CN105039306A - 一种唾液保护剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物学领域，具体涉及一种唾液保护剂及其制备与应用。每1000ml所述唾液保护剂中含有：三羟甲基氨基甲烷10~50mmol；乙二胺四乙酸和/或乙二胺四乙酸钠0.5~20mmol；硫酸铵200~1000mmol；葡萄糖1~50mmol。将唾液保存到本发明的唾液保护剂中，前60天几乎没有变化，DNA仍然完整，没有明显的降解；6个月后仍然如此，12个月后，DNA完整性依然如故。本发明的唾液保护剂极为有效的保存了唾液样品，保证了样品的完整性和长期的稳定性。

Description

一种唾液保护剂

技术领域

本发明涉及生物学领域，具体涉及一种唾液保护剂及其制备与应用。

背景技术

在生物学领域，血液等体液样本的DNA提取在分子生物学和基因组学及医学检测等领域占有重要的地位。通常用于PCR扩增或检测的DNA是从抗凝血液中提取的，但血液保存长时间容易结块，另外采集血液也会对生物体造成一定的创伤并且还要专业人士才能安全采集血液，因此血液样品DNA来源限制了其大范围的应用。

人体唾液是含有人体细胞的体液，采集简单方便，高效同时又无创伤，是理想的体液样本，适合大范围取样。但唾液成分主要有水、口腔黏膜细胞、细菌、唾液淀粉酶、粘性糖等物质，成分复杂，不易长时间保存。防止其腐败，保存其含的DNA完整性显得尤为重要。现有技术主要是通过棉签擦拭口腔来获得口腔黏膜细胞，这种方式得到的样品保存时间短，样品量少，需要低温保存，这位采样，保存带来不便。

目前的唾液保存试剂主要是：将唾液和保护剂按照一定比例混匀，保存。然后在不同时间节点提取唾液DNA，质检DNA，检测其浓度，纯度和完整性。

现在市场上的保护剂成分复杂，有的含有镁离子——核酸酶激活剂，不利于DNA的稳定性和完整性的保存；有的含有蛋白质变性剂如异硫氰酸胍——使得蛋白质变性，可以抑制酶的活性，但同时也裂解了细胞，释放DNA，使得DNA处于游离状态，不利于DNA的完整性保存。

本发明保护了细胞的完整性，保存一定时间的细胞仍然可以复活，可以扩大培养；保护DNA长期不被降解，保证了DNA的完整性。而用于基因检测的DNA首先应保证纯度和完整性，如果DNA发生断裂等损伤，则会直接影响到PCR等后续试验，进而影响分析结果的准确性；另外唾液保存液作为唾液DNA的保存介质，也存在被氧化和微生物污染的风险。这些微生物还可能促进DNA加速降解，破坏DNA的完整性，同时唾液被微生物污染后，导致由此提取的DNA不纯，而最终导致DNA的完整性和纯度不能得到保证，进而导致后续试验的可信度大大降低。综上，研究开发一种保存效果好、保存方便的人体唾液样本保存用保存液具有十分重要的意义。

发明内容

针对现有技术中所存在的缺陷，本发明的目的在于，提供一种唾液保护剂，以长时间地保存所采集到的唾液样本。

本发明的另一目的在于，提供所述唾液保护剂的制备方法及其应用。

本发明的再一目的在于，提供一种延长唾液保存时间的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一方面提供了一种唾液保护剂，每1000ml所述唾液保护剂中含有：三羟甲基氨基甲烷10～50mmol；乙二胺四乙酸和/或乙二胺四乙酸钠0.5～20mmol；硫酸铵200～1000mmol；葡萄糖1～50mmol。

优选地，每1000ml所述唾液保护剂中含有：三羟甲基氨基甲烷20mmol；乙二胺四乙酸和/或乙二胺四乙酸钠2mmol；硫酸铵500mmol；葡萄糖10mmol。

当乙二酸乙胺和硫酸铵的浓度高于最大值时，会影响唾液保存效果。具体的，所保存的唾液样本在提取DNA后，在做PCR时会影响PCR扩增效率。

本发明第二方面提供了一种制备所述唾液保护剂的方法，包括步骤：称取各组分，加入至去离子水中，溶解即可。

本发明的第三方面提供了所述唾液保护剂在保存唾液中的用途。

优选地，所述用途为将所述唾液保护剂用于保存唾液样本以延长唾液样本的保存时间。

本发明的第四方面提供了一种保存唾液样本的方法，包括步骤：将采集的唾液样本放入所述唾液保护剂中保存。

本发明的第五方面还提供了一种延长唾液样本保存时间的方法，包括步骤：将采集的唾液样本放入前述唾液保护剂中保存。

优选地，保存时，将采集的唾液样本与所述唾液保护剂以体积比1:1混合即可。

本发明的有益效果在于：

(1)采用本发明的唾液保护剂保存唾液样本，保护剂成分可迅速渗透进细胞中，固定细胞，保存细胞活性，并极速抑制核酸酶的活性保证核酸的完整性。

(2)采用本发明唾液保护剂来保存唾液，可将保护条件范围拓宽，室温保存可长达12个月以上，低温可长期保存，42℃可保存72小时以上。

(3)将唾液保存到本发明的唾液保护剂中，前60天几乎没有变化，DNA仍然完整，没有明显的降解；6个月后仍然如此，12个月后，DNA完整性依然如故。本发明的唾液保护剂极为有效的保存了唾液样品，保证了样品的完整性和长期的稳定性。

附图说明

图1：不同时间节点提取的DNA电泳图谱。

图2：PCR扩增后电泳图及扩增结果。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。

实施例1唾液保护剂配制

按照下列表格中的配方，将各组分溶解于蒸馏水中，配制唾液保护剂，并调整PH值至7.5～8.5。其中，试剂均采用化学纯。

	三羟甲基氨基甲烷	乙二胺四乙酸	硫酸铵	葡萄糖
					配方1	20mmol/L	2mmol/L	500mmol/L	10mmol/L
配方2	10mmol/L	0.5mmol/L	200mmol/L	1mmol/L
					配方3	50mmol/L	20mmol/L	1000mmol/L	50mmol/L
配方4	40mmol/L	10mmol/L	800mmol/L	30mmol/L

实施例2采集唾液样本并质检

1.将采集的唾液样本混合，作为样品；

2.将样品和实施例1制备的唾液保护剂按1:1的体积比例混合；

3.分装，贴标签，不同条件保存备用；

4.在不同时间节点用组织提取试剂盒提取保存的唾液DNA；

5.用Nanodrop质检样品DNA的浓度和纯度，电泳质检DNA的完整性。

6.目的基因PCR扩增，PCR产物测序检测。

实施例3保存效果分析

样品信息：样品来源，LQ和LSB是2014年4月15日保存的两个人的唾液样品，各7.5ml，编号是140415LQ和140415LS；另外样品由公司同事于2014年4月21日捐献，混合后分装9管，分别标上日期和编号:14042101—14042109，每管样品体积为7.5ml；14042101-14042103是唾液样品和水按等比混合保存，14042104-14042106是从市场买的保护剂(产品标准号：YZB/闽夏0022-2013)和唾液样品混合保存，14042107-14042109是本发明实施例1中制备的保护剂和唾液等比保存。试验计划和实施监控如表1。在不同的时间节点如下表，用同一种组织提取试剂盒提取唾液样品的DNA，并定量，电泳质检，部分定量结果和电泳图如表2和图1。将第一个月提取的样品DNA进行PCR并测序。用试剂盒提取的DNA，取2ul在1％的琼脂糖胶中电泳，电泳图如图1所示，H1、H2是保存在水中；ZS1、ZS2是保存在买来的保护剂中；MJ1、MJ2、LQ和LSB是保存在本发明保护剂中。LQ和LSB是预实验样品，是从20140415保存。以2014年5月21日和2014年5月20日提取的样品DNA为模板进行酒精基因位点PCR检测，PCR扩增结果如图2所示。与市场上某一正在销售的保护剂相比，更利于下游试验，由表2和图1也可以看出来采用本发明唾液保护剂保存的唾液样品，DNA提取得率高，降解少。

由此可见，将唾液保存到本发明的唾液保护剂中，前60天几乎没有变化，DNA仍然完整，没有明显的降解；6个月后仍然如此，12个月后，DNA完整性依然如故。本发明的唾液保护剂保存唾液样本，保护剂成分可迅速渗透进细胞中，固定细胞，保存细胞活性，并极速抑制核酸酶的活性保证核酸的完整性。另外本发明保存唾液条件范围宽，室温保存可长达12个月以上，低温可长期保存，42℃可保存72小时以上。本发明的唾液保护剂极为有效的保存了唾液样品，保证了样品的完整性和长期的稳定性。此外，本发明的发明人还通过实验发现，当唾液保护剂中的乙二酸乙胺高于20mmol/L和硫酸铵的浓度高于1000mmol/L，提取DNA后，在做PCR时会影响PCR扩增效率。需要说明的是，乙二胺四乙酸可以用乙二胺四乙酸钠代替。

表1.样品试验计划与实施监控表

注：“∨”表示已经用试剂盒提取了保存唾液的DNA；“×”表示没有提取唾液DNA。

表2.不同时间节点提取的DNA定量结果

编号	试验编号	保存编号	定量仪器	定量时间	浓度ng/ul	A260	A280	A260/280
									1	H1	14042101	NanoDrop	2014/4/21	48.9	0.978	0.555	1.76
2	H2	14042102	NanoDrop	2014/4/21	52.3	1.045	0.583	1.79
									3	ZS1	14042104	NanoDrop	2014/4/21	42.4	1.049	0.593	1.77
4	ZS2	14042105	NanoDrop	2014/4/21	42.6	0.853	0.462	1.84
									5	MJ1	14042107	NanoDrop	2014/4/21	54.3	0.926	0.5	1.85
6	MJ2	14042108	NanoDrop	2014/4/21	57.3	0.926	0.513	1.81
									7	LQ	140415LQ	NanoDrop	2014/4/21	54.8	0.875	0.49	1.79
8	LSB	140415LSB	NanoDrop	2014/4/21	64.3	0.846	0.462	1.83
									1	H1	14042101	NanoDrop	2014/5/21	49.9	0.991	0.557	1.78
2	H2	14042102	NanoDrop	2014/5/21	50.3	1.012	0.559	1.81
									3	ZS1	14042104	NanoDrop	2014/5/21	41.4	1.022	0.584	1.75
4	ZS2	14042105	NanoDrop	2014/5/21	41.6	0.887	0.496	1.79
									5	MJ1	14042107	NanoDrop	2014/5/21	52.3	0.932	0.527	1.77
6	MJ2	14042108	NanoDrop	2014/5/21	56.3	0.923	0.527	1.75
									7	LQ	140415LQ	NanoDrop	2014/5/21	53.8	0.887	0.496	1.79
8	LSB	140415LSB	NanoDrop	2014/5/21	62.3	0.865	0.475	1.82
									1	H1	14042101	NanoDrop	2014/8/21	48.1	0.886	0.492	1.80
2	H2	14042102	NanoDrop	2014/8/21	51.4	0.991	0.527	1.88
									3	ZS1	14042104	NanoDrop	2014/8/21	40.4	1.033	0.571	1.81
4	ZS2	14042105	NanoDrop	2014/8/21	42.7	0.883	0.493	1.79
									5	MJ1	14042107	NanoDrop	2014/8/21	55.3	0.799	0.457	1.75
6	MJ2	14042108	NanoDrop	2014/8/21	55.9	0.806	0.469	1.72
									7	LQ	140415LQ	NanoDrop	2014/8/21	53.3	0.863	0.488	1.77
8	LSB	140415LSB	NanoDrop	2014/8/21	60.3	0.798	0.427	1.87
									1	H1	14042101	NanoDrop	2015/4/21	47.8	0.993	0.552	1.80
2	H2	14042102	NanoDrop	2015/4/21	49.9	1.012	0.572	1.77
									3	ZS1	14042104	NanoDrop	2015/4/21	41.5	1.035	0.578	1.79
4	ZS2	14042105	NanoDrop	2015/4/21	41.6	0.882	0.469	1.88
									5	MJ1	14042107	NanoDrop	2015/4/21	56.9	0.789	0.456	1.73
6	MJ2	14042108	NanoDrop	2015/4/21	56.7	0.951	0.543	1.75
									7	LQ	140415LQ	NanoDrop	2015/4/21	53.9	0.894	0.481	1.86
8	LSB	140415LSB	NanoDrop	2015/4/21	61.5	0.864	0.485	1.78

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (8)

1.一种唾液保护剂，每1000ml所述唾液保护剂中含有：三羟甲基氨基甲烷10～50mmol；乙二胺四乙酸和/或乙二胺四乙酸钠0.5～20mmol；硫酸铵200～1000mmol；葡萄糖1～50mmol。

2.根据权利要求1所述的唾液保护剂，其特征在于，每1000ml所述唾液保护剂中含有：三羟甲基氨基甲烷20mmol；乙二胺四乙酸和/或乙二胺四乙酸钠2mmol；硫酸铵500mmol；葡萄糖10mmol。

3.一种制备如权利要求1或2所述唾液保护剂的方法，包括步骤：称取各组分，加入至去离子水中，溶解即可。

4.如权利要求1或2所述唾液保护剂在保存唾液中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述用途为将所述唾液保护剂用于保存唾液样本以延长唾液样本的保存时间。

6.一种保存唾液样本的方法，包括步骤：将采集的唾液样本放入如权利要求1或2所述唾液保护剂中保存。

7.一种延长唾液样本保存时间的方法，包括步骤：将采集的唾液样本放入如权利要求1或2所述唾液保护剂中保存。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将采集的唾液样本与所述唾液保护剂以体积比1：1混合即可。