CN116121237A - 一种磁珠法无醇核酸提取试剂盒及其提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于磁珠法的无醇核酸提取试剂盒及其应用方法，该试剂盒包括裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液、第三洗涤液和洗脱液，可用于病毒核酸提取，也可用于全血、细胞、唾液、组织等样本基因组提取，应用范围广。本发明还提供了采用上述试剂盒提取核酸的方法，首先将样本、磁珠和裂解液混合进行样本裂解液核酸释放的同时，实现磁珠的边捕获结合，然后通过无乙醇、异丙醇等醇类特定的洗涤液进行除蛋白、盐、小分子等杂质，最后将纯的核酸溶解于洗脱液中，用于下游检测。该方法操作简单，整个操作过程不需要使用乙醇、异丙醇等有机试剂。

Description

一种磁珠法无醇核酸提取试剂盒及其提取方法

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，尤其涉及一种磁珠法无醇核酸提取试剂盒及其提取方法。

背景技术

在分子生物学实验中，核酸提取是一项最基本且最重要的环节，核酸提取的质量直接关系到下游核酸检测、生物学研究或其他新产品开发的成败。目前最常用的核酸提取方法是磁珠法和硅胶膜柱式法。硅胶膜柱式法提取获得的核酸纯度高，但是对小片段DNA或RNA提取效率不高，而且不适用于自动化提取流程。磁珠法核酸提取是以超顺磁性氧化硅纳米微球(简称磁珠)为载体，通过磁珠吸附核酸，经过磁性分离和漂洗杂质后，核酸从磁珠表面释放的原理进行核酸提取的方法。该方法不需离心，操作简单，便于高通量、自动化操作，可以使核酸提取效率显著升高，已成为目前新兴的核酸提取技术。

目前核酸提取的过程中最常用的促进磁珠和核酸结合的溶剂以及清洗液中多含有异丙醇和乙醇等易挥发有机溶剂，对于乙醇、异丙醇的使用存在如下问题：(1)醇残留抑制反应：乙醇、异丙醇等醇的残留，对下游检测的酶反应具有较大的抑制作用，从而影响检测结果的准确性；(2)运输问题：乙醇和异丙醇属于易燃易挥发的液体，其蒸气能与空气形成爆炸性混合物，因此洗涤液中含有较高浓度的乙醇或异丙醇造成该试剂的运输不方便，很多试剂厂家为解决运输问题，对于瓶装试剂盒均由客户自备乙醇或异丙醇按照标签试剂量加入到试剂瓶中，给终端客户的使用增加成本和步骤，同时加入试剂的准确性以及试剂的纯度均会对结果产生较大影响；(3)保存问题：含醇类瓶装试剂在使用过程中反复开盖造成醇的挥发，含醇量减少影响提取核酸浓度降低，同时使用预封装试剂当前均采用铝膜对深孔板进行封膜，乙醇的存在随储存时间的延长，铝膜逐渐出现分层，导致客户在使用过程中存在内层膜分离残留至孔上，不利于提取操作，且膜残留造成孔小易导致磁珠在吸附磁珠时蹭到残留的铝膜，增加了提取过程中交叉污染的风险。

对于无醇核酸提取试剂近两年也出现相关报道，如CN109722431A和CN114164207A等两篇专利阐述了对于病毒类小片段样本的试剂进行阐述，而对于复杂样本如全血、唾液、组织等样本类型基因组大片段提取均为进行阐明；CN113462683A报道了适用多种样本核酸提取的无醇清洗液，但其提取试剂盒中含有DTT等有刺激性气味的有毒试剂，因此，针对上述存在的问题，本发明提供一种磁珠法无醇核酸提取试剂盒及其提取方法。

发明内容

针对上述不足，本发明的目的是提供一种磁珠法无醇核酸提取试剂盒及其提取方法。

本发明提供了如下的技术方案：

一种磁珠法无醇核酸提取试剂盒，包括裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液、第三洗涤液以及洗脱液；

所述裂解液包括以下组分：异硫氰酸胍1～3mol/L、盐酸胍1～6mol/L、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10～100mmol/L、醋酸钠0.5～2mol/L、月桂醇聚醚-21 1～10％v/v、Tween 200.5～5％v/v、PEG 1500 5～20％w/v；

所述第一洗涤液包括以下组分：异硫氰酸胍1～4mol/L、Triton X-100 0.5～2％v/v、PEG 1500 5～20％w/v；

所述第二洗涤液包括以下组分：PEG 1500 5～30％w/v、氯化钠50-500mmol/L、HEPES 10-100mmol/L；

所述第三洗涤液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷醋酸盐10～

100mmol/L；

所述洗脱液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷醋酸盐10～50mmol/L、EDTA 1～10mmol/L。

一种磁珠法无醇核酸提取试剂盒的核酸提取方法，包括如下步骤：

S1.一个对全血、血清、血浆、拭子保存液等样本中病毒进行裂解：在1.5ml或2ml离心管中加入200-300μL的样本，再向离心管中加入500μL的裂解液、10-30μL(50mg/ml)磁珠溶液、10-30μL蛋白酶K(10mg/ml)溶液，置于恒温振荡混匀仪上，50-65℃恒温振荡孵育5-15min；

S2.去蛋白洗涤步骤：将步骤S1的离心管放置于磁力架上，上下颠倒冲刷管盖和管壁残留磁珠，然后静置30～60秒至磁珠完全吸附，吸弃液体；将离心管从磁力架上取下，向离心管内加入600～800μL第一洗涤液，振荡混匀1～2min，将离心管放置于磁力架上，上下颠倒冲刷管盖和管壁残留磁珠，然后静置30～60秒至磁珠完全吸附，吸弃液体；

S3.去盐离子洗涤：将离心管从磁力架上取下，向离心管内加入600～800μL第二洗涤液，振荡混匀1～2min，将离心管放置于磁力架上，上下颠倒冲刷管盖和管壁残留磁珠，然后静置30～60秒至磁珠完全吸附，吸弃液体，保持离心管在磁力架上，向离心管缓慢加入600～800μL第三洗涤液，静置10-30秒，吸弃液体；

S4.核酸洗脱：将步骤S3离心管从磁力架上取下，向离心管加入30-100μL洗脱液，移液器吹吸混匀后，置于恒温振荡混匀仪上，55℃振荡孵育5-10min，将离心管放置于磁力架上静置1-2min至磁珠完全吸附后，将核酸溶液转移至新的无酶离心管中，及得核酸溶液，可用于下游检测或保存待用。

结合基于上述提取方法的自动化核酸提取仪使用操作步骤如下：

F1.试剂板准备：将1个试剂盒内含有的6个深孔板分别进行预封装处理，将经过预分装处理的深孔板工位2磁珠预封板颠倒混匀，然后将所有预封装试剂板瞬时离心，甩去封装膜和孔壁的液体后，撕开深孔板封膜；

F2.加入样本：向预封装试剂板工位1裂解液板中加入待提取样本和蛋白酶K；

F3.上机自动提取：将试剂板放入仪器内，安装磁套，选择提取程序，点击运行，即可实现自动化核酸提取；

F4.收集核酸：核酸提取完毕后，取出6个深孔板，其中工位6中的溶液即为核酸溶液，可用于下游检测或保存待用。

所述步骤F1中的6个预封装处理的试剂板如下：

工位1裂解液的深孔板内装入400～600μL裂解液；

工位2磁珠的深孔板内装入400～500μL磁珠溶液；

工位3第一洗涤液的深孔板内装入600～800μL第一洗涤液；

工位4第二洗涤液的深孔板内装入600～800μL第二洗涤液；

工位5第三洗涤液的深孔板内装入600～800μL第三洗涤液；

工位6洗脱液的深孔板内装入50～100μL洗脱液。

本发明的有益效果是：针对上述存在的问题，本发明提供一种磁珠法无醇核酸提取试剂盒及其提取方法，该试剂盒中包含裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液、第三洗涤液和洗脱液，通过多种洗涤液处理可增强蛋白、盐离子、小分子等杂质的去除能力，使其适用范围更广，不仅适用于病毒小片段核酸的提取而且适用于血液、组织、唾液等样本类型基因组DNA较大片段的核酸提取，且本发明试剂中不含有刺激性有毒试剂；

另外本发明的核酸提取流程对于病毒类样本核酸的提取时间再15分钟以内即可完成96例样本核酸提取，大大提高了工作效率；

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1显示了采用本发明试剂盒和对照试剂盒对唾液样本核酸提取后，对核酸片段提取完整度检测，为琼脂糖凝胶凝胶电泳图；

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1：一种全血基因组DNA提取的试剂盒及应用方法

试剂：

裂解液：异硫氰酸胍2mol/L、盐酸胍3mol/L、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐50mmol/L、醋酸钠1mol/L、月桂醇聚醚-21 5％、Tween 20 1％(v/v)、PEG1500 10％(w/v)，溶剂是去离子水。

第一洗涤液：异硫氰酸胍2mol/L、Triton X-100 1％(v/v)、PEG 150020％(w/v)。

第二洗涤液：PEG 1500 20％(w/v)、氯化钠200mmol/L、HEPES 50mmol/L。

第三洗涤液：三羟甲基氨基甲烷醋酸盐20mmol/L。

洗脱液：三羟甲基氨基甲烷醋酸盐10mmol/L、EDTA 1mmol/L。

试剂预封装组成：按照表1所示，在深孔板中加入对应试剂，并使用热封仪将深孔板进行封膜处理。

表1.试剂盒中预封装试剂组成

组成	名称	试剂名称	每孔试剂量
				板1	工位1裂解液	裂解液	500μL
板2	工位2磁珠	磁珠混合液	500μL
				板3	工位3第一洗涤液	第一洗涤液	700μL
板4	工位4第二洗涤液	第二洗涤液	700μL
				板5	工位5第三洗涤液	第三洗涤液	700μL
板6	工位6洗脱液	洗脱液	100μL

实验步骤：

取出预封装试剂板，将工位2磁珠板颠倒混匀数次使磁珠重悬，然后轻甩深孔板使试剂和磁珠集中至深孔板底部，小心撕去铝箔封口膜，避免试剂板振动，防止液体溅出。

在工位1裂解液深孔板中加入200μL抗凝全血样本和20μL蛋白酶K，将加好样本的工位1裂解液深孔板和工位2磁珠、工位3第一洗涤液、工位4第二洗涤液、工位5第三洗涤液、工位6洗脱液等深孔板放入设备对应的位置，插入96孔磁棒套。

运行仪器内对应的自动化提取程序，自动化提取程序如表2所示，

表2.全血基因组DNA自动化提取程序，

自动化提取程序结束后，工位6洗脱液深孔板内的溶液即为核酸溶液。

实施例2：HBV DNA病毒提取和检测(与中科拜尔核酸提取纯化试剂盒(货号：K.BD02S96)进行比对，操作步骤参照说明书)。

试剂配制

裂解液：异硫氰酸胍3mol/L、盐酸胍1mol/L、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐50mmol/L、醋酸钠1mol/L、月桂醇聚醚-21 2％、Tween 20 1％(v/v)、PEG1500 15％(w/v)，溶剂是去离子水。

第一洗涤液：异硫氰酸胍2mol/L、Triton X-100 1％(v/v)、PEG 150020％(w/v)。

第二洗涤液：PEG1500 20％(w/v)、氯化钠300mmol/L、HEPES 50mmol/L。

第三洗涤液：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐20mmol/L。

洗脱液：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10mmol/L、EDTA 1mmol/L。

试剂预封装组成：按照表3所示，在深孔板中加入对应试剂，并使用热封仪将深孔板进行封膜处理。

表3.试剂盒中预封装试剂组成

组成	名称	试剂名称	每孔试剂量
				板1	工位1裂解液	裂解磁珠混合液	500μL
板2	工位3第一洗涤液	第一洗涤液	700μL
				板3	工位4第二洗涤液	第二洗涤液	700μL
板4	工位6洗脱液	洗脱液	70μL

核酸提取：

取出预封装试剂板，将工位2磁珠板颠倒混匀数次使磁珠重悬，然后轻甩深孔板使试剂和磁珠集中至深孔板底部，，小心撕去铝箔封口膜，避免试剂板振动，防止液体溅出。

在工位1裂解液深孔板中加入200μL HBV病毒样本和20μL蛋白酶K，将加好样本的工位1裂解液深孔板和工位3第一洗涤液、工位4第二洗涤液、工位6洗脱液等深孔板放入设备对应的位置，插入96孔磁棒套。

运行仪器内对应的自动化提取程序，自动化提取程序如表4所示。

表4.HBV病毒核酸自动化提取程序，

自动化提取程序结束后，工位6洗脱液深孔板内的溶液即为核酸溶液，病毒基因检测

使用艾康生物乙型肝炎病毒检测试剂盒(探针法)对两组试剂盒所提核酸进行检测，操作方法按照试剂盒说明书进行操作。

实验结果

表5.HBV病毒提取检测平均Ct值

样本	本发明试剂盒	对照试剂盒
			Negative	-	-
Unknow	34.83	34.96
			临界弱阳	34.19	34.25
标准品1	29.35	29.10
			标准品2	25.86	25.84
标准品3	23.64	23.77

实验结论

与对照试剂盒相比，本发明试剂盒针对HBV病毒核酸的提取效率与对照(中科拜尔)有醇提取试剂盒无显著性差异，且有略微提高。

实施例3唾液样本核酸提取

核酸提取：取8支唾液样本，分别使用本发明试剂盒和对照试剂盒T(磁珠法)试剂盒进行核酸提取，对照T试剂盒按照试剂盒使用说明书的步骤进行核酸提取，本发明试剂盒试剂配制按照实施例1成分和含量进行配制，操作步骤如下，

样本裂解：取2ml离心管，向离心管中加入200μL唾液样本、500μL裂解液、20μL蛋白酶K和15μL磁珠，并将离心管放置恒温振荡混匀仪上，55℃恒温振荡孵育15min。

去蛋白杂质：将步骤1的离心管放置于磁力架上，上下颠倒冲刷管盖和管壁残留磁珠，然后静置60秒至磁珠完全吸附，吸弃液体；将离心管从磁力架上取下，向离心管内加入700μL第一洗涤液，振荡混匀1min，将离心管放置于磁力架上，上下颠倒冲刷管盖和管壁残留磁珠，然后静置60秒至磁珠完全吸附，吸弃液体。

去盐离子杂质：将离心管从磁力架上取下，向离心管内加入700μL第二洗涤液，振荡混匀1min，将离心管放置于磁力架上，上下颠倒冲刷管盖和管壁残留磁珠，然后静置60秒至磁珠完全吸附，吸弃液体。保持离心管在磁力架上，向离心管缓慢加入700μL第三洗涤液，静置30秒，吸弃液体。

核酸洗脱：将步骤3离心管从磁力架上取下，向离心管加入70μL洗脱液，移液器吹吸混匀后，置于恒温振荡混匀仪上，55℃振荡孵育5min，将离心管放置于磁力架上静置1～2min至磁珠完全吸附后，将核酸溶液转移至新的无酶离心管中，即得核酸溶液。

核酸检测：

(1)超微量分光光度计检测：本发明试剂盒和对照试剂盒提取的核酸进行超微量分光光度计检测核酸浓度、OD260/280和OD260/230值，检测数据如表6，本发明提取核酸浓度略高于对照试剂盒，OD260/230两组试剂盒提取均大于1.7无显著性差异，OD260/230提取其中3例样本提取小于1.6，因此本发明试剂盒提取纯度高于对照试剂盒。

表6超微量分光光度计检测核酸浓度、OD260/280和OD260/230值

(2)琼脂糖凝胶电泳检测：取两组试剂盒提取的核酸溶液5μL，使用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，其中1-8是本发明提取核酸产物，9-16是对照试剂盒提取产物，结果如图1所示，条带完整清晰明亮，无杂质和断裂。

实施例4HCV RNA病毒提取和检测(与A厂家试剂进行比对，操作步骤参照说明书)

本发明提取试剂盒和方法同实施例2，A厂家试剂盒按照其说明书进行操作，然后使用艾康生物荧光定量PCR丙型肝炎检测试剂盒(探针法)对两组提取核酸进行检测，其扩增Ct如表7所示。

表7.HCV RNA病毒核酸提取检测平均Ct值

样本	本发明试剂盒	对照A试剂盒
			Negative	-	-
Unknow	32.83	33.36
			临界弱阳	30.86	30.89
标准品1	29.35	29.1
			标准品2	25.68	25.58
标准品3	23.64	23.77
			标准品4	20.33	20.48

本发明试剂盒针对HCV RNA病毒核酸的提取效率与对照A含乙醇提取试剂盒无显著性差异。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种磁珠法无醇核酸提取试剂盒，其特征在于，包括裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液、第三洗涤液以及洗脱液；

所述裂解液包括以下组分：异硫氰酸胍1～3mol/L、盐酸胍1～6mol/L、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10～100mmol/L、醋酸钠0.5～2mol/L、月桂醇聚醚-21 1～10％v/v、Tween20 0.5～5％v/v、PEG 1500 5～20％w/v；

所述第一洗涤液包括以下组分：异硫氰酸胍1～4mol/L、Triton X-100 0.5～2％v/v、PEG 1500 5～20％w/v；

所述第二洗涤液包括以下组分：PEG 1500 5～30％w/v、氯化钠50-500mmol/L、HEPES10-100mmol/L；

所述第三洗涤液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷醋酸盐10～100mmol/L；

所述洗脱液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷醋酸盐10～50mmol/L、EDTA 1～10mmol/L。

2.基于权利要求1所述磁珠法无醇核酸提取试剂盒的核酸提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.一个对全血、血清、血浆、拭子保存液等样本中病毒进行裂解：在1.5ml或2ml离心管中加入200-300μL的样本，再向离心管中加入500μL的裂解液、10-30μL(50mg/ml)磁珠溶液、10-30μL蛋白酶K(10mg/ml)溶液，置于恒温振荡混匀仪上，50-65℃恒温振荡孵育5-15min；

S2.去蛋白洗涤步骤：将步骤S1的离心管放置于磁力架上，上下颠倒冲刷管盖和管壁残留磁珠，然后静置30～60秒至磁珠完全吸附，吸弃液体；将离心管从磁力架上取下，向离心管内加入600～800μL第一洗涤液，振荡混匀1～2min，将离心管放置于磁力架上，上下颠倒冲刷管盖和管壁残留磁珠，然后静置30～60秒至磁珠完全吸附，吸弃液体；

S3.去盐离子洗涤：将离心管从磁力架上取下，向离心管内加入600～800μL第二洗涤液，振荡混匀1～2min，将离心管放置于磁力架上，上下颠倒冲刷管盖和管壁残留磁珠，然后静置30～60秒至磁珠完全吸附，吸弃液体，保持离心管在磁力架上，向离心管缓慢加入600～800μL第三洗涤液，静置10-30秒，吸弃液体；

S4.核酸洗脱：将步骤S3离心管从磁力架上取下，向离心管加入30-100μL洗脱液，移液器吹吸混匀后，置于恒温振荡混匀仪上，55℃振荡孵育5-10min，将离心管放置于磁力架上静置1-2min至磁珠完全吸附后，将核酸溶液转移至新的无酶离心管中，及得核酸溶液，可用于下游检测或保存待用。

3.根据权利要求2所述核酸提取方法，其特征在于，结合基于提取方法的自动化核酸提取仪使用操作步骤如下：

F1.试剂板准备：将1个试剂盒内含有的6个深孔板分别进行预封装处理，将经过预分装处理的深孔板工位2磁珠预封板颠倒混匀，然后将所有预封装试剂板瞬时离心，甩去封装膜和孔壁的液体后，撕开深孔板封膜；

F2.加入样本：向预封装试剂板工位1裂解液板中加入待提取样本和蛋白酶K；

F3.上机自动提取：将试剂板放入仪器内，安装磁套，选择提取程序，点击运行，即可实现自动化核酸提取；

F4.收集核酸：核酸提取完毕后，取出6个深孔板，其中工位6中的溶液即为核酸溶液，可用于下游检测或保存待用。

4.根据权利要求2所述核酸提取方法，其特征在于，所述步骤F1中的6个预封装处理的试剂板如下：

工位1裂解液的深孔板内装入400～600μL裂解液；

工位2磁珠的深孔板内装入400～500μL磁珠溶液；

工位3第一洗涤液的深孔板内装入600～800μL第一洗涤液；

工位4第二洗涤液的深孔板内装入600～800μL第二洗涤液；

工位5第三洗涤液的深孔板内装入600～800μL第三洗涤液；

工位6洗脱液的深孔板内装入50～100μL洗脱液。

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