CN109609679A - 鉴别灵芝菌株gims1524的特征性核苷酸序列、核酸分子探针、试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴别灵芝菌株GIMS1524的特征性核苷酸序列、核酸分子探针、试剂盒和方法。所述特征性核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该核酸分子探针包括GIM24‑F:5'‑CCGTCCTCTTCGGTATGTC‑3'；GIM24‑R:5'‑GTGGTCTGTGTATTGTTTG‑3'。该鉴别方法采用核酸分子探针GIM24‑F和GIM24‑R作为PCR引物，利用PCR方法鉴定。采用本发明方法可以实现对灵芝菌株GIMS1524的快速鉴别。本发明的核酸分子探针专一性强，鉴别方法迅速准确，特异性好。
Description
技术领域
本发明涉及利用分子生物学方法鉴别珍稀食药用菌品种的技术领域，具体涉及一种鉴别灵芝菌株GIMS1524的特征性核苷酸序列、核酸分子探针、试剂盒和方法。
背景技术
灵芝(赤芝)是中国名贵中药材，灵芝在我国已有2000多年的药用历史，被历代医药家视为滋补强壮、扶正固本的神奇珍品，经过大量临床研究，灵芝具有调节免疫、抗肿瘤、保肝解毒、防治心血管系统疾病、抗衰老、抗神经衰弱、降血糖血压、抗过敏等功效。
野生灵芝GIMS1524栽培性状稳定良好，生物转化率高，且多糖等活性成分含量也显著高于市场上流通的赤芝，具有较好的开发利用价值。因此，快速且准确地鉴别野生灵芝GIMS1524的方法和技术是优质野生灵芝菌株商业化生产的重要技术保障，对其的开发利用具有重要的意义。
DNA是生物遗传信息的载体，每个生物物种乃至个体均具有独特的特征性核苷酸序列，且具有一定的稳定性，不会受到环境或培养等条件的影响而改变，是该生物物种或个体区别于其它生物物种或个体的重要标志，因而是用来鉴定物种或个体的可靠依据。随着分子生物学技术的快速发展，真菌的快速检测鉴定已成为可能。目前常用的分子鉴定方法主要有RAPD、AFLP、RFLP、rDNA序列分析和特异性引物的PCR检测等。简单重复系列区间(inter-simple sequence repeat，ISSR)是Zietkeiwitcz等于1994年提出，在是在简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)基础上发展起来的1种新型分子标记技术，其基本原理是以锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的3'端或5'端加上2-4个随机核苷酸，通过PCR扩增两侧具有反向排列SSR的一段序列，然后利用电泳技术，根据谱带的有无及相对位置分析其多态性。由于在真核生物基因组上普遍存在SSR序列，且发生变异和进化的频率较快，而ISSR标记却可以反映基因组DNA上的许多位点的差异，所以该标记在种内亲缘关系的鉴定上更有优势，被广泛应用于真菌的遗传多样性、菌株鉴别等方面，而应用该方法找到目标菌株的特异条带，并进行克隆测序，再设计特异引物，将找到目标菌株专有的特征性核苷酸。目前，已有部分用于鉴定真菌菌株的核苷酸特征序列获得专利，但由于野生灵芝GIMS1524是研究团队历时6年对全国各大自然保护区的野生大型真菌资源调查收集并研究后获得的优质菌株，且应用ISSR分子标记找到目标菌株的特异条带，并通过克隆测序、特异引物设计验证，从而获得菌株专属特异探针的方法在灵芝上的应用，并未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种用于鉴别灵芝菌株GIMS1524的特征性核苷酸序列，该特征性核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供一种用于鉴别灵芝菌株GIMS1524的核酸分子探针，该核酸分子探针包括如下：
GIM24-F:5'-CCGTCCTCTTCGGTATGTC-3'；
GIM24-R:5'-GTGGTCTGTGTATTGTTTG-3'。
上述的核酸分子探针是以灵芝菌株GIMS1524的特征性核苷酸序列(SEQ ID NO.1)为基础，设计出的专一性极强的用于鉴别灵芝菌株GIMS1524的核酸分子探针，经实验证实，该核酸分子探针具有极高的特异性，只与灵芝菌株GIMS1524进行PCR反应，扩增出特异性片段，而不与其它的23种灵芝菌株(包括2个野生菌株和21个市场流通菌株)发生PCR反应，因此，利用该探针通过PCR方法即可对灵芝菌株GIMS1524进行快速准确的鉴别。
本发明的第三个目的是提供一种鉴别灵芝菌株GIMS1524的试剂盒，包括核酸分子探针和常规PCR反应试剂，所述的核酸分子探针为：
GIM24-F:5'-CCGTCCTCTTCGGTATGTC-3'；
GIM24-R:5'-GTGGTCTGTGTATTGTTTG-3'。
本发明的第四个目的是提供一种鉴别灵芝菌株GIMS1524的方法，采用上述的核酸分子探针GIM24-F和GIM24-R作为PCR引物，以待测样品基因组DNA为模板，利用PCR方法鉴定待测样品是否是灵芝菌株GIMS1524。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明基于灵芝菌株GIMS1524的特征性核苷酸序列SEQ ID NO.1，设计了一对特异性核酸分子探针GIM24-F和GIM24-R，以该核酸分子探针为引物，以灵芝菌株GIMS1524DNA为模板进行PCR扩增，从而实现对灵芝菌株GIMS1524的快速鉴别。实验证实，本发明的核酸分子探针专一性强，鉴别方法迅速准确，方法简单且特异性好。
附图说明
图1为灵芝的ISSR(809)分子标记图。其中M:DNA Marker，1:灵芝菌株M150311，2:灵芝菌株GIMS1524，4:灵芝菌株MC-GL-0043，5:灵芝菌株MC-GL-0044，6:灵芝菌株MC-GL-0045，7:灵芝菌株MC-GL-0046，8:灵芝菌株MC-GL-0047，9:灵芝菌株MC-GL-0048，10:灵芝菌株MC-GL-0049，11:灵芝菌株MC-GL-0050，12:灵芝菌株MC-GL-0051，13:灵芝菌株MC-GL-0052，14:灵芝菌株MC-GL-0053，15:灵芝菌株MC-GL-0054，16:灵芝菌株MC-GL-0055，17:灵芝菌株MC-GL-0056，18:灵芝菌株MC-GL-0057，19:灵芝菌株MC-GL-0058，20:灵芝菌株MC-GL-0059，21:灵芝菌株MC-GL-0060，22:灵芝菌株MC-GL-0061，23:灵芝菌株MC-GL-0062。
图2为在野生灵芝菌株GIMS1524的特征性核苷酸序列基础上设计核酸分子探针(特异性引物)的设计位点。
图3为野生灵芝菌株GIMS1524的特异引物(核酸分子探针)扩增产物测序结果。
图4为野生灵芝菌株GIMS1524的特异引物(核酸分子探针)对24种灵芝菌株进行鉴别的PCR产物电泳图谱。其中M:DNA Marker，1:灵芝菌株GIMS1524，2:灵芝菌株M150311，3:灵芝菌株W140201，4:灵芝菌株MC-GL-0043，5:灵芝菌株MC-GL-0044，6:灵芝菌株MC-GL-0045，7:灵芝菌株MC-GL-0046，8:灵芝菌株MC-GL-0047，9:灵芝菌株MC-GL-0048，10:灵芝菌株MC-GL-0049，11:灵芝菌株MC-GL-0050，12:灵芝菌株MC-GL-0051，13:灵芝菌株MC-GL-0052，14:灵芝菌株MC-GL-0053，15:灵芝菌株MC-GL-0054，16:灵芝菌株MC-GL-0055，17:灵芝菌株MC-GL-0056，18:灵芝菌株MC-GL-0057，19:灵芝菌株MC-GL-0058，20:灵芝菌株MC-GL-0059，21:灵芝菌株MC-GL-0060，22:灵芝菌株MC-GL-0061，23:灵芝菌株MC-GL-0062，24:灵芝菌株MC-GL-0063。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
以下实施例所使用的样品为灵芝市场流通菌株及野生菌株。具体见下表：
表1实验菌株
*备注：中国的灵芝(赤芝)一直以来误以Ganoderma lucidum为拉丁名，直到2013年，戴玉成老师的研究团队发现，我国广泛分布和栽培的灵芝(赤芝)和与产于欧洲的G.lucidum不同，故更名为Ganoderma lingzhi。目前科研界已认可中国灵芝新的拉丁名，但是药典等的更新尚滞后。
实施例1灵芝菌株GIMS1524特征性核苷酸序列的获得
1.灵芝基因组DNA模板的提取
灵芝接种于PDA平板上，25℃暗培养7-10天，收集菌丝体，研磨成粉后按照Magen(美基生物)的HiPure Fungal DNA KitⅡ真菌DNA提取试剂盒的说明书，进行总DNA提取，获得灵芝的基因组总DNA。
2.野生灵芝GIMS1524的特异条带探索
以野生灵芝GIMS1524以及21个灵芝菌株(包括1个野生菌株(菌株M150311)和20个市场流通菌株(菌株MC-GL-0043至MC-GL-0062))的基因组总DNA为模板，以100多条ISSR引物为引物。
反应体系为50μL总体积：DNA模板5μL，引物(10μmol/L)4μL×2，2×PCR Taqmix25μL，ddH2O 12μL。PCR反应条件:94℃5min；94℃1min，40℃-60℃(不同ISSR引物退火温度不同，先预实验摸索获得各引物最佳退火温度)45s，72℃1min，30cycle；72℃8min。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳，分析不同菌株在同一引物下的多样性条带，最终找到野生灵芝GIMS1524的特异条带，即：以809(5'-AGAGAGAGAGAGAGAGG-3')为引物扩增的产物，进行1％琼脂糖凝胶电泳，发现仅有菌株GIMS1524在约1100bp处有一亮条带，其余菌株均未发现。结果见图1。
3.野生灵芝GIMS1524的特异条带的回收克隆、测序
将获得的野生灵芝GIMS1524的特异条带进行切胶回收，T载体克隆，测序，得到的序列长为1146bp，如序列表的SEQ ID NO.1所示。
实施例2灵芝菌株GIMS1524核酸分子探针的设计及验证
(1)核酸分子探针的设计
利用primer premier 5.0软件对野生灵芝GIMS1524的特征性核苷酸序列进行引物设计，得到特异性引物对(核酸分子探针)，分别为GIM24-F:5'-CCGTCCTCTTCGGTATGTC-3'；GIM24-R:5'-GTGGTCTGTGTATTGTTTG-3'。所述的特异性引物的设计位点见图2。
(2)特异引物对的验证
以野生灵芝GIMS1524的基因组DNA作为模版，以GIM24-F:5'-CCGTCCTCTTCGGTATGTC-3'和GIM24R:5'-GTGGTCTGTGTATTGTTTG-3'作为引物，反应体系为50μL总体积：DNA模板5μL，引物(10μmol/L)4μL×2，2×PCR Taqmix 25μL，ddH2O 12μL。PCR反应条件:94℃5min；94℃45s，49℃30s，72℃45s，35cycle；72℃5min。将PCR产物进行条带回收，送华大基因测序。结果发现序列即为所设计引物的中间区段序列，见图3。
实施例3灵芝菌株GIMS1524的鉴别
以野生灵芝GIMS1524以及23个灵芝菌株(包括2个野生菌株(菌株M150311和菌株W140201)和21个市场流通菌株(菌株MC-GL-0043至菌株MC-GL-0063))的基因组DNA作为模版，以GIM24-F:5'-CCGTCCTCTTCGGTATGTC-3'和GIM24-R:5'-GTGGTCTGTGT ATTGTTTG-3'作为引物，按照实施例2的反应条件进行PCR扩增，再用1％的琼脂糖凝胶电泳成像，当电泳图上出现大小约420bp的目标条带，则说明样品为野生灵芝GIMS1524，否则则不是。结果见图4。
由图4可知，野生灵芝GIMS1524能够扩增出大小约420bp的特异性片段，而其他灵芝种样品均没有扩增到任何片段，这表明本发明的核酸分子探针具有极高的特异性，因此可以用于野生灵芝GIMS1524的快速鉴定。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
广东粤微食用菌技术有限公司
<120> 鉴别灵芝菌株GIMS1524的特征性核苷酸序列、核酸分子探针、试剂盒和方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1146
<212> DNA
<213> 灵芝菌株 GIMS1524(Ganoderma Lucidum Karst GIMS1524)
<400> 1
tagagagaga gagagaggcc accagtgacg accacccccc gggaccgcag ccaatgggtc 60
atgccttcgc cccctccaca gcccatcagc acttgaggct gcatgcatcg ggccaaccca 120
agcgagcagc cagaccttgg acgccgtcgc gggctgcagc gaggcggccc tcgaaaccag 180
ccaaaacgag gctgcaccca tggtgatcgg gcgtacattt catgtaggtg ggcagttact 240
gtatgtacca agtctgcagc ccatgcttgt cgtacagtac tacttatgta gaggccattg 300
gggtacatgc ttcatgtact actgtacttg aagagatact cgcaaacgtg tggactgcag 360
tgtacagact gcatgtatgt acgccgcaga ggtactgaat taaccaagtc tgcccaccca 420
tcgacgccgt cccatgcggg ccccctcccc tccctctccc tcctccacac tgctccttcc 480
agtcactcac tcacccagcc tgcgccgcat cgccgtcctc ttcggtatgt ccagcacccg 540
cgctgttagg caacaggttg cctcgtttgg gagccgctcg acgctgctcc ctttgcggtc 600
tgcccccggc cggcccaggc ttccatggca tccatggcag gcagacaggc gtgaaagtgc 660
tggtccctga tgccgtcgtc ggccgcggcc cattgaggca tacacgccgg tgttcgtctc 720
gtcccgaacg ccagagcgaa cggtcaaacg ctccacatgg cccctcacct ccgatgaacc 780
acgatccgcc cgctgcagat gcaacaatgc ggccctgcgg taccgtccag gcagccgccc 840
atgtgcggcc ctgcgcacca aaagcatgac aggtacatac agtctgcaga ctacagagta 900
cataccacag atgacaaaca atacacagac cacagcggct ccaaacgccc gccatccctg 960
tccggcgtac atgaagccgg cccacgatcg ccgacccggc ggcagtgact cttcctcatg 1020
agcggcggca gaccagtcgt tgacgagacg aacggaacgc ccactcaccg aacaagctgc 1080
acattttctg gcgtcgcaca cccctaccca attccacgcc gcagctgccc tctctctctc 1140
tctcta 1146
Claims (4)
1.一种鉴别灵芝菌株GIMS1524的特征性核苷酸序列，其特征在于，所述特征性核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种鉴别灵芝菌株GIMS1524的核酸分子探针，其特征在于，所述的核酸分子探针包括GIM24-F:5'-CCGTCCTCTTCGGTATGTC-3'；
GIM24-R:5'-GTGGTCTGTGTATTGTTTG-3'。
3.一种鉴别灵芝菌株GIMS1524的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的核酸分子探针和常规PCR反应试剂。
4.一种鉴别灵芝菌株GIMS1524的方法，其特征在于，采用权利要求2所述的核酸分子探针作为PCR引物，以待测样品基因组DNA为模板，利用PCR方法鉴定待测样品是否是灵芝菌株GIMS1524。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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