KR20160057021A - 고려인삼과 미국삼 판별용 hrm 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 고려인삼과 미국삼 판별용 프라이머 세트에 관한 것으로서, 본 발명의 고려인삼과 미국삼 판별용 프라이머 세트 및 HMR 분석을 이용한 판별 방법은 고려인삼 및 미국삼에 존재하는 단일염기다형성을 특이적으로 증폭하여 바로 융해곡선 분석을 통해 빠르고 정확하게 고려인삼 및 미국산의 품종 구별이 가능하며, 정확성, 재현성이 높은 판별기술로 고려인삼의 진위여부 및 미국삼 혼입 등을 신속, 정확하게 판별할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 고려인삼과 미국삼 판별용 프라이머 세트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 고려인삼 품종과 미국삼을 단시간에 판별할 수 있는 HRM(High Resolution Melting)프라이머 세트에 관한 것이다.
최근 유럽을 비롯한 각 나라들은 세계 무역기구의 지적재산권협정(WTO/TRIPS)에 따라 식물품종보호제도(Plant Variety Protection System, PVPS)의 시행을 의무화하고 있다. 우리나라도 국제 식물 신품종보호동맹(International Union for the Protection of New Varieties of Plants, UPOV) 가입, 종자 산업법의 발효 및 WTO 가입에 따른 수입 농산물의 개방으로 인하여 국내외 농산물에 대한 품종 구분의 필요성이 대두되고 있으며, 농가 소득 및 육종가의 지적 재산권을 보호하기 위해서도 과학적인 품종 구분 체계를 구축하는 것은 안정적으로 종자산업 분야를 발전시켜 나가는데 아주 중요한 일로 여겨지고 있다.
과학적인 품종 구분 체계 구축의 일환으로, 종래 농산물의 원산지판별을 위하여 최근에는 비파괴기술인 근적외선 분광법, 전자코, X-선 형광분석법 등이 많이 사용되고 있으며, 특히 근적외선 분광법을 이용한 비파괴 기술은 과채류의 당도, 곡류의 함수율, 아밀로오스의 함량, 우유와 유제품의 지방, 단백질 및 고형분함량 분석에 많이 응용되고 있으며, 농산물의 품종이나 원산지를 판별하기 위하여 전기영동, HPLC 분석법 등과 같은 기존의 단백질분석법을 활용할 수 있으나 시간과 비용이 많이 소요되는 단점 및 판별하고자 하는 농산물의 판별 마커가 아직 개발되지 않은 단점이 있어 현장에서의 적용에 어려움이 있었다.
인삼은 세계적으로 한국산 고려인삼이 가장 우수한 것으로 예부터 알려져 왔다. 그러나 최근 웰빙과 천연 건강식품에 대한 관심으로 인삼 가공품 시장 규모와 원료삼의 수요가 증가함에 따라 값싼 외국삼이 밀수입되어 국내산 인삼으로 불법 유통되고 있다. 또한, 중국산 인삼이 밀무역으로 국내시장에 들어와 국내 재배 인삼의 입지를 어렵게 하고 있는 실정이고, 해외 인삼의 경우 3 ~ 4년생 인삼을 채굴하기 때문에 연근판별에 큰 의미를 두지 않으나, 국내의 경우 고년근일수록 약효가 뛰어나다는 관습적 믿음에 따라 고년근일수록 가격이 비싼 특성 때문에 유통시장에서 저년근을 6년 근으로 위장하는 사례가 빈번하여 유통질서가 교란되고 소비자 신뢰도가 떨어지는 원인이 되고 있기에 인삼의 연근판별이 큰 문제점이 되고 있는 실정이다.
향후 중국, 미국, 캐나다 등 인삼산업 경쟁국과의 자유무역협정이 발효되면 더욱 더 그 피해가 심각해질 것으로 전문가들은 예상하고 있다. 나아가, 홍콩 등 해외시장에서 한국산 고려인삼에 대한 소비자 인식이 좋아 국내 인삼 제품의 모조품까지 유통되고 있는 실정이다. 따라서 국내 인삼 재배농가들의 안정적인 소득 보장과 인삼의 유통질서를 바로잡기 위해 인삼의 과학적인 판별시스템 개발이 필요한 실정이다.
DNA 라이브러리로부터 클론의 염기서열을 확보하고 그 정보를 바탕으로 특이적인 프라이머들을 합성하여 사용하는 기법인 STS-PCR (Sequence tagged sites-polymerase chain reaction) 방법이 개발되었다 (Olson M et al . , Science, 245:1434, 1989). STS 마커는 아가로스겔에서 쉽게 결과를 확인할 수 있고 분석방법이 간단하여 대량의 유전자원 평가와 품종판별 및 유연관계 분석에 효율적으로 적용 가능하다.
최근 인삼의 품종 보호와 종자보증을 위한 품종 특이적인 마커 개발에 관련한 연구가 많이 진행되고 있으며, 고려인삼 9품종 (천풍, 연풍, 고풍, 선풍, 금풍, 선운, 선원, 청선, 선향)의 미토콘드리아 cytochrome oxidase subunit 2 (cox2) intron II 지역에서 SNP (Single nucleotide polymorphisms)를 바탕으로 인삼 품종 특이적인 마커가 연구되었다 (Wang H et al ., Molecular Biology Reports , 37:1053, 2010).
그러나 SNP를 타겟으로 하는 DNA 마커는 multiplex PCR과 같은 복잡한 과정을 거쳐야 되고 SNP 타겟의 allele specific 프라이머를 제작해야 한다. SNP allele specific PCR (AS-PCR)은 증폭 밴드의 유무의 따라 유전자형을 판단하는 우성 마커 (dominant)로써 증폭반응 시 annealing 온도에 따라 비특이적인 반응이 일어날 확률이 있어 정확한 식별에 어려움도 있다.
이에 본 발명자들은 고려인삼과 미국삼의 품종을 단시간에 판별할 수 있는 고려인삼과 미국산 판별 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 인삼의 rDNA의 ITS 지역의 단일염기다형성을 특이적으로 증폭할 수 있는 PGH-1 프라이머 및 PGH-5.8S 프라이머 세트를 선별하였으며, HRM(High Resolution Melting) 분석법을 이용하면 고려인삼과 미국삼을 빠르고 정확하게 판별할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 첫번째 해결하려는 과제는 고려인삼과 미국삼 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 고려인삼 품종과 미국삼 판별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 두번째 해결하려는 과제는 상기 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 프라이머 세트를 포함하는 고려인삼 품종 및 미국삼 판별용 키트를 제공하는 것이다.
상술한 본 발명의 첫번째 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 포함하는 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 프라이머 세트를 포함한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 실시에에 따르면, 상기 고려인삼은 천풍, 연풍, 고풍, 금풍, 선풍, 선운, 선원, 청선, 선향, K-1 및 천량으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트는 고려인삼 또는 미국삼의 ITS1-5.8S-ITS2로 구성된 ITS (Internal transcribed spacer) 지역에서 ITS 1 부분의 단일염기다형성을 포함하는 염기서열을 특이적으로 증폭할 수 있으며, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트는 5.8S(5.8 rRNA) 부분의 단일염기다형성을 포함하는 염기서열을 특이적으로 증폭할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 ITS1-5.8S-ITS2로 구성된 ITS 지역은 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트에 의해 증폭되며, 616 개의 염기로 이루어진 서열번호 7 내지 서열번호 18로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열로 표시될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트는 616 개의 염기로 이루어진 ITS (Internal transcribed spacer) 지역의 116 번째 염기에 존재하는 단일염기변이를 검출할 수 있으며, 상기 116 번째 염기는 고려인삼 품종은 A(adenine, 아데닌)이고, 미국삼은 C(cytosine, 시토신)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트는 616 개의 염기로 이루어진 ITS (Internal transcribed spacer) 지역의 235 번째 염기에 존재하는 단일염기변이를 검출할 수 있으며, 상기 235 번째 염기는 고려인삼 품종은 A(adenine, 아데닌)이고, 미국삼은 G(guanine, 구아닌)인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명은, (a) 고려인삼 또는 미국삼의 시료에서 DNA를 분리하고, 증폭반응을 수행하여 ITS1-5.8S-ITS2로 구성된 ITS (Internal transcribed spacer) 지역을 증폭하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 증폭된 ITS 지역을 주형(template)으로 하고, 상기 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하는 단계; (c) 상기 증폭반응에 의해 생성된 증폭산물의 HRM(High Resolution Melting) 분석을 위해 온도를 변화시키면서 상기 증폭산물을 융해시켜 융해곡선(melting curve)을 얻는 단계; 및 (d) 상기 얻어지는 융해곡선을 분석하는 단계;를 포함하는 고려인삼 품종과 미국삼을 판별하는 방법을 포함한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 고려인삼은 천풍, 연풍, 고풍, 금풍, 선풍, 선운, 선원, 청선, 선향, K-1 및 천량으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 실시예에 따르면, 상기 (a) 단계 또는 (b) 단계의 증폭반응은 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 수행할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 (c) 단계는 고려인삼 및 미국삼의 ITS 지역에 존재하는 단일염기변이에 의해 융해곡선 차이가 발생하는 것일 수 있다.
두번째 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 포함하는 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약; 을 포함하는 고려인삼 및 미국삼 품종 판별용 키트를 포함한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP); DNA 중합효소; 및 완충액(buffer solution);으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 실시예에 따르면, 고려인삼 및 미국삼의 ITS1-5.8S-ITS2로 구성된 ITS 지역을 증폭하기 위한 프라이머 세트;를 더 포함할 수 있으며, 상기 프라이머 세트는 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명의 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 프라이머 세트 및 HMR 분석을 이용한 고려인삼과 미국삼 판별 방법은 고려인삼 및 미국삼에 존재하는 단일염기다형성을 특이적으로 증폭하여 바로 융해곡선 분석을 통해 빠르고 정확하게 고려인삼 및 미국산의 품종 구별이 가능하며, 정확성, 재현성이 높은 판별기술로 고려인삼의 진위여부 및 미국삼 혼입 등을 신속, 정확하게 판별할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 고려인삼 11품종과 미국삼의 ITS1-5.8S-ITS2로 구성된 ITS (Internal transcribed spacer) 지역의 염기서열 및 본원발명의 2종의 HRM 프라이머 세트에 의해 증폭되는 염기서열을 도식화한 것이다 (네모 박스는 고려인삼 및 미국삼에 존재하는 단일염기다형성 부분을 표시한 것임).
도 2는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트인 PGH-1 프라이머를 이용한 고려인삼 11 품종과 미국삼의 HRM(High Resolution Melting) 융해곡선 양상 및 염기서열 변이를 비교 분석한 데이터이다.
도 3은 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트인 PGH-5.8S 프라이머를 이용한 고려인삼 11 품종과 미국삼의 HRM(High Resolution Melting) 융해곡선 양상 및 염기서열 변이를 비교 분석한 데이터이다.
도 2는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트인 PGH-1 프라이머를 이용한 고려인삼 11 품종과 미국삼의 HRM(High Resolution Melting) 융해곡선 양상 및 염기서열 변이를 비교 분석한 데이터이다.
도 3은 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트인 PGH-5.8S 프라이머를 이용한 고려인삼 11 품종과 미국삼의 HRM(High Resolution Melting) 융해곡선 양상 및 염기서열 변이를 비교 분석한 데이터이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 종래 널리 사용되었던 형태적 형질을 이용한 종의 구분은 주관적 요소가 배제되기 힘들고 동위효소 변이와 성분적 차이를 이용하는 방법은 재배환경의 영향을 받을 수 있으므로 정확하게 종을 구분하기 어려운 문제점이 있었다. 또한, 종래 DNA 마커들은 제한적인 품종의 적용과 PCR 이후의 추가적인 실험으로 인한 오랜 시간 소요와 임의 프라이머를 이용함으로써 발생하는 재현성 등의 문제점이 제기되어, 종 판별 시스템에 사용되는 새로운 DNA 마커의 제공이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 포함하는 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 프라이머 세트를 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 고려인삼 품종과 미국삼을 신속하고 정확하며 간단하게 판별할 수 있는 신규 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 판별방법을 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 포함하는 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 프라이머 세트를 포함한다.
상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머 세트; 또는 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머 세트;를 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머 세트; 및 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머 세트;를 포함할 수 있다.
본 발명의 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3'-hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사 효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형이 가능하다. 이러한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 당업계에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제작하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 "프라이머(primer)"는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로서, 적합한 조건(4가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다.
상기 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 80 내지 500bp의 길이로 사용할 수 있다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybridcomplex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적인 것을 사용할 수 있다.
본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 포함하는 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 프라이머 세트를 사용하여 고려인삼 품종과 미국삼을 판별할 수 있으며, 구체적인 방법은 다음과 같다;
(a) 고려인삼 또는 미국삼의 시료에서 DNA를 분리하고, 증폭반응을 수행하여 ITS1-5.8S-ITS2로 구성된 ITS (Internal transcribed spacer) 지역을 증폭하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 증폭된 ITS 지역을 주형(template)으로 하고, 상기 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하는 단계; (c) 상기 증폭반응에 의해 생성된 증폭산물의 HRM(High Resolution Melting) 분석을 위해 온도를 변화시키면서 상기 증폭산물을 융해시켜 융해곡선(melting curve)을 얻는 단계; 및 (d) 상기 얻어지는 융해곡선을 분석하는 단계; 를 포함하는 고려인삼 품종과 미국삼을 판별하는 방법을 포함한다.
먼저, (a) 단계는 고려인삼 또는 미국삼의 시료에서 DNA를 분리하고, 증폭반응을 수행하여 ITS1-5.8S-ITS2로 구성된 ITS (Internal transcribed spacer) 지역을 증폭하는 단계이다.
본 발명에 있어서, 상기 고려인삼은 천풍, 연풍, 고풍, 금풍, 선풍, 선운, 선원, 청선, 선향, K-1 및 천량으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있으며, 미국삼은 Panax quinquefolius인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 프라이머 세트를 선별하기 위해 표 1에 나타낸 바와 같이, 천풍, 연풍, 고풍, 금풍, 선풍, 선운, 선원, 청선, 선향, 천량 및 K-1로 구성된 11 종의 고려인삼 및 미국삼(Panax quinquefolius)으로부터 인삼의 지노믹 DNA를 분리하였다.
상기 ITS1-5.8S-ITS2로 구성된 ITS (Internal transcribed spacer) 지역의 증폭은 표 2에 기재된 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였으며, 증폭산물은 도 1에 나타난 바와 같이 616개의 염기로 이루어져 있다.
천풍은 서열번호 7, 연풍은 서열번호 8, 고풍은 서열번호 9, 금풍은 서열번호 10, 선풍은 서열번호 11, 선운은 서열번호 12, 선원은 서열번호 13, 청선은 서열번호 14, 선향은 서열번호 15, 천량은 서열번호 16 및 K-1은 서열번호 17의 염기서열을 가진 유전자가 증폭되었으며, 미국삼은 서열번호 18의 염기서열을 가진 유전자가 증폭되었다.
다음으로, (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 증폭된 ITS 지역을 주형(template)으로 하고, 상기 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하는 단계이다.
본 발명의 도 1 및 표 3에 기재된 바와 같이, 616개의 염기로 이루어진 ITS (Internal transcribed spacer) 지역의 염기서열 분석을 수행한 결과 ITS의 116번째 염기(ITS 1), 235번째 염기(5.8S), 414번째 염기(ITS 2) 및 423번째 염기(ITS 2)가 고려인삼과 미국삼의 단일염기다형성 부분인 것을 확인하였다.
본 발명의 일실시예에서는 ITS의 116번째 염기(ITS 1) 및 235번째 염기(5.8S) 부분이 포함되는 염기 부분을 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 선별하였다 (표 4).
서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트는 PGH-1로 명명하였으며, 도 1에 나타난 바와 같이 616 개의 염기로 이루어진 ITS (Internal transcribed spacer) 지역의 ITS 1 부분에 해당하는 116 번째 염기에 존재하는 단일염기다형성 부분이 포함되도록 염기서열을 증폭시킬 수 있으며, 천풍, 연풍, 고풍, 금풍, 선풍, 선운, 선원, 청선, 선향, 천량 및 K-1로 구성된 11 종의 고려인삼의 116 번째 염기는 A(adenine, 아데닌)로, 미국삼의 116 번째 염기는C(cytosine, 시토신)인 것을 확인하였다 (도 1 및 표 3).
또한, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트는 PGH-5.8S으로 명명하였으며, 도 1에 나타난 바와 같이 616 개의 염기로 이루어진 ITS (Internal transcribed spacer) 지역의 5.8 rRNA 부분에 해당하는 235 번째 염기에 존재하는 단일염기다형성 부분이 포함되도록 염기서열을 증폭시킬 수 있으며, 천풍, 연풍, 금풍, 선운, 선원, 청선, 선향, 천량 및 K-1로 구성된 9 종의 고려인삼의 235 번째 염기는 A(adenine, 아데닌)이고, 고풍 및 선풍의 고려인삼 2 품종과 미국삼의 235 번째 염기는G(guanine, 구아닌)인 것을 확인하였다 (도 1 및 표 3).
그 다음으로, (c) 단계는 상기 증폭반응에 의해 생성된 증폭산물의 HRM(High Resolution Melting) 분석을 위해 온도를 변화시키면서 상기 증폭산물을 융해시켜 융해곡선(melting curve)을 얻는 단계이다.
상기 "HRM(High Resolution Melting) 분석"은 "HRM curve 분석"이라고도 하며, 1개의 염기서열 차이도 판별할 수 있도록 0.1 ~ 0.5℃ 단위로 정밀하게 융해곡선(melting curve)를 분석하는 방식을 주로 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 분석(genotyping)에 적용된다. HRM 분석은 PCR을 통한 증폭 과정 진행 후 이가로스 겔 또는 아크릴아마이드 겔을 만들어 전기영동을 할 필요가 없으며, 실시간유전자 증폭기를 이용한 PCR과 HRM 분석 전용 소프트프로그램(Bio-rad Precision Melt Software)을 활용하여 융해곡선 패턴을 비교하기 때문에 분석에 소요되는 시간을 줄일 수 있는 장점이 있다.
본 발명에서는 고려인삼 품종과 미국삼 판별을 빠르고 정확하게 수행하기 위해 HMR 분석 방법을 도입하였으며, HRM 분석을 위해 고려인삼과 미국삼의 단일염기다형성 부분이 포함되는 염기서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 다음, 65℃에서 95℃로 온도를 증가시키면서 증폭산물의 해리온도(melting rate, 0.1℃/s)에 따른 형광 정도를 측정하여 융해곡선을 수득하였다.
마지막으로, (d) 단계는 상기 얻어지는 융해곡선을 분석하는 단계이다.
본 발명의 일실시예에서는 상기 (c) 단계에서 수득한 융해곡선을 분석하여 고려인삼과 미국삼 품종의 고유 유전자형을 구별하였으며, 도 2 및 도 3에 나타난 바와 같이, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트(PGH-1) 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트(PGH-5.8S)를 이용하여 고려인삼 11 품종과 미국삼의 HRM 곡선(curve) 양상 및 염기서열 변이를 비교 분석하였다.
도 2는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트를 이용하여 고려인삼 및 미국삼의 ITS 지역의 ITS 1 부분을 증폭한 다음 융해곡선을 분석한 것으로, ITS 지역의 616개의 염기서열 중 116 번째 염기에 존재하는 단일염기다형성에 의해 11종의 고려인삼과 미국삼의 융해곡선이 차이가 나는 것을 확인하였으며, 이로 인해 고려인삼과 미국삼 품종의 정확한 식별이 가능한 것을 확인하였다.
또한, 도 3은 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 이용하여 고려인삼 및 미국삼의 ITS 지역의 5.8 rRNA 부분을 증폭한 다음 융해곡선을 분석한 것으로, ITS 지역의 616개의 염기서열 중 235 번째 염기에 존재하는 단일염기다형성에 의해 9종의 고려인삼과 미국삼의 융해곡선이 차이가 나는 것을 확인하였으며, 이로 인해 고려인삼 품종과 미국삼의 정확한 식별이 가능한 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 포함하는 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 프라이머 세트 및 HMR 분석을 이용한 고려인삼 품종과 미국삼 판별 방법은 고려인삼 및 미국삼에 존재하는 단일염기다형성을 특이적으로 증폭하여 바로 융해곡선 분석을 통해 빠르고 정확하게 고려인삼 및 미국산의 품종 구별이 가능하며, 정확성, 재현성이 높은 판별기술로 고려인삼의 진위여부 및 미국삼 혼입 등을 신속, 정확하게 판별이 가능하다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 포함하는 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 키트를 포함한다.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 통상적으로 고려인삼 및 미국삼 품종 판별용 키트에 포함되는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), DNA 중합효소 및 완충액(buffer solution) 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함할 수 있다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함할 수 있다.
상기 키트에 포함되는 프라이머 세트는 고려인삼 및 미국삼의 ITS 지역에 존재하는 단일염기다형성 부분을 특이적으로 증폭할 수 있는 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 프라이머 증폭용 프라이머 세트이며, 상기 키트에 포함되는 프라이머 세트는 본 발명의 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 프라이머 세트를 이용하여 당업자가 용이하게 디자인할 수 있으며, 이와 같이 디자인된 프라이머 세트는 본 발명의 범위 내에 포함된다. 바람직하게는, 616개의 염기서열로 이루어진 ITS의 116번째 염기(ITS 1), 235번째 염기(5.8S), 414번째 염기(ITS 2) 및 423번째 염기(ITS 2)의 단일염기다형성 부분을 토대로 프라이머 세트를 디자인할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 키트는 고려인삼 및 미국삼의 ITS 지역을 증폭시킬 수 있는 별도의 프라이머 세트가 함께 제공될 수 있다.
이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.
고려인삼 및 미국삼의 지노믹 DNA 추출
본 발명에서는 고려인삼 품종과 미국삼 판별을 위해 농촌진흥청 국립원예특작과학원 인삼특작부 시험연구 포장에서 재배중인 천풍, 연풍, 고풍, 금풍, 선풍, 선운, 선원, 청선, 선향, K-1, 천량 등의 고려인삼 11품종과 미국삼을 대상으로 하였으며, 인삼의 연근(年根)은 4년생을 기준으로 하였다 (표 1).
| 번호 | 품종명 | 분류 | 주요특성 | 육성 지역 |
| 1 | 천풍 | 고려인삼 품종 | 홍삼 가공용 | 충청북도 음성 |
| 2 | 연풍 | 다수성 | ||
| 3 | 고풍 | 사포닌 고함유 | ||
| 4 | 금풍 | 병 저항성 | ||
| 5 | 선풍 | 다수성 | ||
| 6 | 선운 | 다수성 | ||
| 7 | 선원 | 홍상 가공용 | ||
| 8 | 청선 | 청경종 | ||
| 9 | 선향 | 향기성분 고함유 | ||
| 10 | 천량 | 내염성 및 수성 | ||
| 11 | K-1 | 다수성 | ||
| 12 | 미국삼 | 고온 저항성 |
인삼 식물체로부터 지노믹 DNA(genomic DNA)를 확보하기 위하여 4년 생 잎을 채취하여 세척한 후 암실냉장 조건에서 하루 동안 보관하였다. 이후 액체질소로 급랭시켜 막자사발과 유봉을 이용하여 고운 분말 상태가 되도록 마쇄한 후, 분말 상태의 시료를 2 ㎖ 튜브에 10 ㎎을 넣고, 68℃로 미리 가열된 추출 버퍼(extraction buffer) type-Ⅰ용액 300 ㎕(50 mM Tris, 25 mM EDTA 및 0.35M sorbitol), 5% 사코실(sarcosyl) 용액 50 ㎕, 5M NaCl 용액 60 ㎕ 및 CTAB (8.6%) 35 ㎕를 넣어, 65℃ 조건의 항온 수조에 30분 동안 처리하면서 시료가 뭉치지 않도록 5분 간격으로 흔들어 주었다.
다음 과정은 PIC (phenol 25:chloroform 24:isoamylalchohol 1) 용액을 600 ㎕ 첨가하여 시료가 잘 섞이도록 1분 이상 인버팅(inverting) 시킨 후, 12,000 rpm으로 15분간 원심분리를 하였다. PIC 처리를 통해 분리된 상층액 450 ~ 500 ㎕를 새 튜브에 옮긴 후, 3M NaOAC (pH 5.2) 50 ㎕, 이소프로필알코올(Isopropyl alcohol) 600 ㎕를 각각 넣어 펠릿이 생성될 때까지 흔들어준 뒤 -70℃의 초저온 냉장고에 20분간 방치하여 펠릿을 응축시켰다. 응축된 펠릿을 확보하기 위하여 10℃에서 12,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 펠릿을 제외한 나머지 용액을 버린 후, 70% 에탄올 600 ㎕를 넣어 1분 이상 흔들어 주었으며, 12,000 rpm으로 2분간 원심분리 하여 에탄올을 버린 후 실온에서 펠릿을 건조하였다. 완전히 건조된 펠릿은 0.5×TBE 버퍼를 100 ㎕ 넣어 실온에서 잘 녹여주었다. 이러한 과정을 거쳐 추출된 DNA는 Nano Drop (Thermo Fisher Scientific, 미국) 기기를 이용하여 농도를 측정하였으며, 농도 측정이 완료된 각각의 DNA 샘플들은 멸균된 증류수를 이용하여 최종 DNA 농도를 5 ng/㎕로 정량하였다.
고려인삼 11 품종 및
미국삼의
ITS
지역 증폭 및 염기서열 분석
2-1 : ITS 지역 염기서열 증폭
본 발명에서는 고려인삼 11 품종 및 미국삼 판별을 위해, 먼저 실시예 1에서 분리한 인삼의 지노믹 DNA에서 ITS1-5.8S-ITS2로 구성된 ITS (Internal transcribed spacer) 지역의 염기서열을 증폭하였다.
ITS 지역의 염기서열을 증폭하기 위한 프라이머는 하기 표 2의 프라이머를 제작하여 사용하였으며(바이오니아, 한국), 고려인삼 11품종과 미국삼 전체 DNA를 이용하여 PCR로 증폭하였다.
| 명칭 | 염기서열 | 서열번호 |
| forward primer | GTCCACTGAACCTTATCATT | 서열번호 5 |
| reverse primer | TCCTCCGCTTATTGATATG | 서열번호 6 |
PCR 수행을 위한 PCR 조성은 지노믹 DNA 5 ng, 20 pmole 정방향 프라이머(forward primer)와 역방향 프라이머(reverse primer), 2.5 mM dNTP, 10×PCR buffer, 1 unit Taq DNA polymerase (Inclone, 한국)를 혼합하여 총 반응액을 20 ㎕로 조정하였다. PCR 반응은 BioRad 사의 thermal cycler (C-1000, 미국)를 이용하여 94℃에서 5분간 초기변성 후, 95℃에서 30초 변성, 58℃에서 1분 결합, 72에서 1분간 신장 조건으로 총 35회 반복한 후 마지막으로 72℃에서 10분간 신장반응을 수행하였다.
2-2 :
ITS
지역 염기서열 분석
실시예 2-1에서 1종의 고려인삼 및 미국삼의 ITS 지역의 염기서열을 증폭한 증폭산물의 염기서열은 Mega Quick-spin Kit (Intron Bio, 한국)를 사용하여 정제하였으며, pGEM-T Easy vector (Promega, Madison, WI, USA)와 DH5a 대장균(Escherichia coli) 세포를 이용하여 형질 전환하였다. 형질전환된 흰색 콜로니를 대상으로 콜로니 PCR을 수행한 후 목표로 하는 DNA 단편들을 자동 염기서열 분석장치 (Genetic Analyzer 3130XL, (Applied Biosystems, 미국)를 이용하여 염기서열분석을 실시하였다. 분석된 염기서열은 Bioedit 프로그램을 이용하여 편집하였고 no gap으로 저장한 후 Cluster X (ver. 1.83)로 염기서열을 정렬하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 11종의 고려인삼 및 미국삼의 ITS 지역 증폭산물은 616 개의 염기로 이루어진 것을 확인하였으며, 천풍은 서열번호 7, 연풍은 서열번호 8, 고풍은 서열번호 9, 금풍은 서열번호 10, 선풍은 서열번호 11, 선운은 서열번호 12, 선원은 서열번호 13, 청선은 서열번호 14, 선향은 서열번호 15, 천량은 서열번호 16 및 K-1은 서열번호 17의 염기서열을 가진 유전자가 증폭되었으며, 미국삼은 서열번호 18의 염기서열을 가진 유전자가 증폭되었다.
상기 11종의 고려인삼 및 미국삼의 ITS 지역의 염기서열을 분석한 결과, 총 4개의 단일염기다형성(SNP)가 관찰되었다 (표 3).
| No. | Name | Nucleotide position (bp) | |||
| 116 | 235 | 414 | 425 | ||
| 1 | 천풍(Chunpoong) | A | A | C | T |
| 2 | 연풍( Yunpoong) | A | A | C | T |
| 3 | 고풍( Kopoong) | A | G | C | T |
| 4 | 금풍(Kumpoong) | A | A | C | T |
| 5 | 선풍(Sunpoong) | A | G | C | T |
| 6 | 선운(Sunun) | A | A | C | T |
| 7 | 선원(Sunone) | A | A | C | T |
| 8 | 청선(Cheongsun) | A | A | C | T |
| 9 | 선향(Sunhyang) | A | A | C | T |
| 10 | 천량(Cheonryang) | A | A | C | T |
| 11 | K-1 | A | A | C | T |
| 12 | 미국삼(Panax quinquefolius) | C | G | T | C |
본 발명의 도 1 및 표 3에 기재된 바와 같이, 616개의 염기로 이루어진 ITS (Internal transcribed spacer) 지역의 염기서열 분석을 수행한 결과 ITS의 116번째 염기(ITS 1), 235번째 염기(5.8S), 414번째 염기(ITS 2) 및 423번째 염기(ITS 2)가 고려인삼과 미국삼의 단일염기다형성 부분인 것을 확인하였다.
고려인삼 품종과 미국삼 판별용 프라이머 세트를 이용한 HRM(high resolution melting) 분석
본 발명에서는 고려인삼 품종과 미국삼의 판별을 빠르고 정확하게 수행하기 위해 HMR 분석 방법을 도입하였으며, HRM 분석을 위해 고려인삼과 미국삼의 단일염기다형성 부분이 포함되는 염기서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 하기 표 4의 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트(PGH-1) 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트(PGH-5.8S)를 선별 및 제작한 다음(바이오니아, 한국), 실시간 유전자 증폭기를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다.
| 명칭 | 염기서열 | 증폭산물 크기 | 서열번호 | |
| PGH-1 | forward primer | CGTTACAATACCGGGTGAGG | 148bp | 서열번호 1 |
| reverse primer | GACGCGTGCAGTTCAGTTT | 서열번호 2 | ||
| PGH-5.8S | forward primer | CGCCAAGGAAATCAAACTGA | 135bp | 서열번호 3 |
| reverse primer | ATCGCATTTCGCTACGTTCT | 서열번호 4 | ||
PCR 수행을 위한 PCR 조성은 2X Precision Melt Supermix (Bio-Rad, Inc., 미국) 5 ㎕, 표 4의 각 정향향 프라이머 및 역방향 프라이머(20 pmole) 2 ㎕, 실시예 2-1에서 증폭한 ITS 지역 DNA(5 ng) 2 ㎕, 증류수 1 ㎕를 이용하여 총 반응액을 10 ㎕로 조정하였다.
HRM 분석을 위한 PCR 반응은 CFX 96 real-time PCR detection system을 사용하였으며, Precision Melt Supermix에 포함된 매뉴얼에 따라 HRM 분석 조건을 설정하였다. PCR 증폭 반응은 먼저, 95℃에서 2분간 초기변성을 진행 한 후, 95℃에서 10초, 60℃에서 30초로 총 40회 반복하였다. 증폭 반응 후, HRM 분석을 위해 65℃에서 95℃로 온도를 증가시키면서 증폭산물의 해리온도(melting rate, 0.1℃/s)에 따른 형광 정도를 측정하여 융해곡선을 수득하였다. 그 다음 고려인삼과 미국삼 품종의 고유 유전자형에 따른 융해곡선 차이를 분석하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트를 이용하여 고려인삼 및 미국삼의 ITS 지역의 ITS 1 부분을 증폭하면 두 가지 융해곡선 패턴이 나타나는 것을 확인하였으며, 이는 ITS 지역의 616개의 염기서열 중 116 번째 염기에 존재하는 단일염기다형성에 의해 11종의 고려인삼과 미국삼의 융해곡선이 차이가 나는 것으로, 본 발명의 프라이머 세트 및 HRM 분석 방법을 사용하면 고려인삼과 미국삼 품종의 정확한 식별이 가능한 것을 확인하였다.
또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 이용하여 고려인삼 및 미국삼의 ITS 지역의 5.8 rRNA 부분을 증폭하면 두 가지 융해곡선 패턴이 나타나는 것을 확인하였으며, 이는 ITS 지역의 616개의 염기서열 중 235 번째 염기에 존재하는 단일염기다형성에 의해 9종의 고려인삼과 미국삼의 융해곡선이 차이가 나는 것으로, 본 발명의 프라이머 세트 및 HRM 분석 방법을 사용하면 고려인삼 품종과 미국삼의 정확한 식별이 가능한 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 프라이머 세트 및 HMR 분석을 이용한 고려인삼 품종과 미국삼 판별 방법은 고려인삼 및 미국삼에 존재하는 단일염기다형성을 특이적으로 증폭하여 바로 융해곡선 분석을 통해 빠르고 정확하게 고려인삼 및 미국산의 품종 구별이 가능하며, 정확성, 재현성이 높은 판별기술로 고려인삼의 진위여부 및 미국삼 혼입 등을 신속, 정확하게 판별이 가능한 것을 확인하였다.
이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> HRM Primer sets for discriminating Korean and American ginseng
and uses thereof
<130> 1041001
<160> 18
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PGH-1 forward primer
<400> 1
cgttacaata ccgggtgagg 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PGH-1 reverse primer
<400> 2
gacgcgtgca gttcagttt 19
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> PGH-5.8S reverse primer
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<223> ITS forward primer
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<210> 6
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<210> 7
<211> 619
<212> DNA
<213> ITS-Chunpoong
<400> 7
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<212> DNA
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tcgtgcggtg acccgtcgcc agcaaaagct ctcatgaccc tgttgcgccg tcctcgacgt 600
gcgctccgac cgcgacccc 619
<210> 12
<211> 619
<212> DNA
<213> ITS-Sunun
<400> 12
gtcgaaacct gcatagcaga acgacccgcg aacacgttac aataccgggt gagggacgag 60
gggtgcgcaa gctccccaag ttgcaaaccc atggtcgggg accacccttg ggtggatctc 120
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cagaatcccg tgaaccatcg agtctttgaa cgcaagttgc gcccgaagcc attaggccga 360
gggcacgtct gcctgggcgt cacgcatcgc gtcgcccccc aacccatcac tcccttgcgg 420
gagttgaggc ggaggggcgg ataatggcct cccgtgtctc accgcgcggt tggcccaaat 480
gcgagtcctt ggcgatggac gtcacgacaa gtggtggttg taaaaagccc tcttctcatg 540
tcgtgcggtg acccgtcgcc agcaaaagct ctcatgaccc tgttgcgccg tcctcgacgt 600
gcgctccgac cgcgacccc 619
<210> 13
<211> 619
<212> DNA
<213> ITS-Sunone
<400> 13
gtcgaaacct gcatagcaga acgacccgcg aacacgttac aataccgggt gagggacgag 60
gggtgcgcaa gctccccaag ttgcaaaccc atggtcgggg accacccttg ggtggatctc 120
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tcccccccgt ttgcgggcgg cggaagcgtc tttctaaaac acaaacgact ctcgacaacg 240
gatatctcgg ctctcgcatc gatgaagaac gtagcgaaat gcgatacttg gtgtgaattg 300
cagaatcccg tgaaccatcg agtctttgaa cgcaagttgc gcccgaagcc attaggccga 360
gggcacgtct gcctgggcgt cacgcatcgc gtcgcccccc aacccatcac tcccttgcgg 420
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<210> 14
<211> 619
<212> DNA
<213> ITS-Cheongsun
<400> 14
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<211> 619
<212> DNA
<213> ITS-Sunhyang
<400> 15
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gcgctccgac cgcgacccc 619
<210> 16
<211> 619
<212> DNA
<213> ITS-Cheonryang
<400> 16
gtcgaaacct gcatagcaga acgacccgcg aacacgttac aataccgggt gagggacgag 60
gggtgcgcaa gctccccaag ttgcaaaccc atggtcgggg accacccttg ggtggatctc 120
gtccgaacaa cgaccccccg gcgcggaatg cgccaaggaa atcaaactga actgcacgcg 180
tcccccccgt ttgcgggcgg cggaagcgtc tttctaaaac acaaacgact ctcgacaacg 240
gatatctcgg ctctcgcatc gatgaagaac gtagcgaaat gcgatacttg gtgtgaattg 300
cagaatcccg tgaaccatcg agtctttgaa cgcaagttgc gcccgaagcc attaggccga 360
gggcacgtct gcctgggcgt cacgcatcgc gtcgcccccc aacccatcac tcccttgcgg 420
gagttgaggc ggaggggcgg ataatggcct cccgtgtctc accgcgcggt tggcccaaat 480
gcgagtcctt ggcgatggac gtcacgacaa gtggtggttg taaaaagccc tcttctcatg 540
tcgtgcggtg acccgtcgcc agcaaaagct ctcatgaccc tgttgcgccg tcctcgacgt 600
gcgctccgac cgcgacccc 619
<210> 17
<211> 619
<212> DNA
<213> ITS-k-1
<400> 17
gtcgaaacct gcatagcaga acgacccgcg aacacgttac aataccgggt gagggacgag 60
gggtgcgcaa gctccccaag ttgcaaaccc atggtcgggg accacccttg ggtggatctc 120
gtccgaacaa cgaccccccg gcgcggaatg cgccaaggaa atcaaactga actgcacgcg 180
tcccccccgt ttgcgggcgg cggaagcgtc tttctaaaac acaaacgact ctcgacaacg 240
gatatctcgg ctctcgcatc gatgaagaac gtagcgaaat gcgatacttg gtgtgaattg 300
cagaatcccg tgaaccatcg agtctttgaa cgcaagttgc gcccgaagcc attaggccga 360
gggcacgtct gcctgggcgt cacgcatcgc gtcgcccccc aacccatcac tcccttgcgg 420
gagttgaggc ggaggggcgg ataatggcct cccgtgtctc accgcgcggt tggcccaaat 480
gcgagtcctt ggcgatggac gtcacgacaa gtggtggttg taaaaagccc tcttctcatg 540
tcgtgcggtg acccgtcgcc agcaaaagct ctcatgaccc tgttgcgccg tcctcgacgt 600
gcgctccgac cgcgacccc 619
<210> 18
<211> 619
<212> DNA
<213> ITS-P.quinquefolius
<400> 18
gtcgaaacct gcatagcaga acgacccgcg aacacgttac aataccgggt gagggacgag 60
gggtgcgcaa gctccccaag ttgcaaaccc atggtcgggg accacccttg ggtggctctc 120
gtccgaacaa cgaccccccg gcgcggaatg cgccaaggaa atcaaactga actgcacgcg 180
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gatatctcgg ctctcgcatc gatgaagaac gtagcgaaat gcgatacttg gtgtgaattg 300
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gggcacgtct gcctgggcgt cacgcatcgc gtcgcccccc aacccatcac tcctttgcgg 420
gagtcgaggc ggaggggcgg ataatggcct cccgtgtctc accgcgcggt tggcccaaat 480
gcgagtcctt ggcgatggac gtcacgacaa gtggtggttg taaaaagccc tcttctcatg 540
tcgtgcggtg acccgtcgcc agcaaaagct ctcatgaccc tgttgcgccg tcctcgacgt 600
gcgctccgac cgcgacccc 619
Claims (15)
- 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 포함하는 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 고려인삼은 천풍, 연풍, 고풍, 금풍, 선풍, 선운, 선원, 청선, 선향, K-1 및 천량으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트는 고려인삼 또는 미국삼의 ITS1-5.8S-ITS2로 구성된 ITS (Internal transcribed spacer) 지역에서 ITS 1 부분의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism; SNP)을 포함하는 염기서열을 특이적으로 증폭하는 것을 특징으로 하며,
서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트는 ITS1-5.8S-ITS2로 구성된 ITS 지역에서 5.8S(5.8 rRNA) 부분의 단일염기다형성을 포함하는 염기서열을 특이적으로 증폭하는 것을 특징으로 하는 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 프라이머 세트.
- 제3항에 있어서, 상기 ITS1-5.8S-ITS2로 구성된 ITS 지역은 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트에 의해 증폭되며, 616 개의 염기로 이루어진 서열번호 7 내지 서열번호 18로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 프라이머 세트.
- 제3항에 있어서, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트는 616 개의 염기로 이루어진 ITS 지역의 116 번째 염기에 존재하는 단일염기다형성을 포함하는 염기서열을 특이적으로 증폭하는 것을 특징으로 하는 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 프라이머 세트.
- 제5항에 있어서, 상기 116 번째 염기는 고려인삼 품종은 A(adenine, 아데닌), 미국삼은 C(cytosine, 시토신)인 것을 특징으로 하는 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 프라이머 세트.
- 제3항에 있어서, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트는 616 개의 염기로 이루어진 ITS 지역의 235번째 염기에 존재하는 단일염기다형성을 포함하는 염기서열을 특이적으로 증폭하는 것을 특징으로 하는 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 프라이머 세트.
- 제7항에 있어서, 상기 235 번째 염기는 고려인삼 품종은 A(adenine, 아데닌) 이고, 미국삼 품종은 G(guanine, 구아닌)인 것을 특징으로 하는 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 프라이머 세트.
- (a) 고려인삼 또는 미국삼의 시료에서 DNA를 분리하고, 증폭반응을 수행하여 ITS1-5.8S-ITS2로 구성된 ITS (Internal transcribed spacer) 지역을 증폭하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 증폭된 ITS 지역을 주형(template)으로 하고, 상기 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하는 단계;
(c) 상기 증폭반응에 의해 생성된 증폭산물의 HRM(High Resolution Melting) 분석을 위해 온도를 변화시키면서 상기 증폭산물을 융해시켜 융해곡선(melting curve)을 얻는 단계; 및
(d) 상기 얻어지는 융해곡선을 분석하는 단계;
를 포함하는 고려인삼 품종과 미국삼 판별 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 ITS 지역의 증폭은 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트에 의해 증폭될 수 있으며, 증폭된 ITS 지역은 616 개의 염기로 이루어진 서열번호 7 내지 서열번호 18로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 고려인삼 품종과 미국삼 판별 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 고려인삼 및 미국삼의 ITS 지역에 존재하는 단일염기변이에 의해 융해곡선 차이가 발생하는 것을 특징으로 하는 고려인삼 품종과 미국삼 판별 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 고려인삼 및 미국삼 품종 판별용 키트.
- 제12항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP); DNA 중합효소; 및 완충액(buffer solution);으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 키트.
- 제12항에 있어서, 고려인삼 및 미국삼의 ITS1-5.8S-ITS2로 구성된 ITS 지역을 증폭하기 위한 프라이머 세트;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 키트.
- 제14항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 고려인삼 품종과 미국삼 판별용 키트.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140157250A KR20160057021A (ko) | 2014-11-12 | 2014-11-12 | 고려인삼과 미국삼 판별용 hrm 프라이머 세트 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140157250A KR20160057021A (ko) | 2014-11-12 | 2014-11-12 | 고려인삼과 미국삼 판별용 hrm 프라이머 세트 및 이의 용도 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20160057021A true KR20160057021A (ko) | 2016-05-23 |
Family
ID=56104061
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020140157250A KR20160057021A (ko) | 2014-11-12 | 2014-11-12 | 고려인삼과 미국삼 판별용 hrm 프라이머 세트 및 이의 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20160057021A (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018201501A (ja) * | 2017-05-31 | 2018-12-27 | 株式会社ツムラ | 生薬鑑別用プライマーセット及びそれを用いた生薬鑑別方法 |
| JP7451978B2 (ja) | 2018-12-27 | 2024-03-19 | 株式会社ツムラ | 生薬鑑別用プライマーセット及びそれを用いた生薬鑑別方法 |
-
2014
- 2014-11-12 KR KR1020140157250A patent/KR20160057021A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JP7131086B2 (ja) | 2017-05-31 | 2022-09-06 | 株式会社ツムラ | 生薬鑑別用プライマーセット及びそれを用いた生薬鑑別方法 |
| JP7451978B2 (ja) | 2018-12-27 | 2024-03-19 | 株式会社ツムラ | 生薬鑑別用プライマーセット及びそれを用いた生薬鑑別方法 |
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