CN108103229A - 克柔念珠菌str分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了克柔念珠菌STR分子标记及其应用，其中共包括46个高度多态的微卫星位点（SEQ ID NO:1‑40）。同时，提供了一套能够高效扩增克柔念珠菌群体的特导性引物（SEQ ID NO:41‑120）和检测条件。这一套克柔念珠菌的微卫星标记，不仅可以用于球形孢子丝菌的遗传背景分析和分子溯源，同时也可应用于球形孢子丝菌的分子流行病学、群体遗传学和系统进化分析。

Description

克柔念珠菌STR分子标记及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及克柔念珠菌STR分子标记及其应用。
背景技术
克柔念珠菌(Candida krusei，同物异名Pichia kudriavzevii、Issatchenkiaorientalis)是一种全球范围内临床重要的致病性真菌。克柔念珠菌可引起多种类型的感染，包括皮肤感染、角膜炎、念珠菌血症等。该种病原对临床常用的抗真菌药物——氟康唑(Fluconazole)具有天然耐药性。因此，对于克柔念珠菌的分子生物学研究具有重要的科学意义和临床价值。
目前，用于克柔念珠菌主要分子标记仍然是ITS、beta-tublin、Calmodulin等，但这些序列的种内多态性较低，无法满足克柔念珠菌的分子溯源、群体遗传学和分子流行病学研究等工作的需要。因此，本发明所提供的种内高度多态的微卫星位点标记及其扩增方法，具体重要的意义。
微卫星，有时称为SSR(simple sequence repeats)，STR(short tandemrepeats)，VNTR(variable number tandem repeats)，指基因组DNA上的串联重复序列，重复单元一般为1-6bp，重复次数一般为5-40次。此为核心区域，而在其两侧有相对保守的侧翼序列。通过在保守的侧翼序列设计PCR引物，检测PCR产物的长度，可以进行遗传多态性分析。该检测方法具有多态性高，特异性好，共显性遗传，成本低，通量高等优点，因此在分子生态学、分子育种等方面已有着比较广泛的应用。而在病原真菌方面，目前应用相对较少，其中一个重要原因在于真菌中的微卫星位点相对较少，获得微卫星位点信息的难度较大。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供克柔念珠菌STR分子标记及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种克柔念珠菌STR分子标记，所述STR分子标记为SEQ IDNO:1-40所示序列中的任一个。
本发明还提供克柔念珠菌STR分子标记组合，所述STR分子标记组合为权利要求1所述STR分子标记中的任意两个或多个组合。
本发明还提供用于检测上述STR分子标记的引物
优选的是，40个STR分子标记对应的引物序列分别如SEQ ID NO:41-120所示。其中，SEQ ID NO:1所示序列的STR分子标记对应的引物序列为SEQ ID NO:41-42，SEQ ID NO:2所示序列的STR分子标记对应的引物序列为SEQ ID NO:43-44，SEQ ID NO:3所示序列的STR分子标记对应的引物序列为SEQ ID NO:45-46，以此类推。
本发明还提供用于检测上述STR分子标记的试剂盒。
本发明还提供STR分子标记单独或组合使用在克柔念珠菌的分子分型、分子溯源、群体遗传学和系统进化分析中的应用。
本发明还提供STR分子标记的检测方法，包括以下步骤：
(1)提取克柔念珠菌的基因组DNA；
(2)合成SEQ ID NO:41-120所示的引物，并使用荧光染料对正向引物5'端进行标记，获得荧光标记的引物组；
(3)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用步骤(2)荧光标记的引物组进行PCR扩增；
(4)对扩增产物中的单色荧光标记DNA片段进行多态性检测。
优选的是，步骤(3)采用的PCR反应体系为：2×Premix Taq 10ul，10uM正、反向引物各1ul，纯水7ul，DNA模板1ul；
PCR程序为：95℃5min；95℃30sec，56-62℃30sec，72℃40sec，33个循环；72℃5min。
本发明还提供非诊断目的克柔念珠菌检测方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样品DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用SEQ ID NO:41-120所示的引物进行PCR扩增；
(3)分析PCR扩增产物。
本发明的有益效果是：本发明首次提供一套克柔念珠菌的微卫星位点(STR分子标记)组合，其中共包括40个高度多态的微卫星位点(SEQ ID NO:1-40)。同时，提供了一套能够高效扩增克柔念珠菌群体的特导性引物(SEQ ID NO:41-120)和检测条件。这一套克柔念珠菌的微卫星标记，不仅可以用于球形孢子丝菌的遗传背景分析和分子溯源，同时也可应用于球形孢子丝菌的分子流行病学、群体遗传学和系统进化分析。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1克柔念珠菌STR位点的筛选/获得及引物设计
基于克柔念珠菌的基因组测序结果，利用SciRoKo软件从基因组测序数据中分离出微卫星座位200个。经过筛选后，通过Primer premier 5.0软件设计了微卫星的相关引物共150对，并通过e-PCR对相关引物进行了初步验证。选择一株球形孢子丝菌，通过梯度PCR，对上述引物进行验证(同时判定其合适的退火温度)，其中107对引物能够稳定扩增。任选10株来源不同的克柔念珠菌，进行遗传多态性检测后，最终得到40个能稳定扩增，且条带清晰的STR位点，具体如表1所示。
表1克柔念珠菌的微卫星座位
实施例2克柔念珠菌的种群遗传多样性检测
1、克柔念珠菌的基因组DNA提取
用购自北京康为世纪生物科技有限公司的酵母基因组DNA提取试剂盒(CW0569S)完成22株克柔念珠菌的基因组DNA提取，操作流程参照试剂盒说明书进行。21株克柔念珠菌由北京协和医院检验科提供。
2、微卫星PCR扩增
利用本发明的微卫星位点特异性引物对步骤中所提取的21个克柔念珠菌样品进行扩增。对克柔念珠菌的微卫星标记特异引物进行荧光标记，方法为使用荧光染料对正向引物5'端进行FAM标记。
PCR反应体系为20ul，其中包括2×Premix Taq(TAKARA，货号R004Q)10ul，正、反向引物(10uM)各1ul，纯水7ul，DNA模板1ul。PCR程序为：95℃5min；95℃30sec，56-62℃(具体见表1)30sec，72℃40sec，33个循环；72℃5min。
3、利用ABI 3730测序仪对扩增出的单色荧光标DNA片段进行多态性检测。检测结束后，使用GeneMarker v2.2进行位点分析。然后，以Cervus 3.0和GenAlEx 6.41对所得的群体数据进行计算，并对25个位点进行评估。结果如表2所示。
表2克柔念珠菌的微卫星位点的基本信息
注：a，有效等位基因数目；b，多态性信息含量(polymorphic informationcontent)。
其中，40个位点的平均PIC为0.4565，累积个体识别率为1.0000。
依据群体检测结果，克柔念珠菌遗传多态性偏低，分子分型相对困难，但通过多个微卫星位点的组合，仍可获得比较好的分型效果。以上实验结果表明，本发明的40个STR位点是真实有效的，能够有效用于克柔念珠菌的分子分型。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (9)

1.克柔念珠菌STR分子标记，其特征在于，所述STR分子标记为SEQ ID NO:1-40所示序列中的任一个。
2.克柔念珠菌STR分子标记组合，其特征在于，所述STR分子标记组合为权利要求1所述STR分子标记中的任意两个或多个组合。
3.用于检测权利要求1所述STR分子标记的引物。
4.根据权利要求3所述的引物，其特征在于，40个STR分子标记对应的引物序列分别如SEQ ID NO:41-120所示。
5.用于检测权利要求1所述STR分子标记的试剂盒。
6.根据权利要求1所述STR分子标记单独或组合使用在克柔念珠菌的分子分型、分子溯源、 群体遗传学和系统进化分析中的应用。
7.根据权利要求1所述STR分子标记的检测方法，其特片在于，包括以下步骤：
(1)提取克柔念珠菌的基因组DNA；
(2)合成SEQ ID NO:41-120所示的引物，并使用荧光染料对正向引物5'端进行标记，获得荧光标记的引物组；
(3)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用步骤(2)荧光标记的引物组进行PCR扩增；
(4)对扩增产物中的单色荧光标记DNA片段进行多态性检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其特片在于，步骤(3)采用的PCR反应体系为：2×PremixTaq 10ul，10uM正、反向引物各1ul，纯水7ul，DNA模板1ul；
PCR程序为：95℃ 5min；95℃ 30sec，56-62℃ 30sec，72℃ 40sec，33个循环；72℃5min。
9.非诊断目的克柔念珠菌检测方法，其特片在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样品DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用SEQ ID NO:41-120所示的引物进行PCR扩增；
(3)分析PCR扩增产物。
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