CN110029102A - 一种粪便脱落细胞及其核酸保存试剂及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于粪便检测技术领域，具体涉及一种粪便脱落细胞及其核酸保存试剂及其制备和应用。本发明的保存液，能够在常温条件下，长时间地有效抑制粪便样本中细菌的增长，防止核酸的降解，并且能够温和释放粪便中的脱落细胞核酸而不大量地释放细菌核酸，离心后获得的上清液可以直接用于DNA提取、纯化或核酸检测，方便和后续的操作衔接，并且对后续的检测无影响，使用方便。

Description

一种粪便脱落细胞及其核酸保存试剂及其制备和应用

技术领域

本发明属于粪便检测技术领域，具体涉及一种粪便脱落细胞及其核酸保存试剂及其制备和应用。

背景技术

相对于血液中的癌症指标，某些癌前病变信号更早在肠道脱落细胞中出现，而且特异性高，并且运用粪便进行检测无创无痛，采样方便，所以用粪便样本进行某些疾病检测或癌症早筛越来越多。粪便样本，其成分十分复杂，含有大量的食物残渣、腐殖酸、色素、各种核酸降解酶和微生物等，而正常的人粪便中脱落的细胞及其核酸极少，所以，粪便样本的保存，特别是其中极少的脱落细胞及其核酸保存成为运用粪便样本脱落细胞检测的关键。

现有的粪便样本保存和运输，很多是在-20℃及以下保存，干冰运输，如果保存或运输过程中温度出现变化，特别是室外气温较高时，很容易导致其中的核酸降解或微生物增殖，这样限制了粪便样本检测的运用。目前，也出现了不少可以常温保存粪便样本的保存试剂，但这些保存试剂，基本只能保证抑菌和抑制核酸降解，后续提取核酸一般是提取保存液中的沉淀或固液混合物中的核酸，而粪便样本中的杂质和微生物基本都在沉淀和固体中，所以提取的核酸中含有大量的微生物核酸和杂质，宿主核酸含量非常低，必然影响后续的检测和处理，所以不大适用于检测粪便样本中的宿主脱落细胞核酸的场景。

现有技术中公开了较多的粪便样本保存液的技术方案，如CN108893523A《一种粪便样品常温保存液》公开了如何释放保存粪便样本里的肠道菌群的技术方案，保存液中使用了硫氰酸胍等强效裂解成分，才能释放有细胞壁结构的肠道菌群的核酸。但因为粪便里绝大部分是肠道微生物，如果让肠道菌群完全释放核酸，宿主细胞核酸将被完全掩盖，导致后续无法检测宿主细胞核酸。

CN106596211A《粪便样本保存液及其制备方法和应用》公开了如何保存粪便样本里肠道菌群微生物和脱落细胞，使其维持细胞形态，并且保存已经释放的所有核酸，而不是主动释放粪便样本里的核酸的技术方案，因此在保存液中用到固定剂和抗凝剂等成分，维持细胞形态，而不含任何裂解成分。

因此，开发一种释放并保存粪便样本里的宿主脱落细胞及其核酸，并且抑制肠道菌群的粪便保存液是未来的研究方向。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种粪便脱落细胞及其核酸保存试剂及其制备和应用，目的是实现在常温和气温较高的极端环境下，长时间抑制粪便样本中细菌的增殖和核酸降解，还可以温和地释放粪便样本中的脱落细胞核酸而不大量地释放微生物核酸，离心后得到的粪便上清，可以直接用于核酸提取或纯化后直接检测，因为后续提取不用处理粪便沉淀和固体，所以相对于其他保存液，获得的DNA中，获得的宿主核酸含量高，且核酸质量较好，用市面上常用的核酸提取试剂盒和处理方法即可提取，不影响后续检测，向后兼容性非常好，非常适用于需要检测粪便样本中宿主脱落细胞核酸的场景。

本发明的粪便脱落细胞及其核酸保存试剂，包括缓冲试剂、金属离子螯合剂、抑菌剂、离子型去垢剂和表面活性剂；其中所述的缓冲试剂是pH 7～10的50mM～1M Tris-HCl或磷酸盐缓冲液；所述的金属离子螯合剂是1mM～100mM乙二胺四乙酸和乙二胺四乙酸的水溶性盐中的至少一种；所述的抑菌剂是二醇类、苯甲醇、苯乙醇、ProClin^TM300和NaCl中的至少一种；所述的离子型去垢剂选自浓度0.1％～10％的十二烷基硫酸钠、十二烷基璜酸钠、十二烷基硫酸锂、癸基硫酸钠、辛基硫酸钠、月桂醇聚氧乙烯醚硫酸酯钠、尿素等中的至少一种；所述的表面活性剂为非离子型去污剂，包括浓度0.5％～10％Brij-35、Tween-20、Tween-80、NP40和Triton-100中的至少一种。

其中，所述的缓冲试剂pH值为8～9，浓度范围为300mM～500mM。

所述的属离子螯合剂浓度为30mM～60mM。

所述的抑菌剂选择ProClin^TM300和NaCl中的至少一种，抑菌剂ProClin^TM300的浓度为0.03％～0.1％。，NaCl的浓度为50mM～1M。

所述的离子型去垢剂选择十二烷基硫酸钠和十二烷基璜酸钠的至少一种，浓度为1％～5％。

所述的非离子型表面活性剂选择NP40和Triton-100中的至少一种，浓度为1％～3％。

本发明的粪便脱落细胞及其核酸保存试剂的制备方法按照以下步骤进行：

(1)根据要配制的保存液体积，在无菌去离子水中加入缓冲试剂、金属离子螯合剂、抑菌剂、离子型去垢剂和非离子型表面活性剂；

(2)用盐酸或NaOH将溶液pH值调至8～9；

(3)用无菌去离子水将溶液保存液调至所要求的体积，混匀，即得所需保存液，保存液常温保存。

本发明的粪便脱落细胞及其核酸保存试剂在保存粪便脱落细胞及其核酸上的应用。

与现有技术相比，本发明的特点和有益效果是：

本发明要解决的技术问题是释放并保存粪便样本里的宿主脱落细胞及其核酸，并且抑制肠道菌群，而不是单单是保存粪便样本里的肠道菌群。本发明用抑菌剂抑制粪便样本里的微生物，防止微生物对宿主细胞产生影响；用离子型去垢剂和表面活性剂温和地释放无细胞壁的宿主核酸而不释放有细胞壁结构的肠道微生物核酸，用缓冲液来维持稳定的核酸保存pH环境，抑制核酸自然降解；再用螯合剂抑制核酸降解酶的作用，不让核酸酶降解核酸，从而实现本发明保存液的效果。

本发明的保存液，能够在常温或较为极端条件下，长时间地保存粪便样本中的脱落细胞及其核酸，并有效抑制粪便样本中细菌的增长，防止核酸的降解，并且能够温和释放粪便中的脱落细胞核酸而不大量地释放细菌核酸。

本发明保存的样本，离心后获得的粪便上清液，可以用市面上常用的提取或纯化试剂盒直接进行DNA提取、纯化或核酸检测，而不需要特殊的试剂盒和处理，方便和后续的操作衔接，并且对后续的检测无影响，使用方便。

本发明提供的保存液，不止可以用于人粪便保存，还可以用于各种需要保存粪便样本中宿主细胞及其核酸的环境，易于推广。

本发明保存液使用的配方试剂都是市面上的常用试剂，且低毒，试剂配制简单，成本低，安全。

本发明的保存液各组分选用及所起的作用如下：

(1)缓冲试剂：维持整个体系的稳定，为样本保存提供合适的环境，对于核酸样本而言，环境pH一般为中性偏弱碱性较为适宜。采用Tris-HCl或磷酸盐缓冲液，在后续的核酸提取等流程中，极易去除，而且就算有残留也不会影响后面的检测。

(2)金属离子螯合剂：主要作用是螯合体系里的金属离子，因为像Mg离子等金属离子是核酸酶起作用的必要条件，将金属离子螯合掉，就抑制了核酸酶的作用，这样就不会降解核酸。

(3)抑菌剂：抑菌剂主要作用是抑制体系里细菌等微生物的增殖，因为粪便样本里绝大部分是微生物，而且粪便样本适合微生物生长，如果不抑制微生物增殖，提取的核酸样本中将基本是微生物的核酸，宿主(人源等)核酸的含量将大幅度减少，导致无法检测到。而我们保存液主要想保存宿主核酸，所以要抑制细菌等的增殖，从而保证提取的核酸中宿主核酸的含量。

(4)离子型去垢剂和非离子型表面活性剂：离子型去垢剂和非离子型表面活性剂主要作用是释放样本中的核酸，因为它们可以增加细胞膜的通透性，促进核蛋白的溶解，将核酸释放出来，并对核酸酶有一定抑制作用。我们想通过较温柔的离子型去垢剂和非离子型表面活性剂将粪便样本中宿主的细胞核酸尽量释放出来，而较少的释放细菌核酸，进一步提高获得的核酸中宿主核酸的含量。而像硫代氰酸盐等物质，不仅会释放宿主细胞核酸，还会大量释放细菌核酸，导致宿主核酸含量低。

附图说明

图1是在保存液中常温保存的粪便样本提取的DNA胶图；

图2是在生理盐水中常温保存1day的粪便样本提取的DNA胶图；

图3是在保存液中50℃保存的粪便样本提取的DNA胶图；

图4是在生理盐水中50℃保存1day的粪便样本提取的DNA胶图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

1.1保存液的制备方法如下：

1)根据要配制的保存液体积，在适量的无菌去离子水中加入适量所述缓冲试剂，金属离子螯合剂，抑菌剂，离子型去垢剂和非离子型表面活性剂；

2)用盐酸或NaOH将溶液pH值调至8～9；

3)用无菌去离子水将溶液保存液调至所要求的体积，混匀，即得所需保存液，保存液常温保存。

粪便样本中除了含有大量微生物，还含有宿主脱落的结直肠上皮细胞和游离DNA，该粪便样本脱落细胞及其核酸保存液能够在常温条件下，长时间内，有效抑制粪便样本中的微生物增殖，防止样本中的DNA降解，并且能够温和释放粪便中的脱落细胞核酸而不大量地释放微生物核酸。

本实施例对来自不同人的两份粪便样本进行了实验，粪便样本和保存液按1:3的加样比混合，对照组用生理盐水替代保存液做对比。每份样本分成两大组。其中，一大组分成5小份，分别在常温下放置1、7、14、21、30天；另外一大组也分成5小份，分别在50℃环境下，放置1、3、7、10、15天。对不同时间点的各组样本提取DNA，用Qubit检测提取的DNA浓度，用琼脂糖凝胶电泳检测DNA样本的完整性和降解情况，用实时荧光定量PCR检测DNA样本中甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH基因)和16S rDNA。其中GAPDH是人源管家基因，用来检测宿主DNA含量；16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中，用来检测细菌的DNA含量。

1.2 DNA提取

DNA提取采用Qiagen公司的QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit，实验组提取200ul分离后的上清液，对照组提取200ul粪便混合液，具体提取步骤参考试剂盒说明书。

1.3测量提取的DNA浓度

采用Invitrogen公司的Qubit荧光定量仪对提取的粪便DNA进行浓度测量。

1.4琼脂糖凝胶电泳检测DNA的降解情况

取5ul提取的粪便DNA，进行1％的琼脂糖凝胶电泳，电泳程序：130V，30min。

1.5用罗氏LC480实时荧光定量PCR仪检测DNA中人源DNA和细菌DNA含量，分别用人全血基因组DNA和大肠杆菌基因组DNA作为标准品，设置0.1ng/ul、1ng/ul、10ng/ul和100ng/ul四个浓度点做标准曲线，用来计算样本DNA中人源DNA的比例。

1.5.1样本定量引物及探针设计：

1)GAPDH引物和探针序列：

GAPDH-F：5’-ATGGAGGTCCTCTTGTGTCC-3’

GAPDH-R：5’-TCCAACTACCCATGACTCAGC-3’

GAPDH-P：5’-TGGTGGCTGTGGCATGGTGCCAAG-3’

2)16S rDNA引物和探针序列：

Eub-F：5’-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3’

Eub-R：5’-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3’

Eub-P：5’-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’

1.5.2检测的反应体系：

所有的反应均采用50ul反应体系，包括：TaqMan^TMUniversal Master Mix II(withUNG)25ul、10uM的上下游引物、5uM的探针、提取的粪便DNA模板2ul，补充无菌去离子水到50ul。

1.5.3检测的荧光定量PCR反应程序：

1.6实验结果

1.6.1 Qubit检测得到的两组样本不同时间点的粪便DNA浓度(ng/ul)：

A.常温条件保存：

表一 在保存液中常温条件下保存的粪便样本DNA浓度

B.50℃条件下保存：

表二 在保存液中50℃条件下保存的粪便样本DNA浓度

从样本浓度结果看，随着时间的增加，无论是常温条件还是50℃条件下，提取的粪便样本DNA量都在升高，升高到一定值后，浓度趋于稳定。前几天样本浓度升高的原因是由于粪便样本中有十二烷基硫酸钠存在，粪便中的脱落细胞和部分细菌都在释放核酸，我们提取的是离心后的上清液，也就是释放到保存液中的核酸，故浓度在升高，核酸释放到一定程度后，不再释放，故一段时间后浓度趋于稳定。结果表明，本发明的保存液能够较好地温和释放粪便样本中的核酸，并且，核酸没有大幅度一直升高，说明保存的粪便样本里面的核酸总量没有大幅度增加，间接表明微生物没有大量繁殖，说明本保存液能够有效地抑菌。从加生理盐水的对照组结果看，在无保存液的情况下，粪便样本在1天后，里面的核酸几乎降解，在50℃的条件下更严重。说明本保存液能够有效防止粪便样本例DNA降解。

提取的粪便DNA琼脂糖凝胶电泳结果如图1～4所示。

从琼脂糖凝胶电泳结果看，无论是常温条件保存30天，还是极端的50℃条件下保存15天，保存在保存液中的粪便样本，其DNA都有大于20kb的清晰主带，说明DNA完整性很好，几乎没有降解。条带的亮度随着时间的推移而增加，说明释放的DNA在增加，这和Qubit测量的浓度结果趋势一致。琼脂糖凝胶电泳的结果表明，本发明的保存液，无论是常温还是较为极端的条件下，都能很好的长时间保存粪便样本中释放的DNA，使其不降解。保存在生理盐水中的对照组，无论是常温还是50℃条件下，1天后都发生降解，其中50℃条件下几乎完全降解，这和Qubit测量的浓度结果一致，说明粪便样本中的核酸，在没有保存液的情况下极其容易降解，也更加证明了本保存液的重要性。

1.6.2实时荧光定量PCR检测粪便样本DNA中人源和细菌DNA含量结果(浓度单位：ng/ul)

A.常温条件下保存：

表三 在保存液中常温条件下保存的粪便样本qPCR结果

B.50℃条件下保存：

表四 在保存液中50℃条件下保存的粪便样本qPCR结果

从荧光定量PCR的结果来看，无论是常温条件保存30天，还是极端的50℃条件下保存15天，从粪便样本中获得的DNA，虽然主要是粪便中微生物的DNA，但也获得了较多的人源DNA，这是因为正常粪便样本中，脱落细胞本来就不多，正常粪便样本中，人源DNA含量在0.01％～0.1％左右，本保存液已经将粪便中人源DNA几乎释放完全，但由于微生物太多，不可避免地释放了微生物DNA。在50℃条件下，更加有利于微生物DNA释放，所以微生物DNA更多，但人源DNA并没有增加，这也更加证明了本保存液能够较温和地释放粪便样本中的人源DNA而较少地释放微生物DNA。无论是常温条件还是50℃极端条件，GAPDH的Ct值变化趋势是随着时间推移先减少，然后趋于平稳，表明人源DNA已经释放完全，并且释放的DNA没有降解；16S rDNA的Ct值变化趋势没有随时间推移而明显减少，也是先减少再趋于平稳，表明保存液中细菌没有繁殖，说明本保存液能够很好地抑制粪便样本中微生物的增殖。

综合上述结果，说明本发明的保存液，无论是常温条件还是较为极端的环境下，都能很好的保存粪便样本中的DNA，抑制其中的细菌增殖，并且温和地释放粪便样本中的脱落细胞核酸而不大量释放微生物核酸。使用本发明的保存液保存粪便样本，获得的粪便样本上清液，能够很好地和后续的提取或直接纯化检测衔接，不影响后续的检测。所以，本发明的保存液，能够很好地在常温或较为极端的环境下，保存粪便样本，为后续研究粪便样本中宿主的脱落细胞提供保障。

虽然结合附图描述了本发明的实施方式，但是专利所有者可以在所附权利要求的范围之内做出各种变形或修改，只要不超过本发明的权利要求所描述的保护范围，都应当在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种粪便脱落细胞及其核酸保存试剂，其特征在于包括缓冲试剂、金属离子螯合剂、抑菌剂、离子型去垢剂和表面活性剂；其中所述的缓冲试剂是pH 7～10的50mM～1M Tris-HCl或磷酸盐缓冲液；所述的金属离子螯合剂是1mM～100mM乙二胺四乙酸和乙二胺四乙酸的水溶性盐中的至少一种；所述的抑菌剂是二醇类、苯甲醇、苯乙醇、ProClin^TM 300和NaCl中的至少一种；所述的离子型去垢剂选自浓度0.1％～10％的十二烷基硫酸钠、十二烷基璜酸钠、十二烷基硫酸锂、癸基硫酸钠、辛基硫酸钠、月桂醇聚氧乙烯醚硫酸酯钠、尿素等中的至少一种；所述的表面活性剂为非离子型去污剂，包括浓度0.5％～10％Brij-35、Tween-20、Tween-80、NP40和Triton-100中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的一种粪便脱落细胞及其核酸保存试剂，其特征在于所述的缓冲试剂pH值为8～9，浓度范围为300mM～500mM。

3.根据权利要求1所述的一种粪便脱落细胞及其核酸保存试剂，其特征在于所述的金属离子螯合剂浓度为30mM～60mM。

4.根据权利要求1所述的一种粪便脱落细胞及其核酸保存试剂，其特征在于所述的抑菌剂选择ProClin^TM 300和NaCl中的至少一种，抑菌剂ProClin^TM 300的浓度为0.03％～0.1％。，NaCl的浓度为50mM～1M。

5.根据权利要求1所述的一种粪便脱落细胞及其核酸保存试剂，其特征在于所述的离子型去垢剂选择十二烷基硫酸钠和十二烷基璜酸钠的至少一种，浓度为1％～5％。

6.根据权利要求1所述的一种粪便脱落细胞及其核酸保存试剂，其特征在于所述的非离子型表面活性剂选择NP40和Triton-100中的至少一种，浓度为1％～3％。

7.如权利要求1所述的一种粪便脱落细胞及其核酸保存试剂的制备方法，其特征在于按照以下步骤进行：

(1)根据要配制的保存液体积，在无菌去离子水中加入缓冲试剂、金属离子螯合剂、抑菌剂、离子型去垢剂和非离子型表面活性剂；

(2)用盐酸或NaOH将溶液pH值调至8～9；

(3)用无菌去离子水将溶液保存液调至所要求的体积，混匀，即得所需保存液，保存液常温保存。

8.一种粪便脱落细胞及其核酸保存试剂在保存粪便脱落细胞及其核酸上的应用。