CN112195262A - 一种湖北贝母issr-pcr扩增反应体系及issr-pcr分子标记方法和应用 - Google Patents

一种湖北贝母issr-pcr扩增反应体系及issr-pcr分子标记方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种湖北贝母ISSR‑PCR扩增反应体系，每20μL反应体系中含有2×Taq Master Mix 10.5μL，模板DNA 0.8μL，引物2.2μL；将上述反应混合液按如下程序进行扩增：94℃预变性5min，然后94℃变性0.75min，50～60.0℃退火0.75min，延伸1.5min，共40个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。另外，本发明还提供了湖北贝母ISSR‑PCR分子标记方法。该发明所建立的湖北贝母ISSR‑PCR扩增反应体系扩增出的条带清晰度和稳定性高，具有很高的多态性的特点，弥补了现有对湖北贝母遗传多样性研究的不足；而且该湖北贝母ISSR‑PCR分子标记方法操作简单，节约时间和成本，结果稳定可靠，发明的成果对湖北贝母遗传多样性分析、种质资源鉴定及分子育种等方面有较好的应用价值。

Description

一种湖北贝母ISSR-PCR扩增反应体系及ISSR-PCR分子标记方 法和应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种湖北贝母ISSR-PCR扩增反应体系及ISSR-PCR分子标记方法和应用法。
背景技术
湖北贝母(Fritillaria hupehensis Hsiao et K.C.Hsia)属于百合科贝母属多年生草本植物，主要分布于湖北西南部，在恩施、建始、五峰等地有大面积种植，已有200多年的栽培历史，是湖北省道地药材之一。随着研究的不断深入，湖北贝母的药用价值逐渐得到了人们的认可，《中华人民共和国药典》最新几版均收载了湖北贝母，使其成为国家法定中药材。湖北贝母以干燥鳞茎入药，具有清肺化痰、止咳、散结的功能，主要用于治疗热痰咳嗽，痰核瘰疬，痈肿疮毒等症状。近些年来，由于国家的重视及人们对健康需求的增加，使得中药材产业经历了一个较快的发展时期，这种快速的发展同时也导致湖北贝母等药材市场时常发生品种混乱、以次充好等现象，因此，构建高效快捷的鉴别体系对于湖北贝母的鉴定及资源保护具有重要意义。
ISSR标记是一种检测植物基因组中差异序列的分子标记技术，该方法操作简单，尤其适用于检测基因组序列未知的物种的多样性。目前在湖北贝母的研究多集中于生态种植、病虫害防治、药理药效等方面，有关湖北贝母遗传多样性分析的研究还比较少。
而ISSR标记是一种随机性标记方法，不同物种甚至同一物种不同条件下试验参数均有差异，因此，基于湖北贝母混杂群体的现状，针对湖北贝母建立一个相对科学合理有效的ISSR-PCR反应体系，探寻最佳的处理组合，可以为开展湖北贝母的遗传多样性分析，以及后续湖北贝母种质鉴定及品种选育提供很好的技术指导和理论支持。
发明内容
本发明的目的是克服现有针对湖北贝母遗传多样性分析的研究缺乏的问题。
为此，本发明提供了一种湖北贝母ISSR-PCR扩增反应体系，每20μL反应体系中含有2×Taq Master Mix 10.5μL，模板DNA 0.8μL，引物2.2μL；将上述反应混合液按如下程序进行扩增：94℃预变性5min，然后94℃变性0.75min，50～60.0℃退火0.75min，延伸1.5min，共40个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。
进一步的，所述引物为下述引物中任意一条，
引物 序列5’-3’
UBC848 CACACACACACACACARG；
UBC850 GTGTGTGTGTGTGTGTYC；
UBC853 TCTCTCTCTCTCTCTCRT；
UBC857 ACACACACACACACACYG；
UBC859 TGTGTGTGTGTGTGTGRC；
UBC866 CTCCTCCTCCTCCTC；
UBC873 GACAGACAGACAGACA。
进一步的，所述退火温度根据所选择的引物来确定，具体如下：
引物 退火温度
UBC848 59.3℃；
UBC850 58.2℃；
UBC853 56.9℃；
UBC857 54.3℃；
UBC859 59.3℃；
UBC866 60.0℃；
UBC873 52.0℃。
另外，本发明还提供了一种湖北贝母ISSR-PCR分子标记方法，包括如下步骤：
1)提取湖北贝母幼嫩叶片的基因组DNA；
2)用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测步骤1)提取的基因组DNA完整性；
3)采用上述湖北贝母ISSR-PCR扩增反应体系对提取的基因组DNA进行ISSR-PCR扩增。
本发明还提供了上述湖北贝母ISSR-PCR扩增反应体系在湖北贝母遗传多样性分析、种质资源鉴定及分子育种中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明所建立的湖北贝母ISSR-PCR扩增反应体系扩增出的条带清晰度和稳定性高，具有很高的多态性的特点，弥补了现有对湖北贝母遗传多样性研究的不足；另外，本发明的提供的湖北贝母ISSR-PCR分子标记方法操作简单，节约时间和成本，结果稳定可靠，发明的成果对湖北贝母遗传多样性分析、种质资源鉴定及分子育种等方面有较好的应用价值。
以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为ISSR-PCR均匀设计U12(43)的扩增结果，其中M表示Marker，1～12为表2的处理编号，每个处理3个重复；
图2为2×Taq Master Mix单因素试验设计的ISSR-PCR扩增结果，其中M表示Marker，1～12为表3的处理编号，每个处理3个重复；
图3为模板DNA的单因素试验设计的ISSR-PCR扩增结果，其中M表示Marker，1～12为表4的处理编号，每个处理3个重复；
图4为引物的单因素试验设计的ISSR-PCR扩增结果，其中M表示Marker，1～12为表5的处理编号，每个处理3个重复；
图5为引物UBC848在梯度退火温度下扩增结果，其中M表示Marker，1～8对应的退火温度依次是1:60℃；2:59.3℃；3:58.2℃；4:56.4℃；5:54.3℃；6:52.7℃；7:51.6℃；8:51.0℃；
图6为引物UBC866对优化体系验证的扩增结果，其中M表示Marker，1～12为12份不同产地的湖北贝母资源。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
1、湖北贝母基因组DNA的提取
用清水洗净晾干研钵，加入3ml无水乙醇后点燃，用液氮预冷研钵，然后取0.2g幼嫩的湖北贝母叶片放入研钵中，加入液氮至没过叶片2～3cm，快速研磨2～3min，然后用植物基因组DNA提取试剂盒提取湖北贝母基因组DNA。
2、ISSR-PCR扩增反应体系的建立与优化
2.1 ISSR-PCR扩增反应体系的均匀设计
采用均匀设计U12(43)方法建立ISSR-PCR体系，ISSR-PCR扩增反应体系的因素水平如表1所示；以上述提取的湖北贝母基因组DNA为模板，UBC873为扩增引物，利用表2中的12个不同处理各组分用量的反应体系对ISSR-PCR进行优化筛选，反应体系20μL，每个处理设置3个重复。
所述ISSR-PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后94℃变性0.75min，52℃退火0.75min，延伸1.5min，共40个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。
表1：均匀设计U12(43)因素水平表(单位:μL)
Figure BDA0002727483020000051
表2：ISSR-PCR均匀设计U12(43)方案(单位:μL)
Figure BDA0002727483020000052
上述均匀设计U12(43)结果如图1所示，由图1可知，除处理4、5、12外，其它处理各重复都能扩增出5个条带，而处理6扩增条带数最多(5条)，条带最亮，重复性好，且2×TaqMaster Mix用量较少，因此，选择在此处理6的基础上进行2×Taq Master Mix单因素试验。
2.2 2×Taq Master Mix单因素试验方案
根据ISSR-PCR均匀设计U12(43)结果，以湖北贝母基因组DNA为模板，UBC873为扩增引物，在20μL反应体系中，设计2×Taq Master Mix的量分别为9.0μL、9.5μL、10.0μL、10.5μL、11.0μL进行ISSR-PCR反应，模板DNA、引物及ddH2O的用量如表3所示，每个处理设置3个重复。
所述ISSR-PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后94℃变性0.75min，52℃退火0.75min，延伸1.5min，共40个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。
表3：2×Taq Master mix的单因素试验设计表(单位:μL)
Figure BDA0002727483020000061
上述2×Taq Master Mix的单因素试验结果如图2所示，由图2可知，各处理的3个重复都能扩增出5条带，而处理4的3个重复整体的条带亮度和清晰度都最高，因此处理4为最优处理，即2×Taq Master Mix的用量为10.5μL。
2.3模板DNA的单因素试验方案
上述2×Taq Master Mix的单因素试验中，处理4为最优处理，根据上述结果设计模板DNA的单因素试验方案，以湖北贝母基因组DNA为模板，UBC873为扩增引物，在20μL反应体系中，设计模板DNA的量分别为0.2μL、0.5μL、0.8μL、1.0μL、1.5μL、2.0μL进行ISSR-PCR反应，2×Taq Master Mix、引物及ddH2O的用量如表4所示，每个处理设置3个重复。
所述ISSR-PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后94℃变性0.75min，52℃退火0.75min，延伸1.5min，共40个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。
表4：模板DNA的单因素试验设计方案(单位:μL)
Figure BDA0002727483020000071
上述模板DNA的单因素试验结果如图3所示，由图3可知，各处理都能扩增出5条清晰条带，处理3、4、5、6条带亮度基本一致，考虑DNA用量的经济适用性，处理3为最优处理，即模板DNA的用量为0.8μL。
2.4引物的单因素试验方案
上述模板DNA的单因素试验中，处理3为最优处理，根据上述结果设计引物的单因素试验方案，以湖北贝母基因组DNA为模板，U873为扩增引物，在20μL反应体系中，设计引物的量分别为1.2μL、1.5μL、1.8μL、2.0μL、2.2μL、2.5μL进行ISSR-PCR反应，2×Taq MasterMix、模板DNA及ddH2O的用量如表5所示，每个处理设置3个重复。
所述ISSR-PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后94℃变性0.75min，52℃退火0.75min，延伸1.5min，共40个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。
表5：引物的单因素试验设计方案(单位:μL)
Figure BDA0002727483020000072
Figure BDA0002727483020000081
上述引物的单因素试验结果如图4所示，由图4可知，处理5整体条带亮度和清晰度都高于其他各处理，表明处理5为最优处理，即引物的用量为2.2μL。
3、引物筛选及退火温度的确定
不同退火温度对湖北贝母ISSR-PCR扩增结果影响显著，退火温度过高或过低时，条带数和清晰度都会出现明显降低。本试验根据已建立的ISSR-PCR扩增反应体系，以相同的湖北贝母基因组DNA为模板，从哥伦比亚大学公布的100条引物序列(由上海英俊公司合成)中进行筛选，最后筛选得出UBC848、UBC850、UBC853、UBC857、UBC859、UBC866、UBC873为引物，进行ISSR-PCR扩增，能够扩增出清晰度高、稳定性好的条带。其中，筛选出的引物序列如表6所示。
在均匀设计结合单因素试验建立的优化的ISSR-PCR扩增体系基础上，在伯乐PCR仪上进行上述筛选出的7条引物最佳退火温度的确定，根据理论退火温度Tm－5℃～Tm+5℃设定梯度退火温度，共设置8个梯度的退火温度，筛选出的引物及最佳退火温度如表6所示。
表6：引物及退火温度
Figure BDA0002727483020000082
具体的，以引物UBC848为例，在梯度退火温度下进行扩增，共设置8个梯度退火温度分别为60℃、59.3℃、58.2℃、56.4℃、54.3℃、52.7℃、51.6℃、51.0℃，扩增结果如图5所示。由图5可知，退火温度为59.3℃时，引物UBC848扩增的条带数最多，且条带最明亮清晰，退火温度过高或过低时，条带数和清晰度明显降低，表明引物UBC848的最佳退火温度为59.3℃。
4、优化后的ISSR-PCR扩增反应体系的验证
根据上述建立的湖北贝母ISSR-PCR优化体系，采用引物UBC866对12份湖北贝母基因组DNA进行优化体系验证。
优化的湖北贝母ISSR-PCR扩增反应体系为：20μL反应体系中，2×Taq Master Mix10.5μL，模板DNA 0.8μL(40.0ng)，引物2.2μL(5.5μmol)，ddH2O 6.5μL。
所述ISSR-PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后94℃变性0.75min，60℃退火0.75min，延伸1.5min，共40个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。
优化体系验证结果如图6所示，由图6可知，引物UBC866扩增条带清晰，多态性较为丰富，表明优化的ISSR-PCR扩增反应体系可应用于湖北贝母的遗传多样性分析。
以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种湖北贝母ISSR-PCR扩增反应体系，其特征在于，每20μL反应体系中含有2×TaqMaster Mix 10.5μL，模板DNA 0.8μL，引物2.2μL；将上述反应混合液按如下程序进行扩增：94℃预变性5min，然后94℃变性0.75min，50～60.0℃退火0.75min，延伸1.5min，共40个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。
2.如权利要求1所述的一种湖北贝母ISSR-PCR扩增反应体系，其特征在于，所述引物为下述引物中任意一条，
Figure FDA0002727483010000011
3.如权利要求1所述的一种湖北贝母ISSR-PCR扩增反应体系，其特征在于，所述退火温度根据所选择的引物来确定，具体如下：
Figure FDA0002727483010000012
4.一种湖北贝母ISSR-PCR分子标记方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)提取湖北贝母幼嫩叶片的基因组DNA；
2)用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测步骤1)提取的基因组DNA完整性；
3)采用如权利要求1～3任一项所述的湖北贝母ISSR-PCR扩增反应体系对提取的基因组DNA进行ISSR-PCR扩增。
5.如权利要求1～3任一项所述的湖北贝母ISSR-PCR扩增反应体系在湖北贝母遗传多样性分析、种质资源鉴定及分子育种中的应用。
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