CN117230060B - 用于基因组dna提取的预裂解液、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种用于基因组DNA提取的预裂解液、试剂盒及方法。所述预裂解液包括以下组分：所述预裂解液包括以下组分：1‑20%（v/v）非离子型表面活性剂、0.1‑5%（w/v）离子型表面活性剂、0.1‑2M阳离子盐、1‑100mM缓冲盐，溶剂为水溶液，溶液pH值为5.0‑9.0。用于基因组DNA提取的试剂盒包括预裂解液和DNA吸附载体，还包括裂解液、结合液、洗涤液和洗脱液，该试剂盒可应用于提取动植物样本中基因组DNA。本申请通过一定组分和浓度的预裂解液处理样本时，释放细胞核，吸附载体捕获细胞核，提取细胞核中的DNA，摈弃了细胞质和细胞器等含有大量蛋白类的杂质及RNA，提高了DNA的提取纯度。
Description
技术领域
本申请属于核酸提取领域，具体涉及一种用于基因组DNA提取的预裂解液、试剂盒及方法。
背景技术
DNA是遗传信息的载体和基本遗传物质，它在遗传变异、代谢调控等方面起着重要作用，是分子生物学和基因工程研究的对象，在分子生物学实验中，核酸提取是分子诊断中最基本且最重要的环节。
全血中DNA的提取是遗传性疾病、胎儿产前无创伤诊断、肿瘤和传染性疾病等的早期确诊的重要手段和技术，DNA提取的质量和产量直接影响PCR扩增、分子克隆、限制性内切酶的酶切反应等试验的成败。除了对全血中DNA进行提取分析后，对口腔、鼻腔等部位的DNA提取同样具有重要的意义。对植物DNA的提取有助于后续对植物DNA的结构和功能的研究，理解植物的生命活动和代谢过程，如光合作用、基因表达等。因此对动植物样本中基因组DNA的提取以及DNA提取的质量和产量对后续检测具有重要的意义。
目前市场上关于基因组DNA提取主要有盐析法、有机试剂法、柱提法、磁珠法等。磁珠法因其操作简便、无需高速离心机、可上机操作实现自动化高通量的优势，已成为目前主流的核酸提取技术。
目前现有针对基因组DNA磁珠法提取的原理：样本在裂解液的作用下，核酸和蛋白分离释放在溶液中。然后在结合液的作用下，表面修饰的超顺磁性磁珠可以通过静电、氢键、疏水作用与核酸进行“非特异性的结合”，形成“核酸-磁珠-杂质”复合物。然后在外加磁场的作用下，该复合物可被分离转移。最后再利用核酸与杂质理化上的差异，通过洗涤除杂（主要是非特异性吸附的蛋白和盐类）、然后用洗脱液洗脱磁珠上的核酸，即可达到富集纯化核酸的目的。但是，现有的磁珠法核酸提取存在以下缺点：
缺点一：对于同种样本不同个体来源的差异，比如对于血液样本，随着性别、年龄、饮食习惯、健康状态等，血液组分差异较大，为了保证磁珠法基因组DNA提取效果，往往在裂解步骤就需要高温加热、长时间变性蛋白，同时需要额外添加蛋白酶K来辅助变性，整个提取时间1小时以上。虽然该方法能够实现DNA提取的需求，但是仍然很难消除样本组分的差异带来的干扰，造成的基因组DNA提取结果不稳定，总是存在一定概率的样本提取DNA时，磁珠表现异常、DNA得率偏低、DNA纯度不高等问题。
缺点二：对于不同种类来源的样本，比如人、动物、植物基因组DNA提取，现有的基因组DNA提取试剂盒具有样本提取特异性，不能全面覆盖所有的样本，从而导致试剂盒对不同种类样本的DNA提取存在局限性。
缺点三：现有的磁珠法提取到的核酸是DNA和RNA的混合物（大量测试结果表明，DNA占到整个核酸提取总量的50%-70%），从而导致磁珠对于DNA和RNA的吸附没有区分；并且由于RNA的存在挤占了磁珠表面位点，影响了DNA的吸附效率。目前，主要通过紫外如Nanodrop测定DNA的纯度，然而Nanodrop测定无法区分DNA和RNA，如果对DNA含量进行定量，需要Qubit仪器搭配专门定量DNA的试剂，这就造成在进行下游的NGS检测时，必须使用Nanodrop和Qubit两种仪器进行核酸的检测，耗费时间的同时也增加了成本。
发明内容
基于此，本申请的目的在于提供一种用于基因组DNA提取的预裂解液、试剂盒及方法，样本在该预裂解液的作用下细胞膜被破坏，细胞核释放在溶液中，吸附载体在预裂解液的体系环境下吸附含有基因组DNA的细胞核，通过分离吸附载体达到去除细胞质中RNA及其他杂质的干扰的目的，提高了DNA占比，减少了原有样本基质的干扰，进而提高了提取结果的稳定性；另外，由于吸附载体主要吸附了细胞核，降低了后续的裂解和漂洗压力，可以做到不需要额外添加蛋白酶，整个提取时间可以缩短到约30分钟左右。
为了实现上述目的，本申请提供以下技术方案：
本申请提供了一种用于基因组DNA提取的预裂解液，所述预裂解液包括以下组分：1-20%（v/v）非离子型表面活性剂、0.1-5%（w/v）离子型表面活性剂、0.1-2M阳离子盐、1-100mM缓冲盐，溶剂为水溶液，溶液pH值为5.0-9.0。
进一步的，所述预裂解液包括以下组分：6-10%（v/v）非离子型表面活性剂、1-3%（w/v）离子型表面活性剂、0.5-1%（w/v）离子型表面活性剂、0.5-1M阳离子盐、50-80mM缓冲盐、溶液pH值为5.5-8.5。
进一步的，所述非离子型表面活性剂为Triton X-100、Triton X-114、吐温20、吐温80、NP-40、聚氧乙烯月桂醚、聚乙二醇十六烷基醚、辛基-β-葡萄糖苷和辛基硫代葡萄糖苷的一种或多种组合。
进一步的，所述离子型表面活性剂为CTAB、SDS、3-(3-胆胺丙基)二甲氨基-1-丙磺酸CHAPS和3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸CHAPSO的一种或多种组合。
进一步的，所述缓冲盐选自磷酸盐缓冲体系、柠檬酸盐缓冲体系、Tris缓冲体系，可选为Tris缓冲体系。
进一步的，所述阳离子盐为钠盐或钾盐，所述钠盐为NaCl和/或CH3COONa，所述钾盐为KCl和/或CH3COOK。
进一步的，所述预裂解液还包括1-10%（v/v）异丙醇、1-10%（w/v）PEG、0.1-0.5M胍盐的一种或多种；可选地，异丙醇在预裂解液中的浓度（v/v）可以为1%、2%、4%、6%、8%、10%，或者任意两个数值构成的范围；可选地，PEG在预裂解液中的浓度（w/v）可以为1%、2%、4%、6%、8%、10%，或者任意两个数值构成的范围；可选地，胍盐在预裂解液中的浓度可以为0.1M、0.2M、0.3 M、0.4 M或者0.5M。
可选地，所述PEG为PEG2000、PEG3000、PEG6000、PEG8000和PEG10000的一种或多种组合。
可选地，所述胍盐为盐酸胍、硫氰酸胍和异硫氰酸胍的一种或多种组合。
本申请还提供了一种用于基因组DNA提取的试剂盒，所述试剂盒包括以上所述的预裂解液和DNA吸附载体。
进一步的，所述试剂盒还包括裂解液、结合液、洗涤液和洗脱液；所述结合液为异丙醇和/或0.1-1M的助剂，所述助剂为NaClO4、LiCl和NaCl的一种或多种组合。
进一步的，所述裂解液包括1-6M胍盐、0.1-1%（w/v）所述离子型表面活性剂、0.1-1M尿素、0.1-10%（w/v）精氨酸和1-10%（v/v）所述非离子型表面活性剂；所述裂解液的pH值为5.0-10.0。
可选地，所述裂解液包括2-4M胍盐、0.3-0.5%（w/v）所述离子型表面活性剂、0.3-0.5M尿素、2-5%（w/v）精氨酸和3-6%（v/v）所述非离子型表面活性剂；所述裂解液的pH值为5.5-8.5。
进一步的，所述洗涤液包括洗涤液1和洗涤液2。
进一步的，所述洗涤液1包括1-10%（v/v）所述非离子型表面活性剂、40-80%（v/v）乙醇和0.1-2M盐类。可选地，所述洗涤液1包括1-3%（v/v）所述非离子型表面活性剂、60-70%（v/v）乙醇和0.3-0.6M盐类。
可选地，所述盐类为胍盐、高氯酸盐和氯化盐的一种或多种组合。
进一步的，所述洗涤液2包含50-90%（v/v）乙醇。可选地，所述洗涤液2包含60-80%（v/v）乙醇。
进一步的，所述洗脱液为包含EDTA的Tris-HCl缓冲液。可选地，EDTA在Tris-HCl缓冲液中的浓度为0.1-5mM；所述Tris-HCl缓冲液为1-50mM。可选地，EDTA在Tris-HCl缓冲液中的浓度为1-5 mM；所述Tris-HCl缓冲液为20-50mM。
本申请还提供了以上所述的预裂解液或所述的试剂盒在提取人、动植物样本中基因组DNA的用途。
本申请还提供了一种用于基因组DNA的提取方法，所述方法包括如下步骤：
（1）将以上所述试剂盒中的预裂解液和吸附载体与样本混合处理，分离并收获第一吸附载体；
（2）向步骤（1）的第一吸附载体中加入裂解液，混合孵育后再加入结合液，再次混合处理后分离并收获第二吸附载体；所述裂解液为以上所述试剂盒中的裂解液或者市售裂解液；
（3）将第二吸附载体使用所述洗涤液1和洗涤液2逐次进行清洗后，分离并收获第三吸附载体；
（4）将第三吸附载体经洗脱液洗脱后得到基因组DNA。
进一步的，所述吸附载体包括磁珠，可选地，磁珠包括多分散性磁珠，磁珠的粒径为400-800nm，磁珠的工作浓度为30-100mg/L。
进一步的，所述洗脱液为以上所述试剂盒中的洗脱液。
相对于现有技术，本申请具备如下有益效果：
本申请所述预裂解液包含一定组分和浓度的非离子型表面活性剂、离子型表面活性剂以及盐类等成分，通过各组分之间的协同作用使得该预裂解液裂解细胞膜而不裂解核膜，从而使得基因组DNA依然保留在细胞核内，在本申请所述预裂解液的体系中，吸附载体通过强电荷、高疏水作用吸附细胞核，通过分离吸附载体达到去除细胞质中RNA，及蛋白、脂类等大分子杂质干扰的目的。通过本申请所述试剂盒，可以达到以下优势：
（一）由于提取产物中没有RNA的干扰，DNA在提取产物中的占比达到100%左右。在下游检测时，只需要用紫外分光光度计如Nanodrop测试即可得到准确的DNA含量数据，不需要额外用Qubit仪器搭配专门定量DNA的试剂来定量DNA含量，省时省钱省力。因此，预裂解液在DNA提取试剂盒中发挥了关键的作用。
（二）由于本申请的DNA提取方法吸附细胞核，排除了其他杂质的干扰，因此，本申请所述DNA提取方法对人以及动植物组织样本均能够得到很好的提取效果，结果稳定性良好；对于不同来源样本耐受程度良好，拓宽了该试剂盒的应用范围。
（三）本申请DNA提取试剂盒在裂解步骤不需要高温加热、长时间变性蛋白等操作，也不需要额外添加蛋白酶K来辅助变性，提取时长可控制在不高于30分钟，而现有DNA提取试剂盒的提取时间为1-1.5小时，大大缩短了提取时间。此外，由于不需要额外添加蛋白酶K，也有利于试剂盒的保藏和运输，提高了试剂盒的长期稳定性。
附图说明
图1为采用本申请试剂盒提取的DNA片段的完整性结果图；其中，图中的1、5、6和7分别表示实施例1、实施例5、实施例6和实施例7；
图2为本申请试剂盒与市售试剂盒提取基因组DNA的GAPDH-ct值对比结果图。
具体实施方式
为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是只在于限制本申请。
在本文中，涉及数据范围的单位，如果仅在右端点后带有单位，则表示左端点和右端点的单位是相同的。比如，0.3~0.5M表示左端点“0.3”和右端点“0.5”的单位都是M（Mol/L）。
在本文中，%（v/v）表示体积比，%（w/v）表示重量和体积比。
在本文中，所公开的“范围”可以采用下限和上限的形式来限定，给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的，选定的下限和上限限定了特别范围的边界。这种方式进行限定的范围可以是包括端值或不包括端值的，任一个端值可以独立地被包括或不被包括，并且可以进行任意地组合，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，如果针对特定参数列出了60-120和80-110的范围，理解为60-110和80-120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，且如果还列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1-3、1-4、1-5、2-3、2-4和2-5。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面结合具体实施例详细描述本申请，这些实施例以及对比例用于理解而不是限制本申请。
一、一种用于基因组DNA提取的预裂解液、试剂盒和提取方法
以下实施例1-16以及对比例1-5使用相同的血液样本来源。
实施例1
一种用于基因组DNA提取的预裂解液，所述预裂解液包括以下组分：1%（v/v）非离子型表面活性剂、0.1%（w/v）离子型表面活性剂、0.1M阳离子盐，10mM Tris-HCl缓冲液，溶液pH为7.2；其中，所述非离子型表面活性剂为体积比为1:1的Triton X-100和吐温80；所述离子型表面活性剂为SDS；所述阳离子盐为NaCl。
一种用于基因组DNA提取的试剂盒，所述试剂盒包括本实施例所述的预裂解液、DNA吸附载体、裂解液、结合液、洗涤液和洗脱液。
所述DNA吸附载体为多分散性磁珠，所述磁珠的粒径为400nm，磁珠的终浓度为30mg/L；所述裂解液包括1M盐酸胍、0.1% SDS、0.1M尿素、0.1（w/v）精氨酸和3%（v/v）吐温20，所述裂解液的pH值为7.2；所述结合液为异丙醇。
所述洗涤液包括洗涤液1和洗涤液2，所述洗涤液1包括1% Triton X-100、50%（v/v）乙醇和0.3M NaClO4；所述洗涤液2包含60%（v/v）乙醇；所述洗脱液为包含1mM EDTA的20mM Tris-HCl缓冲液。
一种基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：
1. 取2mL离心管，打开管盖，按序加入500μL预裂液、终浓度为30mg/L磁珠，200μL全血，盖上管盖，涡旋30s，室温静置2min；
2. 瞬离，上磁力架，吸磁90s，打开管盖去除废液；
3. 取下离心管，加入200μL裂解液，盖上管盖，涡旋30s，75℃孵育5min，再打开管盖，加入300μL结合液，涡旋30s，室温静置3min。
4. 瞬离，上磁力架，吸磁90s，打开管盖去除废液；
5. 取下离心管，加入600μL洗涤液1，涡旋30s，瞬离，上磁力架，吸磁60s，打开管盖去除废液；
6. 取下离心管，加入600μL洗涤液2，涡旋30s，瞬离，上磁力架，吸磁60s，打开管盖去除废液；
7. 再次瞬离，上磁力架，去除管底残留液体，室温静置3min；
8. 加入100μL洗脱液，盖上管盖，涡旋30s，56℃孵育10min，上磁力架吸磁2min，取上清转移到新的离心管中，用于下游检测或-20℃保存备用。
实施例2
一种用于基因组DNA提取的预裂解液，所述预裂解液与实施例1的区别在于：所述非离子型表面活性剂为吐温20，所述离子型表面活性剂为3-(3-胆胺丙基)二甲氨基-1-丙磺酸CHAPS。
用于基因组DNA提取的试剂盒以及基因组DNA的提取方法与实施例1相同。
实施例3
一种用于基因组DNA提取的预裂解液，所述预裂解液与实施例1的区别在于：所述非离子型表面活性剂为0.5%（v/v）聚氧乙烯月桂醚和0.5%（v/v）聚乙二醇十六烷基醚；所述离子型表面活性剂包括CTAB，所述阳离子盐为钾盐，所述钾盐为KCl。
用于基因组DNA提取的试剂盒以及基因组DNA的提取方法与实施例1相同。
实施例4
一种用于基因组DNA提取的预裂解液，所述预裂解液包括以下组分：6%（v/v）非离子型表面活性剂、1%（w/v）离子型表面活性剂、0.5M阳离子盐、50mM Tris-HCl缓冲液，溶液pH为5.5；其中，所述非离子型表面活性剂为吐温20；所述离子型表面活性剂为CTAB；所述阳离子盐为NaCl。
一种用于基因组DNA提取的试剂盒，所述试剂盒包括本实施例所述的预裂解液、DNA吸附载体、裂解液、结合液、洗涤液和洗脱液，所述DNA吸附载体为多分散性磁珠，所述磁珠的粒径为500nm，磁珠的终浓度为50mg/L；所述结合液为异丙醇；所述裂解液包括2M盐酸胍、0.3%的SDS、0.3M尿素、2%（w/v）精氨酸、2%（v/v）Triton X-100和3%（v/v）吐温20，所述裂解液的pH值为5.5。
所述洗涤液包括洗涤液1和洗涤液2，所述洗涤液1包括2%吐温20、60%（v/v）乙醇、0.2M盐酸胍和0.4M NaCl；所述洗涤液2包含70%（v/v）乙醇；所述洗脱液为蒸馏水。
一种基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：
1. 取2mL离心管，打开管盖，按序加入300μL预裂液、终浓度为50mg/L磁珠，200μL全血，盖上管盖，涡旋20s，室温静置1min；
2. 瞬离，上磁力架，吸磁60s，打开管盖去除废液；
3. 取下离心管，加入150μL裂解液，盖上管盖，涡旋15s，65℃孵育5min，再打开管盖，加入200μL结合液，涡旋20s，室温静置1min。
4. 瞬离，上磁力架，吸磁60s，打开管盖去除废液；
5. 取下离心管，加入400μL洗涤液1，涡旋30s，瞬离，上磁力架，吸磁40s，打开管盖去除废液；
6. 取下离心管，加入400μL洗涤液2，涡旋30s，瞬离，上磁力架，吸磁40s，打开管盖去除废液；
7. 再次瞬离，上磁力架，去除管底残留液体，室温静置2min；
8. 加入100μL洗脱液，盖上管盖，涡旋20s，50℃孵育8min，上磁力架吸磁2min，取上清转移到新的离心管中，用于下游检测或-20℃保存备用。
实施例5
一种用于基因组DNA提取的预裂解液，所述预裂解液与实施例4的区别在于：所述非离子型表面活性剂为辛基-β-葡萄糖苷；所述离子型表面活性剂为SDS，所述阳离子盐为CH3COONa。
用于基因组DNA提取的试剂盒以及基因组DNA的提取方法与实施例4相同。
实施例6
一种用于基因组DNA提取的预裂解液，所述预裂解液与实施例4的区别在于：所述非离子型表面活性剂为Triton X-100；所述离子型表面活性剂为SDS，所述阳离子盐为NaCl。
用于基因组DNA提取的试剂盒以及基因组DNA的提取方法与实施例4相同。
实施例7
一种用于基因组DNA提取的预裂解液，所述预裂解液包括以下组分：10%（v/v）非离子型表面活性剂、3%（w/v）离子型表面活性剂、1M阳离子盐、80mM Tris-HCl缓冲液，溶液pH为8.5；其中，所述非离子型表面活性剂为体积比为1:1的Triton X-100和NP-40；所述离子型表面活性剂为CTAB；所述阳离子盐为KCl。
一种用于基因组DNA提取的试剂盒，所述试剂盒包括本实施例所述的预裂解液、DNA吸附载体、裂解液、结合液、洗涤液和洗脱液，所述DNA吸附载体为多分散性磁珠，所述磁珠的粒径为700nm，磁珠的终浓度为60mg/L；所述结合液为异丙醇。
所述裂解液包括4M异硫氰酸胍、0.5% SDS、0.5M尿素、5%（w/v）精氨酸和6%（v/v）Triton X-100，所述裂解液的pH值为8.5。
所述洗涤液包括洗涤液1和洗涤液2，所述洗涤液1包括3%吐温20、70%（v/v）乙醇和盐类，所述盐类为0.1M盐酸胍和0.5M NaClO4；所述洗涤液2包含80%（v/v）乙醇；所述洗脱液为包含2mM EDTA的30mM Tris-HCl缓冲液。
一种基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：
1. 取2mL离心管，打开管盖，按序加入500μL预裂液和终浓度为60mg/L磁珠，200μL全血，盖上管盖，涡旋30s，室温静置2min；
2. 瞬离，上磁力架，吸磁90s，打开管盖去除废液；
3. 取下离心管，加入200μL裂解液，盖上管盖，涡旋30s，70℃孵育5min，再打开管盖，加入300μL结合液，涡旋30s，室温静置1-3min。
4. 瞬离，上磁力架，吸磁90s，打开管盖去除废液；
5. 取下离心管，加入500μL洗涤液1，涡旋30s，瞬离，上磁力架，吸磁60s，打开管盖去除废液；
6. 取下离心管，加入500μL洗涤液2，涡旋30s，瞬离，上磁力架，吸磁60s，打开管盖去除废液；
7. 再次瞬离，上磁力架，去除管底残留液体，室温静置3min；
8. 加入100μL洗脱液，盖上管盖，涡旋30s，55℃孵育10min，上磁力架吸磁2min，取上清转移到新的离心管中，用于下游检测或-20℃保存备用。
实施例8
一种用于基因组DNA提取的预裂解液，所述预裂解液与实施例7的区别在于：所述非离子型表面活性剂为NP40；所述离子型表面活性剂为SDS，所述阳离子盐为NaCl。
用于基因组DNA提取的试剂盒以及基因组DNA的提取方法与实施例7相同。
实施例9
一种用于基因组DNA提取的预裂解液，所述预裂解液与实施例7的区别在于：所述非离子型表面活性剂为聚乙二醇十六烷基醚；所述离子型表面活性剂为体积比为1:1的3-(3-胆胺丙基)二甲氨基-1-丙磺酸CHAPS和3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸CHAPSO，所述阳离子盐为CH3COONa。
用于基因组DNA提取的试剂盒以及基因组DNA的提取方法与实施例7相同。
实施例10
一种用于基因组DNA提取的预裂解液，所述预裂解液包括以下组分：20%（v/v）非离子型表面活性剂、5%（w/v）离子型表面活性剂、2M阳离子盐、100mM Tris-HCl缓冲液，溶液pH为9.0；其中，所述非离子型表面活性剂为吐温20；所述离子型表面活性剂为CTAB；所述阳离子盐为NaCl。
一种用于基因组DNA提取的试剂盒，所述试剂盒包括本实施例所述的预裂解液、DNA吸附载体、裂解液、结合液、洗涤液和洗脱液，所述DNA吸附载体为多分散性磁珠，所述磁珠的粒径为800nm，磁珠的终浓度为100mg/L；所述结合液为异丙醇。
所述裂解液包括6M盐酸胍、1% SDS、1M尿素、10%（w/v）精氨酸、4%（v/v）吐温、5%（v/v）Triton X-100，所述裂解液的pH值为9.0。
所述洗涤液包括洗涤液1和洗涤液2，所述洗涤液1包括1%吐温、80%（v/v）乙醇、0.2M LiCl、0.3M NaCl；所述洗涤液2为90%（v/v）乙醇；所述洗脱液为含5mM EDTA的50mMTris-HCl缓冲液。
一种基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：
1. 取2mL离心管，打开管盖，按序加入300-500μL预裂液和终浓度为100mg/L磁珠，200μL全血，盖上管盖，涡旋30s，室温静置1-2min；
2. 瞬离，上磁力架，吸磁90s，打开管盖去除废液；
3. 取下离心管，加入200μL裂解液，盖上管盖，涡旋30s，70℃孵育5min，再打开管盖，加入300μL结合液，涡旋30s，室温静置3min。
4. 瞬离，上磁力架，吸磁90s，打开管盖去除废液；
5. 取下离心管，加入600μL洗涤液1，涡旋30s，瞬离，上磁力架，吸磁60s，打开管盖去除废液；
6. 取下离心管，加入600μL洗涤液2，涡旋30s，瞬离，上磁力架，吸磁60s，打开管盖去除废液；
7. 再次瞬离，上磁力架，去除管底残留液体，室温静置1-3min；
8. 加入100μL洗脱液，盖上管盖，涡旋30s， 60℃孵育10min，上磁力架吸磁1-2min，取上清转移到新的离心管中，用于下游检测或-20℃保存备用。
实施例11
一种用于基因组DNA提取的预裂解液，所述预裂解液与实施例10的区别在于：所述非离子型表面活性剂为吐温80；所述离子型表面活性剂为SDS，所述阳离子盐为CH3COONa。
用于基因组DNA提取的试剂盒以及基因组DNA的提取方法与实施例10相同。
实施例12
一种用于基因组DNA提取的预裂解液，所述预裂解液与实施例10的区别在于：所述非离子型表面活性剂为体积比为1:1的聚氧乙烯月桂醚和辛基硫代葡萄糖苷；所述离子型表面活性剂为3-(3-胆胺丙基)二甲氨基-1-丙磺酸CHAPS，所述阳离子盐为NaCl。
用于基因组DNA提取的试剂盒以及基因组DNA的提取方法与实施例10相同。
以上实施例1-12的实验结果如表1所示。根据现有技术可知，目前主要通过以下指标评估DNA的提取效果：200μL人血液样本，提取产物中OD260/280≥1.7、OD260/230≥1.5、得率为＞5μg，该指标范围内属于理想的DNA提取结果。从表1的结果可知，实施例1-12的DNA提取结果均符合目前行业内对DNA提取的评估指标。另外，从DNA的提取占比（Qubit4.0/Nanodrop）可知，DNA占比约100%，可预估在提取产物中几乎不含有RNA和其它杂质，能够满足后续使用高纯度DNA进行检测的需求。
表1 实施例1-12的DNA提取结果
为了验证提取基因组DNA的完整性，使用毛细管电泳法测定实施例1、实施例5、实施例6、实施例7中提取的DNA，测定结果如图1所示。从图1可以得出，基因组片段长度在标准范围内，片段分布符合预期，因此可以说明提取的基因组片段完整，本申请的DNA提取试剂对DNA完整性没有影响。
表2为对比例1-5对DNA的提取结果，从对比例可知，预裂解液的组分和含量对DNA的提取效果起到重要的作用，当非离子型表面活性剂或离子型表面活性剂的含量超出或低于本申请的保护范围时，均不能达到理想的DNA提取结果；同时对比例5中蛋白酶K的添加极大的降低了DNA的提取效果。
对比例1
对比例1与实施例7的区别在于，所述预裂解液中非离子型表面活性剂为0.3%（v/v）Triton X-100和0.4%（v/v）NP-40。
对比例2
对比例2与实施例7的区别在于所述预裂解液中非离子型表面活性剂为15%（v/v）Triton X-100和15%（v/v）NP-40。
对比例3
对比例3与实施例7的区别在于，所述预裂解液中离子型表面活性剂为CTAB的含量为0.05%（w/v）。
对比例4
对比例4与实施例7的区别在于，所述预裂解液中离子型表面活性剂CTAB的含量为10%（w/v）。
对比例5
对比例5与实施例7的区别在于，所述预裂解液中添加终浓度为2mg/mL的蛋白酶K。
表2 对比例1-5的DNA提取结果
实施例13-16用于分析预裂解液中还包含1-10%（v/v）异丙醇、1-10%（w/v）PEG、0.1-0.5M胍盐的一种或多种对DNA提取效果的影响。从表3的结果可以得出，通过在预裂解液中增加盐酸胍、异丙醇、PEG的一种或多种组合，可以在一定程度上提高DNA的提取得率，并且不影响DNA的提取纯度。
实施例13
实施例13与实施例1的区别在于，所述预裂解液中还含有0.2M盐酸胍。
实施例14
实施例14与实施例1的区别在于，所述预裂解液中还含有2%异丙醇。
实施例15
实施例15与实施例1的区别在于，所述预裂解液中还含有2% PEG8000。
实施例16
实施例16与实施例1的区别在于，所述预裂解液中还含有2%异丙醇和0.2M盐酸胍。
表3 预裂解液中添加不同组分对DNA提取效果的影响
实施例17-21用于分析结合液异丙醇中添加或不添加不同助剂（NaClO4、LiCl、NaCl或胍盐）对提取效果的影响，使用的是相同来源的血液样本，试剂盒的基础配方为实施例7使用的试剂盒配方。助剂预先用蒸馏水进行溶解，助剂溶液与异丙醇的体积比为1:2.3。
提取结果如表4所示，从表4中得出，添加NaClO4、LiCl或NaCl后能不同程度的提高DNA的提取得率，而添加盐酸胍降低了DNA的提取得率，从而说明了并不是本领域任意常规的组分都适用于与异丙醇复配作为本申请试剂盒的结合液。由于前述实施例已经验证了预裂解液能够提高DNA的提取纯度，因此，实施例18-21在结合液中添加不同助剂不影响DNA的提取纯度。
实施例17
实施例17为使用实施例7的试剂盒配方和方法提取人全血中DNA。
实施例18
实施例18与实施例17的区别在于，在结合液中添加了0.8M NaClO4。
实施例19
实施例19与实施例17的区别在于，在结合液中添加了0.6M LiCl。
实施例20
实施例20与实施例17的区别在于，在结合液中添加了0.5M NaCl。
实施例21
实施例21与实施例17的区别在于，在结合液中添加了0.3M盐酸胍。
表4 结合液中添加不同助剂对DNA提取效果的影响
实施例22和实施例23用于分析不同洗涤操作对DNA提取效果的影响，使用的是相同来源的血液样本，试剂盒的配方为实施例7使用的试剂盒配方。提取结果如表5所示，从表5中得出，采用洗涤液1和洗涤液2逐次进行洗涤的方式能够提高DNA的提取得率，使用洗涤液2进行两次洗涤获得DNA得率相对较低。从而说明洗涤液1在杂质的洗涤步骤中具有重要的作用，洗涤液1和洗涤液2只有进行良好的互配才能达到理想的提取效果。
实施例22
实施例22与实施例7的试剂盒配方和提取方法相同。
实施例23
实施例23与实施例22的区别在于，在洗涤操作中，使用洗涤液2进行两次洗涤。
表5 不同洗脱操作对DNA提取效果的影响
二、本申请所述预裂解液配合不同厂家市售裂解液对DNA提取效果的影响
使用同一来源的血液样本，测试本申请实施例7所述试剂盒、以及将实施例7中的裂解液分别替换成市售裂解液1和市售裂解液2后的试剂盒对该样本进行DNA提取结果的影响（不加蛋白酶K），提取方法均与实施例7相同。DNA提取结果如表6所示，从表6中可以得出，本申请试剂盒与替换成市售裂解液的试剂盒相比，DNA的提取得率有所降低，但是DNA的占比均接近100%的水平。因此，本申请的预裂解液配合现有市售的裂解液也能够起到良好的DNA提取效果。
表6 本申请所述裂解液配合不同厂家的裂解液对DNA提取效果的影响
三、与市售DNA提取试剂盒的对比分析
将样本1-4（内部编号）作为四种不同样本，以市售两款一步法DNA提取试剂盒作为对照，使用实施例7的DNA提取试剂盒以及提取方法与其进行对比（市售试剂盒的DNA提取方法按说明书进行操作），测定DNA得率和纯度，结果如表7所示；并用PCR法检测提取的DNA的ct值，结果如图2所示，图2的结果反应出来的DNA含量与Nanodrop和Qubit4.0检测结果相一致。从表7中可以得出，市售两款DNA提取试剂盒的DNA占比均低于90%，从而得出，使用市售两款DNA提取试剂盒提取的DNA样本中含有较高浓度的RNA，本申请试剂盒明显优于市售的两款试剂盒。
表7 不同DNA提取试剂盒提取DNA结果对比
四、不同样本体积对DNA提取结果的影响
采用实施例7制备的DNA提取试剂盒以及提取方法，使用样本5测试不同体积的样本对DNA提取结果的影响，检测结果如表8所示，从表8中可以得出，本申请检测试剂盒适用于100-400μL的样品分析。
表8 不同样本体积的基因组DNA提取结果
五、不同样本检测结果分析
为了检测本申请试剂盒对不同样本检测结果的影响，使用实施例7制备的DNA提取试剂盒以及提取方法测试不同人来源的新鲜血与陈旧血的DNA提取结果，结果如表9所示。从表9中得出，针对不同人源的新鲜血和陈旧血，本申请的试剂盒均能得到理想的DNA提取得率和较高的DNA占比，从而说明本申请试剂盒的检测结果不受不同人群以及血液样本状态的影响。
表9 不同新鲜程度的血液基因组DNA提取结果
六、加速老化实验
使用实施例7制备的DNA提取试剂盒以及提取方法，将试剂盒放置45℃烘箱中连续加速老化一个月后，测试加速老化后的试剂对样本14中DNA提取结果的影响，如表10所示。从表10中可以得出，试剂盒中的各组分经过加速老化后，仍然能够保持稳定的检测结果。
表10 加速老化后的测试结果
七、提取唾液样本中的基因组DNA
使用实施例7制备的DNA提取试剂盒以及提取方法对唾液样本中的基因组DNA进行提取，同时以市售DNA提取试剂盒3作为对照，对比两种试剂盒对唾液基因组DNA的提取效果。提取结果如表11所示，从表1可以得出，本申请试剂盒对唾液中基因组DNA的提取能够达到较高的得率和纯度，明显优于市售DNA提取试剂盒3的提取效果。
表11 对唾液样本基因组DNA的提取结果
本申请所述试剂盒同样分析了对动物组织样本以及植物组织样本的DNA提取结果，首先通过本领域常规的技术手段对相应的组织样本进行前处理后，再使用本申请的试剂盒对处理后的样本进行DNA提取，同样能够得到较高的DNA提取得率和DNA纯度。
综上所述，本申请DNA提取试剂盒与市售DNA提取试剂盒相比，由于预裂解液在DNA提取中的作用，使得DNA提取纯度大幅提高，极大的降低了提取产物中RNA的含量，从而避免了RNA的存在对后续高纯度DNA检测要求的影响。同时，本申请试剂盒能够适用不同体积、不同来源样本的检测，检测结果稳定，并且具有较高的产品稳定性。除此之外，还适用于人、动植物组织等不同类型样本的检测，拓宽了本申请试剂盒的应用范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (8)
1.一种用于基因组DNA提取的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括预裂解液、裂解液、结合液、洗涤液、洗脱液和DNA吸附载体；所述试剂盒不含有蛋白酶k；
其中，所述预裂解液由以下组分组成：1-20%v/v非离子型表面活性剂、0.1-5%w/v离子型表面活性剂、0.1-2M阳离子盐、1-100mM缓冲盐，溶剂为水溶液，溶液pH值为5.0-9.0；所述阳离子盐为钠盐或钾盐，所述钠盐为NaCl和/或，所述钾盐为KCl和/或/>；
所述DNA吸附载体是磁珠。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述非离子型表面活性剂为Triton X-100、Triton X-114、吐温20、吐温80、NP-40、聚氧乙烯月桂醚、聚乙二醇十六烷基醚、辛基-β-葡萄糖苷和辛基硫代葡萄糖苷的一种或多种组合；和/或
所述离子型表面活性剂为CTAB、SDS、3-(3-胆胺丙基)二甲氨基-1-丙磺酸CHAPS和3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸CHAPSO的一种或多种组合。
3. 根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述预裂解液还包括1-10%v/v异丙醇、1-10%w/v PEG和0.1-0.5M胍盐的一种或多种组合；和/或
所述PEG为PEG2000、PEG3000、PEG6000、PEG8000和PEG10000的一种或多种组合；和/或
所述胍盐为盐酸胍、硫氰酸胍和异硫氰酸胍的一种或多种组合。
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述结合液为异丙醇和/或0.1-1M的助剂，所述助剂为、LiCl和NaCl的一种或多种组合。
5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液包括1-6M胍盐、0.1-1%w/v权利要求2所述的离子型表面活性剂、0.1-1M尿素、0.1-10%w/v精氨酸和1-10%v/v权利要求2所述的非离子型表面活性剂；所述裂解液的pH值为5.0-10.0。
6.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液包括洗涤液1和洗涤液2，所述洗涤液1包括1-10%v/v权利要求2所述的非离子型表面活性剂、40-80%v/v乙醇和0.1-2M盐类，所述盐类为胍盐、高氯酸盐和氯化盐的一种或多种组合；所述洗涤液2包含50-90%v/v乙醇；所述洗脱液为蒸馏水或包含0.1-5mM EDTA的1-50mM Tris-HCl缓冲液。
7.权利要求1-6任一项所述的试剂盒在提取人、动植物样本中基因组DNA的用途。
8.一种基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）将权利要求 1-6中任一项所述的试剂盒中的预裂解液和DNA吸附载体与样本混合处理，分离并收获第一吸附载体；
（2）向步骤（1）的第一吸附载体中加入裂解液，混合孵育后再加入权利要求1-6任一项所述的试剂盒中的结合液，再次混合处理后分离并收获第二吸附载体；所述裂解液为权利要求1-6任一项所述的试剂盒中的裂解液或者市售裂解液；
（3）将第二吸附载体使用权利要求6中所述的试剂盒中的洗涤液1和洗涤液2逐次进行清洗后，分离并收获第三吸附载体；
（4）将第三吸附载体经权利要求1-6中任一项所述的试剂盒中的洗脱液洗脱后得到基因组DNA。
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