CN110184376A

CN110184376A - 高卢蜜环菌的pcr-rflp鉴别方法

Info

Publication number: CN110184376A
Application number: CN201910419080.7A
Authority: CN
Inventors: 袁媛; 蒋超; 周骏辉; 南铁贵; 梁宇庭; 张敏; 黄璐琦
Original assignee: Hubei Meng Yang Medicine Products Co ltd; Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Hubei Meng Yang Medicine Products Co ltd; Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2019-05-20
Filing date: 2019-05-20
Publication date: 2019-08-30
Anticipated expiration: 2039-05-20
Also published as: CN110184376B

Abstract

本发明公开了高卢蜜环菌的PCR‑RFLP鉴别方法。本发明提供了用于鉴定或辅助鉴定待测蜜环菌为A型蜜环菌还是B型蜜环菌的引物对，是通过包括如下步骤的方法设计得到的：将SEQ ID No.5与SEQ ID No.6进行序列比对，得到DNA比对序列矩阵；然后根据所述DNA比对序列矩阵中第550位核苷酸之前的保守区域设计上游引物，根据所述DNA比对序列矩阵中第555位核苷酸之后的保守区域设计下游引物；所述上游引物和所述下游引物组成所述引物对。本发明方法可以有效鉴别A型蜜环菌和B型蜜环菌。本发明为市售菌株鉴别提供一种快速、客观的检测方法，为栽培生产中高卢蜜环菌的高效利用奠定基础。

Description

高卢蜜环菌的PCR-RFLP鉴别方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及高卢蜜环菌的PCR-RFLP鉴别方法。

背景技术

蜜环菌是担子菌门、蜜环菌属的兼性寄生性真菌，广泛分布于世界各地。在中药材天麻和猪苓的生长过程中，蜜环菌为他们提供营养，因此蜜环菌菌种的优劣直接影响天麻和猪苓产量。蜜环菌中含有丰富的糖苷水解酶，能将植物的多糖水解成单糖供其自身生长使用。因此，水解多糖的能力是影响蜜环菌营养获取和生长发育的关键因素。目前市售蜜环菌菌种主要为高卢蜜环菌，但不同地区高卢蜜环菌的基因型存在差异，也可能导致其水解多糖能力存在差异。因此，在栽培过程中，常出现因蜜环菌菌种差异导致天麻、猪苓的产量和品质存在差异。

市售高卢蜜环菌资源繁多，但其在外形上很难进行分辨。DNA分子标记技术在中药的真伪鉴别与质量评价等相关研究已成功运用多年。聚合酶链反应-限制性内切酶酶切长度多态性(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)技术是一种快速便捷分析物种组成的方法，已广泛应用于动植物中药的真伪鉴别。

发明内容

本发明利用高卢蜜环菌蔗糖酶基因序列设计PCR-RFLP鉴别方法，旨在为市售菌株鉴别提供一种快速、客观的检测方法，为栽培生产中高卢蜜环菌的高效利用奠定基础。

第一方面，本发明要求保护一种用于鉴定或辅助鉴定待测高卢蜜环菌为高卢蜜环菌A型还是高卢蜜环菌B型的引物对。

本发明所要求保护的用于鉴定或辅助鉴定待测高卢蜜环菌为高卢蜜环菌A型还是高卢蜜环菌B型的引物对，具体可通过包括如下步骤的方法设计得到：将SEQ ID No.5与SEQID No.6进行序列比对，得到DNA比对序列矩阵(如图1所示)；然后根据所述DNA比对序列矩阵中第550位核苷酸之前的保守区域设计上游引物，根据所述DNA比对序列矩阵中第555位核苷酸之后的保守区域设计下游引物；所述上游引物和所述下游引物组成所述引物对。

所述DNA比对序列矩阵具体可为采用序列比对软件(如DNAMAN等)将SEQ ID No.5与SEQ ID No.6进行比对，软件直接输出的比对结果图谱(图谱上所标注的位置信息即为在DNA比对序列矩阵中的位置)。

进一步地，所述引物对可为如下(a)或(b)：

(a)由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对；

(b)由将SEQ ID No.1和SEQ ID No.2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(a)中所述引物对功能相同的引物对。

第二方面，本发明要求保护用于鉴定或辅助鉴定待测高卢蜜环菌为高卢蜜环菌A型还是高卢蜜环菌B型的试剂盒。

本发明所要求保护的用于鉴定或辅助鉴定待测高卢蜜环菌为高卢蜜环菌A型还是高卢蜜环菌B型的试剂盒，含有前文第一方面所述的引物对和限制性内切酶EcoR V或其同裂酶。

根据需要，所述试剂盒中还可含有用于PCR扩增和/或酶切的常规反应试剂。

第三方面，本发明要求保护前文第一方面所述的引物对或前文第二方面所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测高卢蜜环菌为高卢蜜环菌A型还是高卢蜜环菌B型中的应用。

第四方面，本发明要求保护一种利用前文第一方面所述引物对鉴定或辅助鉴定待测高卢蜜环菌为高卢蜜环菌A型还是高卢蜜环菌B型的方法(PCR法)。

该方法(PCR法)可包括如下步骤：

(A1)从待测高卢蜜环菌中提取基因组DNA作为模板，采用由SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示的两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；

(A2)按照如下方法确定所述待测高卢蜜环菌为高卢蜜环菌A型还是高卢蜜环菌B型：若所述PCR产物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，则所述待测高卢蜜环菌为或候选为高卢蜜环菌A型；若所述PCR产物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示(PCR产物有两种，一种是“SEQ ID No.4的第120位为A、第185位为C、第235位为C”，另一种是“SEQ ID No.4的第120位为C、第185位为T、第235位为T”)，则所述待测高卢蜜环菌为或候选为高卢蜜环菌B型。

第五方面，本发明要求保护一种利用前文第二方面所述试剂盒鉴定或辅助鉴定待测高卢蜜环菌为高卢蜜环菌A型还是高卢蜜环菌B型的方法(PCR-RFLP法)。

该方法(PCR-RFLP法)可包括如下步骤：

(B1)从待测高卢蜜环菌中提取基因组DNA作为模板，采用由SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示的两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；

(B2)采用限制性内切酶EcoR V对步骤(B1)所得PCR产物进行完全酶切；

(B3)按照如下方法确定所述待测高卢蜜环菌为高卢蜜环菌A型还是高卢蜜环菌B型：若经步骤(B2)酶切获得的DNA片段为如下(a1)，则所述待测高卢蜜环菌为或候选为高卢蜜环菌A型；若经步骤(B2)酶切获得的DNA片段为如下(a2)，则所述待测高卢蜜环菌为或候选为高卢蜜环菌B型：

(a1)大小为304bp的一个DNA片段；

(a2)大小分别为304bp、183bp和121bp的三个DNA片段。

进一步地，在所述(a1)中，大小为304bp的DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID No.3。

进一步地，在所述(a2)中，大小为304bp的DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID No.4，且SEQ ID No.4的第120位为A，第185位为C，第235位为C；大小为183bp的DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID No.4的第1-183位，且第120位为C；大小为121bp的DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID No.4的第184-304位，且对应SEQ ID No.4的第185位为T，对应SEQ ID No.4的第235位为T。

在上述第四方面和第五方面中，进行所述PCR扩增时，采用的退火温度可为52～58℃；具体可为56℃。

在上述第四方面和第五方面中，进行所述PCR扩增时，采用的PCR反应循环数可为30～40个循环；具体可为35个循环。

在上述第四方面和第五方面中，进行所述PCR扩增时，采用的DNA模板量可为8～200ng；具体可为200ng。

在上述第五方面中，采用的限制性内切酶EcoR V的用量可为0.25～1U；具体可为0.5U。

在上述第五方面中，采用限制性内切酶EcoR V进行酶切的时间可为10～30min；具体可为20min。

在本发明中，所述高卢蜜环菌A型为菌株干重(-80℃冷冻干燥48h)时葡萄糖含量大于120μg/g的高卢蜜环菌菌种；所述高卢蜜环菌B型为菌株干重(-80℃冷冻干燥48h)时葡萄糖含量小于等于120μg/g的高卢蜜环菌菌种。

本发明利用高卢蜜环菌蔗糖酶基因序列设计PCR-RFLP鉴别方法，结果证实本发明方法可以有效鉴别高卢蜜环菌A型和高卢蜜环菌B型。高卢蜜环菌A型和B型含糖量不同，生长速度上有区别，鉴别高卢蜜环菌A型和B型有助于选育出高效高卢蜜环菌，澄清天麻栽培过程中共生高卢蜜环菌种质混乱的问题，为栽培生产中高卢蜜环菌的高效利用奠定基础。

附图说明

图1为高卢蜜环菌A型和B型菌株的形态。A为高卢蜜环菌A型；B为高卢蜜环菌B型。

图2为高卢蜜环菌A型和B型菌株PCR-RFLP鉴别策略。注：兼并碱基Y＝C/T；M＝A/C；R＝A/G。

图3为高卢蜜环菌菌株PCR-RFLP电泳结果。A为PCR产物电泳结果；B为EcoR V酶切产物电泳结果。M为DL2000 Mark(条带大小自下而上依次为100、250、500、750、1000、2000bp)；1～10为10个不同的卢蜜环菌A型菌株；11～20为10个不同的卢蜜环菌B型菌株。

图4为高卢蜜环菌特异性PCR鉴别条件考察结果。A：退火温度；B：循环数；C：DNA模板量；D：限制性内切酶用量；E：酶切时间。M：DL2000 Marker；1、3、5、7：高卢蜜环菌A型；2、4、6、8：高卢蜜环菌B型。

图5为DNA聚合酶种类和PCR仪对高卢蜜环菌A型、B型特异性PCR鉴别的影响。A为DNA聚合酶种类；B为PCR仪。M：DL2000 Marker；1、3、5：高卢蜜环菌A型；2、4、6：高卢蜜环菌B型。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、PCR-RFLP法鉴别高卢蜜环菌A型和高卢蜜环菌B型

一、高卢蜜环菌A型和高卢蜜环菌B型的筛选

收集了市售13个地区的高卢蜜环菌，在基因水平和代谢水平上筛选出了葡萄糖含量具有显著差异的两种高卢蜜环菌，即高卢蜜环菌A型和高卢蜜环菌B型(图1)。

高卢蜜环菌A型为菌株干重(-80℃冷冻干燥48h)时葡萄糖含量大于120μg/g的高卢蜜环菌菌种；高卢蜜环菌B型为菌株干重(-80℃冷冻干燥48h)时葡萄糖含量小于等于120μg/g的高卢蜜环菌菌种。

二、鉴定高卢蜜环菌A型和高卢蜜环菌B型的试剂盒的组成

本发明用于鉴定鉴定高卢蜜环菌A型和高卢蜜环菌B型的试剂盒，是基于PCR-RFLP技术设计的，含有由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA分子组成的引物对，以及限制性内切酶EcoR V。其设计过程大致如下：

通过分别克隆高卢蜜环菌A型的蔗糖酶基因全长序列(SEQ ID No.5)和高卢蜜环菌B型的蔗糖酶基因全长序列(SEQ ID No.6)，并进行序列比对后发现，两种高卢蜜环菌蔗糖酶基因存在碱基差异(图2)。其中高卢蜜环菌B型的蔗糖酶基因为杂合子(554 T/C)，且第550～555位为EcoR V限制性内切酶(5’～GATATC～3’)识别序列，而A型高卢蜜环菌的蔗糖酶基因为纯合子(554C)。据此选择该位点两侧保守序列设计特异性引物，用于扩增高卢蜜环菌特征片段；在此基础上，选择EcoR V限制性内切酶对扩增片段进行酶切，利用酶切片段条带多态性鉴定高卢蜜环菌菌株。其中，A型菌株因其EcoR V无识别序列，理论上可检测到一个304bp片段；B型菌株因其为杂合子、且具有EcoR V酶切位点，理论上可检测到304bp和183bp、121bp三个片段。

其中，引物对为：

ZTM.F：5’-CGAACGGGAAGCCGAAAT-3’(SEQ ID No.1)；

ZTM.R：5’-TGAGATCAATGACGGGAGTT-3’(SEQ ID No.2)。

引物对由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR产物长度为304bp，Tm值为52～58℃。

理论上，采用上述引物对进行扩增，高卢蜜环菌A型扩增产物序列如SEQ ID No.3所示；高卢蜜环菌B型扩增产物序列如SEQ ID No.4(PCR产物有两种，一种是“SEQ ID No.4的第120位为A、第185位为C、第235位为C”，另一种是“SEQ ID No.4的第120位为C、第185位为T、第235位为T”)所示。

三、基于PCR-RFLP鉴定高卢蜜环菌A型和高卢蜜环菌B型

1、材料

(1)菌种

高卢蜜环菌A型和高卢蜜环菌B型菌种保存于中国中医科学院中药资源中心，是购买的市售高卢蜜环菌，按照步骤一中的标准区分出的高卢蜜环菌A型(-80℃冷冻干燥48h时葡萄糖含量大于120μg/g干重)和高卢蜜环菌B型(-80℃冷冻干燥48h时葡萄糖含量小于等于120μg/g干重)菌种。

(2)试剂

Plant Genomic DNA Kit植物基因组DNA提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品；Ex Taq DNA聚合酶(批号RR001B)，SpeedSTAR HS Taq DNA聚合酶(批号RR070A)，rTaq DNA聚合酶(批号R001B)，均为大连Takara公司产品；2000bp DNA Marker(北京全式金生物技术有限公司，批号BM101)；EcoR V限制性内切酶为NEB公司产品；其他试剂均为国产分析纯。

(3)仪器

PCR仪：Veriti^TM型(Applied Biosystem公司)、GeneAmp 9700型(AppliedBiosystem公司)、PTC～100型(Gene公司)；5810R型高速冷冻离心机(Eppendorf公司)；VORTEX～2GENIE漩涡震荡仪(Scientific industries公司)；PowerPac^TM型电泳仪(Bio～Rad公司)；HE99X～15～1.5型电泳槽(Hoefer公司)；SYNGENE凝胶成像系统(GENE公司)；Nanodrop 2000型微量核酸定量分析仪(Thermo Scientific公司)。

2、方法

第一步：基因组DNA提取

取高卢蜜环菌菌丝，粉碎后，取10mg粉末，利用Plant Genomic DNA Kit植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取。用Nanodrop 2000微量核酸定量分析仪测定其DNA浓度，并根据吸光度A_260/A280、A_260/A230的值判断DNA质量，用于PCR反应或于～20℃保存备用。

第二步：PCR-RFLP分析

(1)PCR扩增

使用引物ZTM.F和ZTM.R对高卢蜜环菌进行PCR扩增，PCR反应体系25μL，包含10×Ex buffer 2.5μL，dNTPs(10mmol·L^～1)1.5μL，上游及下游引物各0.25μL，r Taq DNA聚合酶0.2μL，DNA模板1μL，加灭菌蒸馏水补足至25μL，反应条件如下：94℃5min，35个循环(94℃30s，56℃30s，72℃30s)，72℃5min。PCR反应结束后，取反应产物10μL，加入6×Loadingbuffer 2μL(Takara公司)，混匀后于EB染色的1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，SYNGENE凝胶成像系统观察、成像。

(2)RFLP分析

取PCR产物进行RFLP分析，酶切反应体系为25μL，包含10×Buffer 2.5μL、PCR产物15μL、EcoR V限制性内切酶(10U·μL^～1)0.5μL、dd H₂O 7μL，酶切反应在37℃水浴反应30min。取酶切产物5μL，加入1μL 6×Loading buffer，混匀后于EB染色的1.5％琼脂糖凝胶电泳检测、成像。

(3)条件考察

利用引物ZTM.F和ZTM.R对高卢蜜环菌A型和B型菌株DNA进行PCR扩增，使用EcoR V限制性内切酶进行RFLP分析，并分别考察退火温度、PCR循环数、模板DNA浓度、Taq酶种类、不同PCR仪、酶切时间对PCR-RFLP反应稳定性的影响。

3、结果与分析

(1)高卢蜜环菌PCR-RFLP分析

对高卢蜜环菌A型和B型菌株DNA使用特异性引物进行扩增，均得到304bp长度的扩增产物，如图3中A。利用EcoR V进行酶切(图3中B)，所有的A型菌株仅获得304bp片段(SEQID No.3)；所有的B型菌株获得了304bp(SEQ ID No.4，且SEQ ID No.4的第120位为A，第185位为C，第235位为C)和183bp(SEQ ID No.4的第1-183位，且SEQ ID No.4的第120位为C)两个片段，缺失了121bp片段。为了验证酶切反应的可靠性，对含有纯合子(554T)的特异性片段进行了DNA合成，并利用EcoR V进行酶切，结果可检测到183bp(SEQ ID No.4的第1-183位，且SEQ ID No.4的第120位为C)和121bp(SEQ ID No.4的第184-304位，且对应SEQ IDNo.4的第185位为T，第235位为T)两个片段，说明RFLP反应正常。

(2)条件考察

①PCR鉴别条件的考察

使用鉴别引物进行PCR扩增，退火温度为52～58℃时，均能扩增出304bp条带，均能经过酶切区分开，如图4中A。PCR反应循环次数为20～40循环时，仅20个循环无法获得条带多态性，如图4中B。为确保PCR退火温度的稳定，确定蜜环菌PCR鉴别退火温度均为56℃，PCR循环次数为35次。

对25μL PCR反应体系中的DNA模板量进行了考察，调整DNA模板量分别为200，40，8，1ng进行特异性PCR鉴别反应，结果特异性PCR鉴别体系中除模板DNA量为1ng外均扩增获得特异性鉴别结果，如图4中C。

对25μL酶切反应体系中的内切酶用量进行了考察，分别使用0.25U、0.5U、1U，结果使用不同浓度内切酶均可进行切开，如图4中D。酶切时间在10～30min之内均可以被切开，如图4中E。为确定酶切反应的稳定，确定限制性内切酶的用量为0.5U，酶切时间为20min。

②方法耐受性考察

考察不同保真度的酶对蜜环菌A、B鉴别结果的影响，表明PCR鉴别体系中使用ExTaq，r Taq，SpeedSTAR Taq等DNA聚合酶进行扩增均获得特异性鉴别结果，不同公司的酶由于活力不同而表现出扩增条带的亮度有差异，不影响鉴别结果判读，如图5中A。分别用Veriti^TM，GeneAmp 9700，PTC-100基因扩增仪进行PCR扩增，所有样品均能扩增得到亮带，表明以上3种型号的PCR仪均能进行鉴别，如图5中B。

③方法适用性考察

采用上述使用体系，对分别10批次的蜜环菌A型和B型进行PCR扩增，均能产生单一304bp条带，经过EcoR V酶切之后，蜜环菌A型无法酶切，B型能产生304bp和酶切后的183bp条带，表明该体系能稳定、准确的鉴别蜜环菌A型和B型。

4、讨论

高卢蜜环菌是名贵中药天麻和猪苓的主要共生微生物和营养来源，其生长状态对天麻和猪苓的产量和质量均具有较大影响。本发明对蜜环菌市场状况进行调查，发现多个产区市售蜜环菌大多为高卢蜜环菌，且存在两种菌株(高卢蜜环菌A型和高卢蜜环菌B型)，二者在生长速度、生物量、糖含量等方面均具有显著差异。在天麻或猪苓的栽培过程中，可根据品种、生长阶段、生态环境等不同需要，选择合适的菌株，因地制宜提升栽培天麻或猪苓的产量和品质。但是两种菌株的菌索形态相似，肉眼无法区分，需要建立客观、准确的菌株鉴定方法。

本发明从蔗糖酶基因序列入手，对两种高卢蜜环菌菌株的基因序列进行比较，发现A型菌株中的蔗糖酶基因为纯合子，而B型菌株为杂合子。通过对差异片段进行分析，发现B型菌株中含有EcoR V限制性酶识别序列，从而建立了PCR-RFLP鉴别方法，用于区分两种高卢蜜菌株。同时考察了退火温度、PCR循环数、DNA浓度、EcoR V浓度、酶切时间、PCR仪类型、DNA聚合酶种类等对该方法稳定性的影响。本发明将PCR-RFLP方法用于高卢蜜环菌菌株鉴别，具有准确、简便、重复性好等特点，能有效区别A型和B型菌株，为保障上述菌株在生产中的合理应用奠定基础。

<110> 中国中医科学院中药研究所；湖北梦阳药业股份有限公司

<120> 高卢蜜环菌的PCR-RFLP鉴别方法

<130> GNCLN190690

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

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<213> Artificial sequence

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tgagatcaat gacgggagtt 20

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

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gtcattgatc tcacgattct ccctctctcc gacggggaat acattcggtt catcaagaac 720

gagactgtcc ttcgtgtatg gagcgagcgt tccagtggcg gactctttgg aacttggacg 780

aagatcggag atgggtatgt caacccatac gtgactgagg gaccgctcgc ctttcatgac 840

aatgaggtcg agggccgtat tcacctctgg ctggatgagt atggtggtga tacgcgagtt 900

tatggatacg taccgcagta taccgacgat ggaggtgtta cttgggtgaa cggggacagg 960

gcaaatttcc ctgctttgac gaagcatggt gtggtagtgc cagtgaacca gacgcagtat 1020

gatgcgatcg aggccaaatg ggcatag 1047

Claims

1.用于鉴定或辅助鉴定待测高卢蜜环菌为高卢蜜环菌A型还是高卢蜜环菌B型的引物对，是通过包括如下步骤的方法设计得到的：将SEQ ID No.5与SEQ ID No.6进行序列比对，得到DNA比对序列矩阵；然后根据所述DNA比对序列矩阵中第550位核苷酸之前的保守区域设计上游引物，根据所述DNA比对序列矩阵中第555位核苷酸之后的保守区域设计下游引物；所述上游引物和所述下游引物组成所述引物对。

2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于：所述引物对为如下(a)或(b)：

(a)由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对；

3.用于鉴定或辅助鉴定待测高卢蜜环菌为高卢蜜环菌A型还是高卢蜜环菌B型的试剂盒，含有权利要求1或2所述的引物对和限制性内切酶EcoR V或其同裂酶。

4.权利要求1或2所述的引物对或权利要求3所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测高卢蜜环菌为高卢蜜环菌A型还是高卢蜜环菌B型中的应用。

5.一种鉴定或辅助鉴定待测高卢蜜环菌为高卢蜜环菌A型还是高卢蜜环菌B型的方法，包括如下步骤：

(A2)按照如下方法确定所述待测高卢蜜环菌为高卢蜜环菌A型还是高卢蜜环菌B型：若所述PCR产物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，则所述待测高卢蜜环菌为或候选为高卢蜜环菌A型；若所述PCR产物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，则所述待测高卢蜜环菌为或候选为高卢蜜环菌B型。

6.一种鉴定或辅助鉴定待测高卢蜜环菌为高卢蜜环菌A型还是高卢蜜环菌B型的方法，包括如下步骤：

(a1)大小为304bp的一个DNA片段；

(a2)大小分别为304bp、183bp和121bp的三个DNA片段。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：在所述(a1)中，大小为304bp的DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID No.3；

在所述(a2)中，大小为304bp的DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID No.4，且SEQ ID No.4的第120位为A，第185位为C，第235位为C；大小为183bp的DNA片段的核苷酸序列为SEQ IDNo.4的第1-183位，且第120位为C；大小为121bp的DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID No.4的第184-304位，且对应SEQ ID No.4的第185位为T，对应SEQ ID No.4的第235位为T。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：进行所述PCR扩增时，采用的退火温度为52～58℃。

9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：进行所述PCR扩增时，采用的PCR反应循环数为30～40个循环；和/或

进行所述PCR扩增时，采用的DNA模板量为8～200ng。

10.根据权利要求1-9中任一所述的引物对或试剂盒或应用或方法，其特征在于：所述高卢蜜环菌A型为时葡萄糖含量大于120μg/g菌株干重的高卢蜜环菌菌种；所述高卢蜜环菌B型为葡萄糖含量小于等于120μg/g菌株干重的高卢蜜环菌菌种。