CN110699429B - 一种尿液dna提取保存液、尿液保存管、提取试剂盒和提取方法 - Google Patents
一种尿液dna提取保存液、尿液保存管、提取试剂盒和提取方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及核酸提取方法，尤其涉及一种尿液DNA提取保存液、尿液保存管、提取试剂盒和提取方法。一种尿液DNA提取保存液，该保存液由以下成分构成：0.10‑0.50MEDTA；20‑30%甲醇；0.20‑1.0%SDS；1.0‑5.0%冰醋酸；余量为水；pH8.5‑9.5，上述的百分比为质量百分比。该保存液可以常温保存尿液，既可以减少DNA，保证DNA提取的质量或产量，避免了采用低温设备，有利于尿液DNA检测的推广应用。
Description
技术领域
本申请涉及核酸提取方法，尤其涉及一种尿液DNA提取保存液、尿液保存管、提取试剂盒和提取方法。
背景技术
核酸提取是各种分子生物学检测方法的基础，高效完整地提取DNA是PCR扩增、文库构建、测序等工作的基础。除组织器官样本外，分子生物学检测中最常用的离体样本为血液样本，但采血一方面需要专业人员使用无菌采血设备，成本和复杂程度较高，另一方面采血会给患者带来直接的疼痛和恐惧，受到很多人的排斥；由于以上原因，以血液样本进行分子生物学检测在许多情形下，特别是大范围筛查或鉴定中有诸多不便。有必要开发使用容易获取的样本，如头发、唾液、尿液等提取DNA用于分子生物学检测的方法。
尿液于肾脏生成，人体在新陈代谢过程中产生的绝大多数代谢终产物，通过泌尿系统以尿的形式排出体外。尿液中96％以上是水分，同时包含无机盐类、糖类、蛋白质、尿酸及尿素等人体代谢终产物。在一般膳食情况下，24小时排出的溶质为47～65克，其中尿素占二分之一，氯化钠占四分之一，其余四分之一包括多种有机物和无机物成分。正常人类尿液一般呈弱酸性(pH＝6)，由于多种原因(如饮食差异)pH值变化范围可达5.4～8.4。尿液中可检见少量细胞成分，如白细胞、红细胞、上皮细胞、吞噬细胞等。因此，尿液可以作为提取DNA用于分子生物学检测的方法，但是尿液中含有能破坏细胞内细胞器以及降解核酸的尿素、尿酸等成分，导致尿液保存时长对检测结果有直接影响。故对尿液类检材应尽量取较大体积进行提取、尽快纯化处理，以防检材发生破坏和降解。室温储存的尿液样本随时间延长，室温利于细菌等微生物的滋生，其分泌的核酸酶能引起DNA链发生断裂、降解，从而影响DNA提取的质量或产量。
2012年张素华(Zhang S H，Zhao S M，Zhao Z M，et a1.Genotyping of urinarysamples stored with EDTA for，forensicapplications[J].Genet Mol Res，2012，1 1(3)：3007-12.)提出用不同的最终浓度的EDTA(0，10，和40mM)加入中国男性和女性的尿液并保存于-80℃30天。提取DNA并用Goldeneye 20A Kit扩增检测STR位点。实验结果表明，加入EDTA可影响尿中DNA的稳定性。添加了10mM及40mM EDTA的女性尿液，STR位点的平均检出率达到95％。对于男性尿液样本，加入40mMEDTA保存尿DNA的STR基因座检出率明显高于用10mM。结果表明，最适合用于中国人尿液样本保存的EDTA浓度是40mM。但是显然-80℃低温保存，需要有专门尿液保存设备，不利于尿液DNA检测的推广应用。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本申请的目的是提供一种尿液DNA提取保存液，该保存液包括EDTA、甲醇、SDS和冰醋酸，该保存液可以常温保存尿液，既可以减少DNA，保证DNA提取的质量或产量，避免了采用低温设备，有利于尿液DNA检测的推广应用。
为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种尿液DNA提取保存液，该保存液由以下成分构成：0.10-0.50MEDTA；20-30％甲醇；0.20-1.0％SDS；1.0-5.0％冰醋酸；余量为水；pH8.5-9.5，上述的百分比为质量百分比。
作为最优选，该尿液保存液包括：0.25MEDTA，25％甲醇，0.5％SDS，2％冰醋酸，pH9。
另外，本申请还公开了一种尿液保存管，该保存管含有所述的保存液。
另外，本申请还公开了一种尿液DNA提取试剂盒，该试剂盒包括裂解液、结合液、洗涤液I、洗涤液II和洗脱液，该试剂盒还包括含有所述的保存液的保存管。
作为优选，所述的裂解液包括0.10-0.30MTris-HCl；10-20mMEDTA；0.2-1.0MKCl；1.0-5.0MGuHcl；0.2-1.0％SDS；pH8.0-9.0，上述的百分比为质量百分比。
作为优选，结合液选用70-90％异丙醇，pH7.0-8.0。
作为优选，洗涤液I包括1.0-5.0MGuHCl，5-20mMTris，40-60％乙醇；pH7.5-8.5；洗涤液II包括5-20mMTris，75-85％乙醇；pH7.0-8.0。
作为优选，洗脱液包括5-20mMTris，0.05-0.20mMEDTA；pH8.5-9.5。
作为优选，该试剂盒包括：
1)尿液保存液：0.25MEDTA，25％甲醇，0.5％SDS，2％冰醋酸，pH9；
2)裂解液：0.2MTris-HCl，15mMEDTA，0.5MKCl，3MGuHcl,0.5％SDS，pH8.5；
3)结合液：80％异丙醇，pH7.5；
4)洗涤液I：3MGuHCl，10mMTris，50％乙醇，pH8.0；
5)洗涤液II：10mMTris，80％乙醇，pH7.5；
6)洗脱液：10mMTris，0.1mMEDTA，pH9.0。
另外，本申请还公开了一种尿液DNA提取方法，其特征在于，该方法采用所述的试剂盒提取。
作为优选，该方法包括以下的步骤：
1)将尿液保存管中的尿液12000rpm离心10min；
2)弃上清留沉淀；
3)沉淀中加入300μl的裂解液，10ulEnhancer，55℃震荡10min；
4)加入800ul异丙醇，10ul磁珠，垂直混匀仪上混匀10min；
5)将磁珠用WashI洗1次；
6)WashII洗2次；
7)洗脱液洗脱，DNA溶液用于检测或-20℃保存。
本申请由于采用了上述的技术方案，具有以下特点：
1)保存液内特殊细胞保护剂能延长尿液保存时间，尿液离体后立即得到保护，确保了基因的完整性，常温保存，避免了采用低温设备，有利于尿液DNA检测的推广应用；
2)操作简便、安全:裂解液裂解效果快速稳定，常温下即可将样本核酸释放出来，同时对释放出的DNA进行结合；省时省力，提高效率，便于上机操作；操作简单，整个提取过程，约20分钟，适合大规模样品处理，操作方便。
2)样品用样最少、得率高:本试剂盒仅lOmL尿液样本，即得到可得到高质量的DNA样品；既适用于手动提取，也能在微孔板中以自动化的方式配套核酸提取仪使用，提取纯度高且操作简便安全，有效避免尿液提取过程中易降解，提取质量差的问题；
3)提取所得核酸完整:本试剂盒对尿液样品不加任何处理，无需离心、浓缩，提取合算包含了尿液中的游离核酸和尿液中脱落在细胞内的核酸，最大限度地保证了样品的完整性。
4)所提取的核酸纯度高:与磁珠相结合，提取的DNA浓度、纯度很高，可直接用于下游实验；本试剂盒所提取的核酸可直接用于PCR、DNA甲基化鉴检测等下游实验。
5)安全无寄:本试剂盆中所用试剂及装置对人体无毒，无腐蚀性和刺激性气味。
附图说明
图1为四人尿液样本提取的DNA。
图2为尿液加保存液常温放置1d、7d、14d的样本DNA。
具体实施方式
主要试剂和仪器
仪器：离心机、水浴锅、垂直混匀仪、涡旋震荡仪、1.5mLEP管、磁力架采用常规设备。
试剂：Tris-HCl、EDTA、KCl、EDTA、GuHcl、SDS、Tris由sigma生产；
甲醇、冰醋酸、乙醇、异丙醇由国药集团生产；
磁珠由Qiagen生产(取自MagattractDNAKit)。
提取试剂盒
该试剂盒包括裂解液、结合液、洗涤液I、洗涤液II、洗脱液和含有保存液的保存管。各组分的配方如下：
1)尿液保存液：0.25MEDTA，25％甲醇，0.5％SDS，2％冰醋酸，pH9；
2)裂解液：0.2MTris-HCl，15mMEDTA，0.5MKCl，3MGuHcl,0.5％SDS，pH8.5；
3)结合液：80％异丙醇，pH7.5；
4)洗涤液I：3MGuHCl，10mMTris，50％乙醇，pH8.0；
5)洗涤液II：10mMTris，80％乙醇，pH7.5；
6)洗脱液：10mMTris，0.1mMEDTA，pH9.0。
提取步骤
1.将尿液保存管中的尿液(包含2.5ml尿液保存液，25ml尿液)12000rpm离心10min；
2.弃上清留沉淀；
3.沉淀中加入300μl的裂解液，55℃震荡10min；
4.加入800ul异丙醇，10ul磁珠，垂直混匀仪上混匀10min；
5.将磁珠用WashI洗1次；
6.WashII洗2次；
7.Elution洗脱。
试验例1
琼脂糖凝胶电泳检测
配制1％琼脂糖凝胶，将上述的提取步骤获得的DNA每个胶孔加10微升跑电泳，将跑完的胶放在紫外灯下拍照获得电泳图。图1为四人尿液样本提取的DNA。图2为尿液加保存液常温放置1d、7d、14d的样本DNA。
如图1、图2所示，不同人的尿液样本提取出的DNA效果均很好，说明本试剂盒具有稳定性。同一尿液样本常温放置14天后，提取效果良好，DNA没有降解，说明尿液保存液保存效果良好。
试验例2
取男、女2份不同尿液样本，分成4份组，每组男、女各一份。将本申请实施例提供的试剂盒对第一组进行保存1d、3d、5d、7d和14d，同时对比设置一组对照实施例，对照实施例中采用含10mMol/LEDTA的Tris-HCl对第二组样本进行核酸提取，两组样品保存后均采用本申请提供的方法对核酸进行提取。
将两组提取的核酸样本经核酸微量测试仪(安捷伦2100生化分析仪)进行提取核酸浓度以及纯度的测定，测定的浓度及纯度如表1、表2所示。
表1为一组女性尿液样本核酸样本的浓度结果
表2为一组男性尿液样本核酸样本的浓度结果
表3为二组女性尿液样本核酸样本的浓度结果
表4为二组男性尿液样本核酸样本的浓度结果
由表1-4可知，第一组提取的核酸浓度和纯度明显要好于第二组，在1d、3d、5d、7d和14d，第一组降解不大，而第二组明显降解。
以上为对本申请实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。
Claims (11)
1.一种尿液DNA提取保存液，其特征在于，该保存液由以下成分构成：0.10-0.50MEDTA；20-30%甲醇；0.20-1.0%SDS；1.0-5.0%冰醋酸；余量为水；pH8.5-9.5，上述的百分比为质量百分比。
2.根据权利要求1所述的一种尿液DNA提取保存液，其特征在于，该尿液保存液包括：0.25MEDTA，25%甲醇，0.5%SDS，2%冰醋酸，pH9。
3.一种尿液保存管，其特征在于，该保存管含有权利要求1或2所述的保存液。
4.一种尿液DNA提取试剂盒，该试剂盒包括裂解液、结合液、洗涤液I、洗涤液II和洗脱液，其特征在于，该试剂盒还包括含有权利要求1或2所述的保存液的保存管。
5.根据权利要求4所述的一种尿液DNA提取试剂盒，其特征在于，所述的裂解液包括0.10-0.30MTris-HCl；10-20mMEDTA；0.2-1.0MKCl；1.0-5.0MGuHCl；0.2-1.0%SDS；pH8.0-9.0，上述的百分比为质量百分比。
6.根据权利要求4所述的一种尿液DNA提取试剂盒，其特征在于，结合液选用70-90%异丙醇，pH7.0-8.0。
7.根据权利要求4所述的一种尿液DNA提取试剂盒，其特征在于，洗涤液I包括1.0-5.0MGuHCl，5-20mMTris，40-60%乙醇；pH7.5-8.5；洗涤液II包括5-20mMTris，75-85%乙醇；pH7.0-8.0。
8.根据权利要求4所述的一种尿液DNA提取试剂盒，其特征在于，洗脱液包括5-20mMTris，0.05-0.20mMEDTA；pH8.5-9.5。
9.根据权利要求4所述的一种尿液DNA提取试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：
1）含有保存液的保存管，保存液：0.25MEDTA，25%甲醇，0.5%SDS，2%冰醋酸，pH9；
2）裂解液：0.2MTris-HCl，15mMEDTA，0.5MKCl，3MGuHCl,0.5%SDS，pH8.5；
3）结合液：80%异丙醇，pH7.5；
4）洗涤液I：3MGuHCl，10mMTris，50%乙醇，pH8.0；
5）洗涤液II：10mMTris，80%乙醇，pH7.5；
6）洗脱液：10mMTris，0.1mMEDTA，pH9.0。
10.一种尿液DNA提取方法，该方法采用权利要求4-9任意一项权利要求所述的试剂盒提取。
11.根据权利要求10所述的一种尿液DNA提取方法，其特征在于，该试剂盒包括：
1）含有保存液的保存管，保存液：0.25MEDTA，25%甲醇，0.5%SDS，2%冰醋酸，pH9；
2）裂解液：0.2MTris-HCl，15mMEDTA，0.5MKCl，3MGuHCl,0.5%质量百分比浓度SDS，pH8.5；
3）结合液：80%异丙醇，pH7.5；
4）洗涤液I：3MGuHCl，10mMTris，50%乙醇，pH8.0；
5）洗涤液II：10mMTris，80%乙醇，pH7.5；
6）洗脱液：10mMTris，0.1mMEDTA，pH9.0；
该方法包括以下的步骤：
1）将尿液保存管中的尿液12000rpm离心10min；
2）弃上清留沉淀；
3）沉淀中加入300μl的裂解液， 55℃震荡10min；
4）加入800μl结合液异丙醇，10μl磁珠，垂直混匀仪上混匀10min；
5）将磁珠用洗涤液I洗1次；
6）洗涤液II洗2次；
7）洗脱液洗脱，DNA溶液用于检测或-20℃保存。
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