CN109182335A - 一种病毒核酸提取试剂盒 - Google Patents

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宋卉
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    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
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Abstract

本发明公开了一种病毒核酸提取试剂盒，包括Tris‑HCl溶液、EDTA溶液、高氯酸钠溶液、漂洗液、裂解液、洗脱液、磁珠和蛋白酶K。本发明的核酸提取试剂盒的试剂配方通过大量实验筛选得到，用于病毒核酸提取可以节省大量时间和试剂成本，适用于临床快速、高通量和自动化的要求，显著提高核酸效率，能够满足同时大批量提取病毒DNA/RNA的需求。

Description

一种病毒核酸提取试剂盒
技术领域
本发明涉及核酸提取技术领域，尤其是一种病毒核酸提取试剂盒。
背景技术
核酸是一类带有遗传信息的生物大分子，包装脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类。病毒感染是人类致病的特殊病原微生物之一，病毒的结构是由衣壳和核酸组成。在临床上检测病毒核酸可作为病毒感染重要的参考依据，病毒的核酸提取是首要工作。目前针对病毒的核酸提取，大多采用硅胶膜吸附法，其利用离心吸附柱对DNA/RNA进行吸附，然后使用特定的漂洗液洗去蛋白、多糖等杂质从而达到分离纯化的目的。硅胶膜吸附法的缺点在于需要反复离心，倾倒废液；操作繁琐和耗时长，在处理多个样本的时候容易交叉污染；由于样本基本都是单管独立处理，不能形成自动化操作，满足不了临床高通量检测的需求。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种可大批量提取病毒核酸的试剂盒，采用该试剂盒提取病毒核酸，操作简便、耗时少。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种病毒核酸提取试剂盒，包括Tris-HCl溶液、EDTA溶液、高氯酸钠溶液、漂洗液、裂解液、洗脱液、磁珠和蛋白酶K。
作为上述方案的进一步优化，所述Tris-HCl溶液的浓度为1M(mol/L)，所述EDTA溶液的浓度为0.5M，所述高氯酸钠溶液的浓度为6M。
作为上述方案的进一步优化，所述Tris-HCl溶液、EDTA溶液、洗脱液的pH值为8.0。需要说明的是，本申请的发明人经多次试验发现，当Tris-HCl溶液、EDTA溶液、洗脱液的pH值为8.0时，从待提取样本中捕获微量病毒核酸的效率显著提高。
作为上述方案的进一步优化，所述漂洗液包括第一漂洗液和第二漂洗液，所述第一漂洗液为高氯酸钠和乙醇的混合溶液，所述第二漂洗液为质量浓度75％的乙醇溶液；更优选地，所述第一漂洗液中高氯酸钠的浓度为2M。
作为上述方案的进一步优化，所述裂解液采用以下方法制备：取6M高氯酸钠100mL、1M Tris-HCl 5mL、0.5M EDTA 2mL和吐温-20 8mL混合，振荡过夜即得。其中，Tris-HCl、EDTA的pH值优选8.0。
作为上述方案的进一步优化，所述洗脱液为Tris-Base的水溶液，其浓度为0.1M。
作为上述方案的进一步优化，所述磁珠为二氧化硅磁珠。需要说明的是，本发明利用磁珠作为吸附载体，对核酸进行特异性吸附，在磁场作用下从生物样本中分离核酸。
作为上述方案的进一步优化，所述蛋白酶K的使用浓度为20mg/ml。应当说明的是，使用浓度即蛋白酶K在提取时添加到待测样品的混合液中的终浓度。
综上所述，本发明的有益效果为：
本发明的核酸提取试剂盒的试剂配方通过大量实验筛选得到，用于病毒核酸提取可以节省大量时间和试剂成本，适用于临床快速、高通量和自动化的要求，显著提高核酸效率，能够满足同时大批量提取病毒DNA/RNA的需求。
附图说明
图1为HBV-PCR扩增曲线图；
图2为HCV-PCR扩增曲线图。
具体实施方式
本发明涉及生物技术领域，具体涉及血浆/血清的病毒核酸提取的方法及其试剂盒。其中的磁珠法作为可应用自动化的核酸提取方法，主要原理是基于磁珠在高盐溶液中对核酸进行特异性的吸附，经过磁性分离和漂洗蛋白质和多糖等杂质后，在低盐溶液中被洗脱下来，从而达到对核酸进行提取纯化的目的。
本申请的发明人通过大量实验筛选得到合适的核酸提取试剂配方，用于病毒核酸提取。本发明的核酸提取方法可以节省大量时间和试剂，适用于临床快速、高通量和自动化的要求，提高效率。本发明的试剂盒在特定的pH(8.0)下可以从样本中轻松捕获微量病毒核酸；操作流程简洁，45min内即可完成病毒核酸的提取纯化，适用的样本体积可达1600ul，使用全自动核酸提取仪进行提取，减少手工操作造成的误差和降低操作者的工作量，比现有的大多数商品化试剂盒都省时省力。
采用本发明的试剂盒为血浆/血清病毒核酸的提取产品，可以有效快速提取血浆/血清病毒核酸，可实现临床样本高通量检测，缩短病毒检测时间；在本发明的试剂盒的基础上，按比例增大/缩小的技术方案应属于本发明保护范围内；本发明的试剂盒同样可以适用于其他病原体样本的核酸提取，如乳汁、唾液、尿液等。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明的病毒核酸提取试剂盒的一种实施例，包括Tris-HCl溶液、EDTA溶液、高氯酸钠溶液、漂洗液、裂解液、洗脱液、磁珠和蛋白酶K；
其中，Tris-HCl溶液的浓度为1M，EDTA溶液的浓度为0.5M，高氯酸钠溶液的浓度为6M；Tris-HCl溶液、EDTA溶液、洗脱液的pH值均为8.0；
漂洗液包括第一漂洗液和第二漂洗液，第一漂洗液为高氯酸钠和乙醇的混合溶液，第二漂洗液为质量浓度75％的乙醇溶液；第一漂洗液中高氯酸钠的浓度为2M；
裂解液采用以下方法制备：取6M高氯酸钠100mL、1M Tris-HCl 5mL、0.5M EDTA2mL和吐温-20 8mL混合，振荡过夜即得；
洗脱液为Tris-Base的水溶液，其浓度为0.1M；磁珠为二氧化硅磁珠；蛋白酶K的使用浓度为20mg/ml。
实施例2
本发明的病毒核酸提取试剂盒的一种实施例，其包括：
(1)1M Tris-HCl(pH8.0)：称量Tris-Base 121.14g，加入900ml纯水溶解，加入适量NaOH颗粒，搅拌溶解，调pH＝8.0，定容至1L备用；
(2)0.5M EDTA(pH8.0)：称量EDTA-2Na 186.12g，加入900ml纯水溶解，加入适量NaOH颗粒，搅拌溶解，调pH＝8.0，定容至1L备用；
(3)6M高氯酸钠：称量高氯酸钠842.76g，加入900ml纯水溶解，定容至1L备用；
(4)75％乙醇：取无水乙醇750ml，加入纯水定容至1L备用；
(5)裂解液MLC：取6M高氯酸钠100mL，1M Tris-HCl(pH8.0)5mL，0.5M EDTA(pH8.0)2mL，吐温-20 8mL，振荡摇床振荡过夜；
(6)漂洗液1MW1:称量高氯酸钠140.46g，加入75％乙醇定容至500mL；
(7)漂洗液2MW2:75％乙醇；
(8)洗脱液AE：称量Tris-Base 1.2114g，加入900ml纯水溶解，加入适量NaOH颗粒，搅拌溶解，调pH＝8.0，定容至1L备用；
(9)磁珠：商业化二氧化硅磁珠，浓度为50mg/mL；
(10)蛋白酶K：商业化产品，用纯水溶解，终浓度为20mg/mL。
实施例3采用实施例2的试剂盒提取病毒核酸的效果检测
检测步骤如下：
1以HBV质控品作为DNA病毒代表样本，以HCV质控品作为RNA病毒代表样本，加入阴性的血浆稀释。HBV的终浓度为2000IU/ML，HCV的终浓度为4000IU/ML，作为待测样本备用。
2往提取板加入以下试剂：
第一孔：80ul蛋白酶K，1.6mL待测样本，2mL Buffer MLC，50ul磁珠(按顺序依次加入)；
第三孔：2mL Buffer MW1；
第四孔：2mL Buffer MW2；
第五孔：2mL Buffer MW2；
第六孔：100ul Buffer AE。
3使用中山大学达安基因股份有限公司的全自动核酸提取仪DA3500进行提取，设定以下提取步骤，上机提取。提取完成后，第6孔即为样本所提核酸。
HBV反应体系：
PCR反应液Mix 15ul
DNA模板 10ul
HBV反应程序：
HCV反应体系：
PCR反应液Mix 10ul
DNA模板 15ul
HCV反应程序：
检测结果：扩增曲线如图1和2所示；CT值如下表1所示。
表1 荧光定量PCR检测EB样品提取结果(CT值)
检测结果分析：参见图1、图2和表1，图1为荧光定量PCR检测血浆样品提取结果，由表1和图1、2可以看出，采用实施例2的试剂盒提取的核酸HBV(DNA病毒)/HCV(RNA病毒)，比对照组的病毒提取试剂盒(该对照组试剂盒与实施例2的试剂盒的区别仅在于：1M Tris-HCl的pH为7.3；0.5M EDTA的pH为7.6；裂解液制备时采用的是pH为7.3的1M Tris-HCl和pH为7.6的0.5M EDTA)提取的浓度要高(CT值小)，重复性更好(CV值小)；CV是作为实验试剂重复性体现的重要指标，CV值越小，表明试剂更加稳定。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种病毒核酸提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括Tris-HCl溶液、EDTA溶液、高氯酸钠溶液、漂洗液、裂解液、洗脱液、磁珠和蛋白酶K。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Tris-HCl溶液的浓度为1M，所述EDTA溶液的浓度为0.5M，所述高氯酸钠溶液的浓度为6M。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Tris-HCl溶液、EDTA溶液、洗脱液的pH值为8.0。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述漂洗液包括第一漂洗液和第二漂洗液，所述第一漂洗液为高氯酸钠和乙醇的混合溶液，所述第二漂洗液为质量浓度75％的乙醇溶液。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述第一漂洗液中高氯酸钠的浓度为2M。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液采用以下方法制备：取6M高氯酸钠100mL、1M Tris-HCl 5mL、0.5M EDTA 2mL和吐温-208mL混合，振荡过夜即得。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液为Tris-Base的水溶液，其浓度为0.1M。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁珠为二氧化硅磁珠。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶K的使用浓度为20mg/ml。
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