CN102757953A

CN102757953A - 荒漠植物红砂rna的提取方法

Info

Publication number: CN102757953A
Application number: CN2012102070160A
Authority: CN
Inventors: 王小华; 肖洪浪; 肖生春; 赵亮; 邹松兵
Original assignee: Cold and Arid Regions Environmental and Engineering Research Institute of CAS
Current assignee: Cold and Arid Regions Environmental and Engineering Research Institute of CAS
Priority date: 2012-06-21
Filing date: 2012-06-21
Publication date: 2012-10-31

Abstract

本发明涉及一种荒漠植物红砂RNA的提取方法，通过对红砂叶片撒PVPP研磨，将溶液离心，取上清液加等体积的氯仿和异戊醇，离心；再取上清液，加等体积的酚、氯仿和异戊醇，离心；取上清液再加等体积氯仿和异戊醇，再离心；取上清，向上清中加预冷的无水乙醇和LiCl，混匀，冰浴；再离心，倒掉上清液，加预冷的无水乙醇和醋酸钠，混匀后置于冰箱中，离心；弃上清，用75%乙醇漂洗二次，离心，收集沉淀，晾干，得纯净的RNA样品，溶于DEPC水中。本发明经过本发明对多酚、多糖、蛋白质及离子物质等次生代谢物的有效去除，获得纯净的RNA样品，并且产量高，耗时少，与现有方法相比，操作简单，RNA未受RNase（核糖核酸酶）的降解，完整性好。

Description

荒漠植物红砂RNA的提取方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体说是一种荒漠植物红砂RNA的提取方法。

背景技术

荒漠植物的强抗逆性一直受到学者们的关注。这种强抗逆性主要是由于荒漠植物体内含有大量的多糖、多酚、单宁酸和其它次级代谢物而形成的。现代分子生物学技术的运用对揭示荒漠植物强抗逆机制及其遗传种质资源的保护具有重要的作用。检测不同环境胁迫下基因表达水平的变化为理解植物的抗逆性提供一些必要的基础数据。高质量RNA的提取是进行分子生物学基因表达研究的必要前提。目前提取RNA的方法有多种，包括异硫氰酸胍法、SDS/酚抽提法、苯酚法、氯化锂沉淀法和CTAB法。然而，已发表的大量文章都反映出在分离高质足量的RNA时存有不同的困难，主要表现在：RNA易受RNase的降解；植物组织细胞破碎后，释放出大量的多酚、多糖以及其它次级代谢物而干扰RNA的提取；多酚易氧化成多醌而与核酸结合；多糖在低离子浓度缓冲溶液中与RNA结合产生共沉淀。这些都导致RNA产量降低。这样，不同植物组织中多糖、多酚以及其它次级代谢物含量的不同显著地影响着核酸的抽提及纯化过程，因此研究荒漠植物抗逆机制，RNA提取方法是科技工作者必须解决的一个技术难题。

超旱生小半灌木红砂（Reaumuria soongorica （Pall.）Maxim.）属于柽柳科红砂属，起源于第三纪，是荒漠灌丛植被主要优势种和建群种。其分布区东起我国鄂尔多斯西部，经阿拉善、河西、北山、柴达木盆地、嘎顺戈壁，西至准噶尔和塔里木盆地边缘，生长在荒漠、半荒漠的山麓洪积平原、山地丘陵、剥蚀残丘、山前砂砾质和砾质洪积扇、戈壁等地，分布区内生境相对炎热、干旱，年降水量在60-300 mm，海拔在500-3200 mm。土壤一般为灰棕荒漠土或棕色荒漠土及荒漠灰钙土，土壤瘠薄坚硬，富含石膏，有不同程度的盐渍化，在中重度盐渍化土壤中红砂也能良好生长。据1961年以来额济纳旗气象资料数据统计，红砂能在年均降雨量7-101.1 mm，温度变化幅度为-35.2-42.5 ℃，潜在蒸发量高达4234.9 mm的环境下生存。

红砂分布范围广，抗逆性强，生态可塑性大，因此红砂是研究抗逆机制的重要基因组荒漠模式植物。从红砂中提取高质量的RNA是研究红砂分子抗逆机制的重要前提，然而红砂叶片组织中含有大量的多糖、多酚等次级代谢物，给高质量红砂RNA的提取带来了很大的困难。因此摸索出一种高效提取红砂总RNA的技术方法为深入开展红砂分子抗逆机制具有重要的意义。

刘玉冰等(中国沙漠, 2006,26(4):600-603)采用强离子型去污剂CTAB-SDS方法从红砂正常和脱水组织中获得总RNA，然而此方法从红砂叶片中反复多次提取总RNA时总有相当量的DNA污染，而每次再经DNA酶处理，大量的RNA又降解了，导致RNA的产量降低。王小华等人（Mol Biotechnol, 2011,48:165-172）披露了一种改进CTAB纯化方法，采用DNase去除DNA，酚去除蛋白质以及醋酸去除多糖，提出了一种CTAB-NaAc法。该方法能完全去除DNA等污染物，并且提高了总RNA的产量，但是，该方法操作步骤相对较多，耗时过长，产量相对偏低。

发明内容

鉴于上述提取RNA方法的不足，本发明的目的旨在提供一种荒漠植物红砂（Reaumuria soongorica （Pall.）Maxim.）RNA的提取方法——CTAB-酸酚法。

本发明的目的是这样实现的：

一种荒漠植物红砂RNA的提取方法，其步骤是：

① 取红砂叶片置于研钵中，在研钵里直接撒交联聚乙烯吡咯烷酮粉，研磨；

② 将①研磨的粉末转移至离心管，加入65℃预热的十六烷基三甲基溴化铵提取缓冲液和β-巯基乙醇；

③ 将②中溶液涡旋2 min，65℃温浴8min，尔后，常温 12000 rpm离心15 min；

④ 取③中上清液，加等体积的氯仿和异戊醇，氯仿︰异戊醇体积比为24︰1，混匀，18℃ 12 000 rpm 离心15 min；

⑤ 取④中的上清液，加等体积的苯酚、氯仿和异戊醇，苯酚︰氯仿︰异戊醇体积比为25︰24︰1，抽提1次，18℃，12 000 r/min，离心15 min；

⑥ 取⑤上清液，加等体积的氯仿和异戊醇，氯仿︰异戊醇体积比为24︰1，混匀，18℃ 12 000 rpm 离心15 min；

⑦ 取⑥上清液，向上清中加1/2体积预冷的无水乙醇和1/2体积的8 mol/L LiCl，混匀，冰浴30 min；

⑧ 将⑦冰浴的溶液，在4℃ 12000 rpm离心10 min，倒掉上清液，加2体积预冷的无水乙醇和1/10体积3 mol/L、pH为 5.2的醋酸钠，混匀后置于-80℃冰箱中30 min后，4℃ 12 000 rpm离心15 min；

⑨ 弃⑧中上清液，用体积浓度75%乙醇漂洗二次，4℃ 12 000 rpm离心15 min，收集沉淀，晾干，得纯净的核糖核酸样品，并溶于已高压灭菌处理的焦碳酸二乙酯水中。

本发明的优点和产生的有益效果

1、操作简单，耗时少。第一，本发明独创性地在RNA分离开始阶段就加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇，使RNA处于离心管上层透明和半透明水相中，而残留的DNA、脂类、蛋白质将处于白色的中间层，大量DNA处于下层黄色酚相中；然后吸取上层水相到新的离心管中，利用选择性沉淀试剂高盐LiCl 使RNA和DNA彻底分离。而在CTAB-NaAc法中，首先利用LiCl沉淀总RNA，在沉淀过程中由于存在大量DNA，因而会有少量DNA伴随RNA一起沉淀下来；这样就必须引入DNase I酶来清除残留的DNA，再用酚来清除DNase蛋白，还必须用氯仿及异戊醇来清除酚，这样形成了一个反复添加试剂的纯化过程，这些步骤都会影响总RNA产量和纯度。而新的提取方法——CTAB-酸酚法避免了CTAB-NaAc法后期反复操作的纯化过程，减少了RNA的不必要损失，提高RNA产量，简化了操作过程。第二，本发明通过独创性地在LiCl选择性地沉淀RNA过程中加入与LiCl等体积的无水乙醇，极大地加快了RNA的沉淀，缩短了实验时间。采用CTAB-酸酚法提取RNA，全程只需1天时间，而采用CTAB-LiCl法实验周期较长，需要3天时间；采用CTAB-NaAc法需要2天时间。

2、RNA损失少，产量高。第一，由于本发明独创性地在RNA分离开始阶段就加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇，避免了CTAB-NaAc法后期反复操作的纯化过程，减少了RNA的不必要损失，从而提高了RNA产量；第二，本提取方法首次采用在材料研磨过程中直接撒PVPP粉在研钵里与冷冻材料一起研磨，有效抑制了在研磨过程中酚类物质氧化成醌类与RNA的结合，减少了RNA的损失，提高RNA的产量。通过检测，CTAB-酸酚法提取的总RNA产量较CTAB-NaAc法提高30%多，较CTAB-LiCl法提高90%（见表1）

3、纯度高。荒漠植物红砂富含多酚、多糖、蛋白质等次级代谢物，并且在试验操作过程中又带入了Li⁺、Cl^-等离子物质，为了使提取的RNA纯度高，操作过程中首先在材料研磨时使用PVPP粉结合多酚进而通过氯仿/异戊醇抽提彻底去除多酚；通过使用高盐的CTAB缓冲液去除大部分多糖，并且通过后续的LiCl溶解多糖进一步去除，后期再用低温预冷的无水乙醇和醋酸钠沉淀，彻底去除残留多糖；通过使用酚/氯仿/异戊醇及氯仿/异戊醇的多次抽提而彻底去除蛋白质；试验过程中带入的微量Li⁺、Cl^-干扰RNA的反转录和体外翻译，采用低温预冷的无水乙醇和醋酸钠沉淀，并结合75%的乙醇洗涤两次，有效去除离子的干扰。

4、完整性好。采用CTAB-酸酚法提取红砂总RNA，不仅试验操作简单，耗时少，产量高，纯度高，而且RNA完整性好。对CTAB-酸酚法提取的RNA进行凝胶电泳检测，获得两条明亮清晰的RNA条带，且28S条带的亮度约是18S的两倍（如图2）；另外，用RNA进行RT-PCR 反应，获得组氨酸蛋白激酶基因保守区约602 bp的一条明亮cDNA条带（如图3）。由于CTAB-酸酚法能彻底去除多糖、多酚、蛋白质、DNA及其它污染物，所提的RNA适合分子生物学的下游实验如反转录及基因扩增等，所以 CTAB-酸酚法是提取红砂总RNA的最理想方法，为后续开展红砂分子克隆和基因表达分析等分子生物学实验奠定了基础。

5、适用性强。本发明不仅能从红砂中提取出高质量的RNA，同时也适合于其它富含次级代谢物的荒漠植物RNA的高效提取，它具有广泛的应用价值，具有简单、省时和产量高、纯度高等优点。

附图说明

图1为本发明CTAB-酸酚法提取红砂RNA操作流程图

图2为不同方法提取红砂叶片总RNA的电泳凝胶图，其中：泳道1，CTAB-LiCl法；泳道2，CTAB-NaAc法；泳道3，CTAB-酸酚法。

图3为CTAB-酸酚法所提红砂总RNA的RT-PCR反应的产物。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的技术方案再作进一步的说明。

荒漠植物红砂高质量总RNA提取的试验技术的具体步骤如下：

一、试验准备阶段：

1、植物材料

挑选河西走廊荒漠中大小一致生长旺盛的红砂，取其叶片立即冻存于液氮，贮存在-80℃备用。

2、试剂

十二烷基硫酸钠(SDS) 、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、四乙酸乙二胺(EDTA)、焦碳酸二乙酯（DEPC）、b-巯基乙醇、醋酸钠、氯化锂购自美国Amresco公司，不含RNase的RQ DNase酶及交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP P 6755)购自美国Sigma公司，Taq 酶(5 U/μL)、dNTP (2.5 mmol/L) 、DL2000 、Agarose等购自天根公司，PrimeScriptTM RTase(200 U/μL)购自TaRaKa大连宝生物有限公司，其他试剂均为国产分析纯产品。

3、RNA提取准备工作

RNase-free water: 0.1% DEPC处理24小时后高压灭菌的新鲜超纯水。

提取试剂配制所用容器，提取所用研钵、药匙和研杵等用锡箔纸包好，于180℃烘箱高温烘烤4 h以上。

制备RNA的离心管、枪头等用0.1% DEPC浸泡12-24 h, 于121℃高压蒸汽灭菌20 min后烘干备用。所有试剂用RNase-free Water配制。

用于RNA电泳的电泳槽和梳子的处理：用去污剂清洗后，用水冲洗并用乙醇干燥，在装满3%的H₂O₂溶液，室温下处理10 min, 用0.1%的DEPC处理过的水彻底刷洗。

操作过程中，带手套口罩，研磨迅速，避免RNA降解。

4、溶液

CTAB 提取缓冲液：3 %（w/v）CTAB，5%（w/v）PVPP（研磨时加入），100 mM Tris-HCl（pH 值8.0），25 mM EDTA，2 M NaCl 和5 %（v/v）b-巯基乙醇（使用前加入）；氯仿∶异戊醇（24︰1，v/v）；10 M LiCl。所有溶液都用0.1 % DEPC 处理的超纯水制备并高压灭菌。

二、RNA提取阶段：

1、材料研磨

① 取0.1 g红砂叶片置于研钵中，在研钵里直接撒0.01 g交联聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）粉，与红砂叶片一起研磨；

红砂叶片在研磨过程中会释放出大量的多酚，多酚氧化形成醌类物质而与RNA结合，可是红砂叶片硬而厚，研碎费时，这样就为多酚氧化形成醌类物质与RNA结合提供了更大的可能。为了避免多酚氧化成醌类物质而结合RNA，采用了在研磨过程中直接撒PVPP粉在研钵里与冷冻材料一起研磨的方法。PVPP粉作为多酚化合物的螯合剂，具有很强的结合酚能力。在此实验中特别提高了PVPP粉和β-巯基乙醇的含量，使其浓度都达到5 %，β-巯基乙醇提供还原条件，二者协同作用，使得多酚类物质不易被氧化，而与PVPP充分结合形成螯合物。再通过后续的步骤抽提除去，有效抑制了酚类物质对RNA提取的影响。

试验中使用PVPP而不用PVP，这是因为PVP是聚乙烯吡咯烷酮，水溶性好，可溶于各种有机溶剂，而PVPP是交联聚乙烯吡咯烷酮，是聚乙烯吡咯烷酮的交联聚合物，几乎不溶于任何溶剂。不溶性PVPP替代可溶性的PVP，有三个优势：一）可溶性PVP与酚的抽提不兼容而干扰RNA沉淀；二）不溶性PVPP既能结合多酚，又能结合多糖，从而阻止核酸与多糖多酚结合而导致RNA产量减少，可溶性PVP粉只结合多酚而不结合多糖，从而不能去除多糖污染物；三）PVP粉的使用量受到限制，缓冲液PVP粉不能超过的1%，否则RNA的产量会显著地减少，而PVPP不受限制。

2、抽提RNA，清除次级代谢物

② 将①研磨的粉末转移至2 ml的离心管，加入65℃预热、700 ml CTAB提取缓冲液和35 ml β-巯基乙醇；

③ 将②中溶液涡旋2 min，65℃温浴8 min，尔后，常温（18℃）12000 rpm离心15 min；

CTAB提取液中包含有较高浓度的CTAB（3%），NaCl（2M），PVPP（5%），β-巯基乙醇（5%）以及25 mM EDTA和100 mM Tris-HCl (pH值8.0)。CTAB是一种阳离子去污剂，能溶解细胞膜，对植物细胞具有较好的裂解作用，而且同β-巯基乙醇共同对蛋白质的强烈变性作用，使核酸从蛋白-核酸复合物中彻底被释放出来。在高离子浓度的NaCl溶液中（NaCl＞0.7 mol/L），释放出来的核酸与较高浓度的CTAB（3 %（w/v））形成可溶性的复合物，而变性蛋白质与CTAB形成不溶性的的复合物，随着氯仿的抽提蛋白质被去除；在高离子浓度的盐溶液中，CTAB作为一种RNase的抑制剂，保护RNA不被降解；细胞破裂后释放大量的多糖，高浓度的盐促使多糖、CTAB-核酸复合物的溶解，溶解的多糖与CTAB结合形成不容性的复合物，随着氯仿的抽提多糖被去除。同时，β-巯基乙醇不但可以作为强还原剂防止多酚氧化，还可以打断RNase的二硫键使之不可逆转地失活。提供pH值为8.0缓冲环境，能有效降低多酚物质在酸性条件下被氧化的几率。

在RNA分离的开始阶段就加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提，RNA将留在透明和半透明的上层水相中，残留的DNA、脂类、蛋白质将留在白色的中间层，大量DNA留在下层黄色酚相中，然后吸取上层水相到新的离心管中，再通过氯仿/异戊醇的抽提，将残留的苯酚去除（由于酚对后续分子操作过程RNA的运用有影响，如影响酶切、影响反转录）。这样将RNA与DNA分离，同时也去除了蛋白质、酚及其它残留杂质。在RNA分离开始阶段加酚能避免CTAB-NaAc法中反复纯化操作步骤：LiCl沉淀总RNA过程中杂带少量DNA及其它杂质，须引入DNase I酶来清除残留的DNA，引入酚来清除DNase蛋白，最后还需用氯仿及异戊醇来清除酚。而所有的这些操作都会影响总RNA提取的产量。因此改进的CTAB-酸酚法在RNA抽提的开始阶段就用酸酚抽提RNA，这样能替代CTAB-NaAc法后期阶段反复操作的纯化过程，从而简化操作过程，并且避免在反复的操作纯化过程中RNA的不必要损失。

3、沉淀RNA，获取纯净RNA

⑦ 取⑥上清液，向上清中加1/2体积预冷的无水乙醇，1/2体积的8 mol/L LiCl，混匀，冰浴30 min；

⑧ 将⑦冰浴的溶液，在4℃ 12000 rpm离心10 min，倒掉上清液，加2体积预冷的无水乙醇和1/10体积3 mol/L，pH为 5.2醋酸钠，混匀后置于-80℃冰箱中30min后，4℃ 12 000 rpm离心15 min；

⑨ 弃⑧中上清液，用体积浓度为75% 乙醇漂洗二次，4℃ 12 000 rpm离心15 min，收集沉淀，晾干，得纯净的核糖核酸（RNA）样品，溶于50 ml 、质量浓度0.1%已高压灭菌处理的焦碳酸二乙酯（DEPC）水中。

LiCl沉淀RNA，实验周期较长，一般都需要至少2h以上的冰浴RNA才能沉淀。本方法通过在LiCl选择性地沉淀RNA过程中加入1/2体积的无水乙醇，加快了RNA的沉淀速度，节省了实验时间；同时LiCl能溶解多糖，对残留的多糖能进一步去除。

红砂叶片中富含多糖，其成分以及理化性质和核酸很接近，不容易分离，尽管大量的多糖在RNA的抽提过程中被高盐的CTAB缓冲液已经去除以及后续的LiCl的进一步溶解多糖，但还是有极少量的多糖在LiCl的选择性沉淀RNA的过程中渗入到RNA水相中与RNA一起沉淀，而使抽提到的RNA中还含有极少量多糖的污染，所以后期再用低温预冷的无水乙醇和醋酸钠沉淀，这样可有效彻底去除残留多糖的干扰。另外，溶解的RNA中可能含有微量的Li⁺、Cl^-干扰RNA的反转录和体外翻译，而低温预冷的无水乙醇和醋酸钠沉淀，并用75%的乙醇洗涤两次，这样可有效去除离子的干扰。这样，经过对多酚、多糖、蛋白质及离子物质的有效去除，获得纯净的RNA样品。

三、总RNA质量和产量检测阶段：

1、完整性检测

每个样品中取3 ml总RNA溶液通过凝胶电泳检测其完整性，其它RNA样品保存在-80℃冰箱中。将1 ml 5×RNA缓冲液和3 ml总RNA溶液室温混合3 min，然后上样到1%琼脂糖凝胶（已加EB）样孔中，在5-7 V/cm 1×甲醛电泳缓冲液中跑胶30 min后，用全自动数码凝胶成像系统美国伯乐Gel Doc XR⁺拍照记录。

2、总RNA纯度和产量检测

取5 μL RNA 样品用DEPC水(pH 7.0)稀释500倍,混匀,用UV/VIS- 752N型紫外分光光度计测定OD₂₆₀ 、OD₂₈₀和OD₂₃₀处的吸光值(以无RNase 水为空白液调零) ，计算RNA产量及纯度。总RNA产量计算根据公式：RNA产量=40×OD₂₆₀×稀释倍数×样品的体积（ml）/材料重（g）。RNA、蛋白质和多糖、多酚分别在l₂₆₀、l₂₈₀和l₂₃₀有最大的吸光值，常用A_260/230、A_260/280的比值来表示RNA的纯度，A_260/230、 A_260/280在 1.8～2.1表示RNA有较高的纯度，A_260/230小于1.8或大于2.1说明RNA有多糖、多酚污染，A_260/280小于1.8或大于2.1说明RNA有蛋白质污染。

高质量总RNA的提取可通过所获得RNA的产量、纯度及完整性来判断。分别采用CTAB-LiCl、CTAB-NaAc法、CTAB-酸酚法提取红砂叶片中的总RNA，发现用CTAB-酸酚法所提RNA的产量显著高于其它两方法。CTAB-酸酚法所提RNA的产量是237.76±64.57（mg/g），高于CTAB-NaAc法产量（181.35±42.11（mg/g））的31%，几乎是CTAB-LiCl产量的2倍（见表 1）。

表1 不同方法提取红砂叶片总RNA纯度和产量比较表

其次，用CTAB-酸酚法所提取的RNA，A_260/230、 A_260/280的比值都在 1.8～2.1（表 1），说明RNA有较高的纯度，没有多糖、多酚、蛋白质等其它杂质的污染。

RNA的完整性可通过凝胶电泳来检测，如图2所示，CTAB-LiCl法形成泳道1；CTAB-NaAc法形成泳道2；CTAB-酸酚法泳道3。从图2可以看出：泳道1靠上样端处可见条带，说明CTAB-LiCl法所提RNA有DNA的污染。泳道3两条带显著亮于泳道2和泳道1，说明CTAB酸酚法所提RNA产量要显著高于CTAB-NaAc法和CTAB-LiCl法所提总RNA产量；泳道3中28S条带荧光亮度是18S条带的1.5～2.0倍，说明CTAB-酸酚法所提总RNA完整性好，未受RNase（核糖核酸酶）的降解；泳道3靠上样端处未见条带，说明RNA样品没受DNA污染。CTAB-酸酚法不仅能有效的去除多糖、多酚、蛋白质以及其它污染物，而且能在较短时间内（1天）提取高透明的、水溶的没有DNA污染的高产量的RNA。这说明了CTAB-酸酚法显著优于CTAB-NaAc法和CTAB-LiCl法。

3、RNA样品的RT-PCR检验

RT-PCR是基因克隆、转基因植物分子鉴定等分子学实验的重要方法之一。它对cDNA的纯度和质量都有较高的要求,为了验证改进的CTAB-酸酚法提取红砂叶片RNA的可用性效果，进行RT-PCR验证。利用组氨酸蛋白激酶基因的引物,以改进的CTAB-酸酚法提取RNA样品进行反转录合成cDNA。cDNA合成参照TaKaRa公司PrimeScript^TM 反转录说明书进行，以合成cDNA为模板，上游引物为：5￠-CAC GAG ATG ACG ACG CC-3￠；下游引物：5￠-ATG GCG AGG CCG AAG CCG CTG CCG CC-3￠； 50 μL 扩增体系为：ddH₂O 28.5 μL，10×PCR buffer 5μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，10 μmol正向引物1 μL，10 μmol 反向引物1 μL，Taq 酶(5 U/μL) 1 μL，cDNA 1 μL。扩增程序如下：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，52℃ 退火40 s，72℃延伸1 min，共进行30个循环；最后72℃延伸7 min。取5 ml PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

用CTAB-酸酚法提取红砂叶片RNA反转录合成的cDNA做模板，组氨酸蛋白激酶基因的引物进行RT-PCR扩增，扩增出了红砂组氨酸蛋白激酶基因（GenBank登录号：GW820243）目的基因片段（602bp）（如图3所示）。为了进一步验证CTAB-酸酚法提取红砂叶片RNA的适应性，本发明还成功扩增到了红砂中其它基因片段，如类钙调蛋白基因（GenBank登录号：GW820236），类细胞色素还原蛋白基因（GenBank登录号：GW820241）以及香叶酰香叶酰氢化酶基因（GenBank登录号：GW820240）。CTAB-酸酚法用于提取其它富含次级代谢物的荒漠植物如沙冬青、白刺、苦豆子的总RNA都取得了同样很好的效果。

Claims

1.一种荒漠植物红砂RNA的提取方法，其步骤是：