漂洗液2，混合均匀，放置于磁力架上进行磁分离1min，弃液体；重复漂洗一次，放置于磁力架上进行磁分离1min，弃液体，保留二氧化硅磁珠；
(4)向步骤(3)获得的二氧化硅磁珠中加入100ul洗脱液，于50℃洗脱15min，放置于磁力架上进行磁分离1min，弃二氧化硅磁珠，即得所述病毒核酸。
实施例7
利用本发明试剂盒进行病毒核酸提取的方法的一种实施例，所述方法为利用全自动核酸提取仪进行提取，包括以下步骤：
(1)将外周血样本涡旋混匀，作为待测样本备用；
(2)往2.2ml提取板(96孔深孔板)加入以下试剂：
第一孔：50ul蛋白酶K、200ul外周血样本、400ul裂解液、10ul二氧化硅磁珠(按顺序依次加入)；
第二孔：500ul漂洗液1；
第三孔：500ul漂洗液2；
第四孔：500ul漂洗液2
第六孔：100ul洗脱液；
(3)使用中山大学达安基因股份有限公司的全自动核酸提取仪Smart32进行提取，设定如表1所示的提取步骤，上机提取；提取完成后，第6孔即为样本所提核酸。
表1提取步骤
实施例8
本实施例研究本发明病毒核酸提取试剂盒配方对病毒核酸提取效果的影响。
(一)实验方法
取实施例1～4中的病毒核酸提取试剂盒，按照实施例7所述方法对感染EB病毒患者的外周血样本中的EB病毒核酸进行提取，然后使用中山大学达安基因股份有限公司的EB病毒核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒进行PCR扩增，扩增反应体系和反应程序分别如表2和表3所示：
表2扩增反应体系
试剂名称 体积
反应液 40ul
Taq酶 3ul
DNA模板 2ul
表3扩增反应程序
(二)实验结果
利用检测CT值来评价试剂盒的提取效果，实验结果如表4所示：
表4实验结果(CT值)
由上述实验结果可知，使用实施例4所述配方组成的试剂盒提取病毒核酸时效果最好。
对比例1
为研究本发明病毒提取试剂盒的提取效果，设置实验组1和对照组1，其中，实验组1利用本发明实施例4中的试剂盒对感染EB病毒患者的外周血样本中的EB病毒核酸进行提取；对照组1利用中山大学达安基因股份有限公司的EB病毒核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒对感染EB病毒患者的外周血样本中的EB病毒核酸进行提取和检测。
(一)实验方法
1、病毒核酸提取，提取方法分别如下：
实验组1：同实施例7。
对照组1：在5ml离心管中加入1ml外周血和1ml生理盐水，混合均匀备用；取新的5ml离心管加入淋巴细胞分离液500ul，把稀释好的外周血样本沿管壁缓缓地加入到淋巴细胞分离液上；2000rpm离心20min；吸取单个核细胞层(第二层)加入1.5ml离心管12000rpm离心5min；去掉上清，沉淀中加入50ul DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10min；12000rpm离心5min，备用。
2、将实验组1和对照组1提取得到的EB病毒核酸使用中山大学达安基因股份有限公司的EB病毒核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒进行PCR扩增，扩增反应体系和反应程序分别如实施8中表2和表3所示。
(二)实验结果
实验组1和对照组1提取得到的EB病毒核酸样本的扩增曲线如图1所示，CT值结果如表5所示：
表5实验组1和对照组1检测的CT值结果
编号 对照组1 实验组1
1 22.82 21.39
2 22.51 21.43
3 22.05 21.40
均值 22.46 21.41
标准偏差 0.39 0.02
CV值(％) 1.72 0.10
由图1和表5可以看出，实验组1(本发明试剂盒)提取得到的EB病毒核酸浓度比对照组1中的试剂盒要高(CT值小)，而且重复性更好(CV值小)。更重要的是，实验组1(本发明试剂盒)使用的外周血样本为200ul，而对照组1使用的外周血样本则为1ml，即实验组1(本发明试剂盒)所需的外周血样本体积仅为对照组的1/5，并且可以实现自动化提取，减少实验误差和降低操作者的工作量。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种病毒核酸提取试剂盒，其特征在于，包含以下组分：裂解液、漂洗液1、漂洗液2、洗脱液、蛋白酶K和磁珠；
所述裂解液包含以下浓度的组分：1.0～5.0mol/L高氯酸钠、10～200mmol/L Tris-HCl、1～50mmol/L EDTA和50～100uL/mL Triton X-100；所述Tris-HCl的pH值为7.5～8.5，EDTA的pH值为7.5～8.5；
所述漂洗液1为2.0～5.0mol/L高氯酸钠溶液，且所述高氯酸钠溶液的溶剂为70～80％乙醇；
所述漂洗液2包含以下组分：DEPC水和无水乙醇，且所述DEPC水和无水乙醇的体积比为(3～4)：(6～7)；
所述洗脱液为8～12mmol/L Tris-HCl-DEPC水溶液，且pH值为7.5～8.5。
2.根据权利要求1所述的病毒核酸提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液包含以下组分：1.74mol/L高氯酸钠、35mmol/L Tris-HCl、7mmol/L EDTA和70uL/mL Triton X-100；所述Tris-HCl的pH值为8.0，EDTA的pH值为8.0。
3.根据权利要求1所述的病毒核酸提取试剂盒，其特征在于，所述漂洗液1为2.0mol/L高氯酸钠溶液，且所述高氯酸钠溶液的溶剂为75％乙醇。
4.根据权利要求1所述的病毒核酸提取试剂盒，其特征在于，所述漂洗液2中DEPC水和无水乙醇的体积比为3:7。
5.根据权利要求1所述的病毒核酸提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液为10mmol/LTris-HCl-DEPC水溶液，且pH值为8.0。
6.根据权利要求1所述的病毒核酸提取试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶K的浓度为15～25mg/mL；所述磁珠为二氧化硅磁珠。
7.利用权利要求1～6任一项所述病毒核酸提取试剂盒进行病毒核酸提取的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向提取容器中依次加入蛋白酶K、待提取样本、裂解液和磁珠，混合均匀进行裂解；
(2)向步骤(1)获得的裂解液中加入漂洗液1，混合均匀，弃液体，保留磁珠；
(3)向步骤(2)获得的磁珠中加入漂洗液2，混合均匀，弃液体；重复漂洗一次，弃液体，保留磁珠；
(4)向步骤(3)获得的磁珠中加入洗脱液进行洗脱，弃磁珠，即得所述病毒核酸。
8.根据权利要求7所述的病毒核酸提取的方法，其特征在于，所述步骤(1)中蛋白酶K、待提取样本、裂解液和磁珠的体积比为5:20:40:1。
9.根据权利要求7所述的病毒核酸提取的方法，其特征在于，所述步骤(1)中裂解条件为：于50～60℃裂解10～30min。
10.根据权利要求7所述的病毒核酸提取的方法，其特征在于，所述步骤(4)中洗脱条件为：于50～60℃洗脱5～15min。
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