KR101761290B1

KR101761290B1 - 고려인삼 천량 품종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101761290B1
Application number: KR1020140153934A
Authority: KR
Inventors: 방경환; 김영창; 김장욱; 이승호; 김동휘; 현동윤; 김기홍; 조익현
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2014-11-06
Filing date: 2014-11-06
Publication date: 2017-07-25
Also published as: KR20160054365A

Abstract

본 발명은 고려인삼 천량 품종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인삼 신품종인 천량 판별용 프라이머 세트를 이용하면 천량 품종을 타품종으로부터 효과적으로 구별할 수 있으므로, 천량의 육종자원 선발 효율 증진 및 타품종 유입을 제거하는데 유용하게 활용될 수 있다.
또한, 본원 발명의 천량 품종 판별방법을 이용하여, 산업체에서는 품종과 원산지 보증된 원재료를 사용하여 신뢰할 수 있는 제품을 만들 수 있어, 국내산을 선호하는 소비자의 신뢰도 향상에도 기여할 수 있다.

Description

고려인삼 천량 품종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도{Primer Sets for Discrimination of Cheonryang Cultivar of Korean Ginseng and and uses thereof}

본 발명은 고려인삼 천량 품종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인삼 신품종인 천량 판별용 프라이머 세트를 이용하면 천량 품종을 타품종으로부터 효과적으로 구별할 수 있으므로, 천량의 육종자원 선발 효율 증진 및 타품종 유입을 제거하는데 유용하게 활용될 수 있다.

최근 유럽을 비롯한 각 나라들은 세계 무역기구의 지적재산권협정(WTO/TRIPS)에 따라 식물품종보호제도(Plant Variety Protection System, PVPS)의 시행을 의무화하고 있다. 우리나라도 국제 식물 신품종보호동맹(International Union for the Protection of New Varieties of Plants, UPOV) 가입, 종자 산업법의 발효 및 WTO 가입에 따른 수입 농산물의 개방으로 인하여 국내외 농산물에 대한 품종 구분의 필요성이 대두되고 있으며, 농가 소득 및 육종가의 지적 재산권을 보호하기 위해서도 과학적인 품종 구분 체계를 구축하는 것은 안정적으로 종자산업 분야를 발전시켜 나가는데 아주 중요한 일로 여겨지고 있다.

과학적인 품종 구분 체계 구축의 일환으로, 종래 농산물의 원산지판별을 위하여 최근에는 비파괴기술인 근적외선 분광법, 전자코, X-선 형광분석법 등이 많이 사용되고 있으며, 특히 근적외선 분광법을 이용한 비파괴 기술은 과채류의 당도, 곡류의 함수율, 아밀로오스의 함량, 우유와 유제품의 지방, 단백질 및 고형분함량 분석에 많이 응용되고 있으며, 농산물의 품종이나 원산지를 판별하기 위하여 전기영동, HPLC 분석법 등과 같은 기존의 단백질분석법을 활용할 수 있으나 시간과 비용이 많이 소요되는 단점 및 판별하고자 하는 농산물의 판별 마커가 아직 개발되지 않은 단점이 있어 현장에서의 적용에 어려움이 있었다.

최근 인삼의 신품종 보호와 종자보증을 위한 품종 특이적인 마커 개발에 관련한 연구가 많이 진행되고 있으며, 고려인삼 9품종 (천풍, 연풍, 고풍, 선풍, 금풍, 선운, 선원, 청선, 선향)의 미토콘드리아 cytochrome oxidase subunit 2 (cox2) intron II 지역에서 SNP (Single nucleotide polymorphisms)를 바탕으로 천풍 품종 특이적인 마커가 연구되었다 (Wang H et al ., M olecular Biology Reports , 37:1053, 2010).

그러나 SNP를 타겟으로 하는 DNA 마커는 multiplex PCR과 같은 복잡한 과정을 거쳐야 되고 SNP 타겟의 allele specific 프라이머를 제작해야 한다. SNP allele specific PCR (AS-PCR)은 증폭 밴드의 유무의 따라 유전자형을 판단하는 우성 마커 (dominant)로써 증폭반응 시 annealing 온도에 따라 비특이적인 반응이 일어날 확률이 있어 정확한 식별에 어려움도 있다.

또한, DNA 라이브러리로부터 클론의 염기서열을 확보하고 그 정보를 바탕으로 특이적인 프라이머들을 합성하여 사용하는 기법인 STS-PCR (Sequence tagged sites-polymerase chain reaction) 방법이 개발되었다 (Olson M et al . , Science, 245:1434, 1989). STS 마커는 아가로스겔에서 쉽게 결과를 확인할 수 있고 분석방법이 간단하여 대량의 유전자원 평가와 품종판별 및 유연관계 분석에 효율적으로 적용 가능하다. 따라서 이들 STS 마커는 인삼, 콩, 보리, 무궁화, 델피늄 등의 품종 판별과 유전적 다양성 분석에 널리 활용되었다.

한편, 최근 지구 온난화 등의 기후변화와 신규 병해충 발생으로 인한 환경 피해가 심각한 문제로 제기되고 있어, 이에 따른 능동적인 대처 방안 마련이 농업분야의 커다란 화두로 부각되고 있다. 국내에서도 인삼을 재배하는 데 있어 이상 기후에 따른 피해가 많이 발생하고 있는데, 특히 인삼은 고온과 염류 집적으로 인한 피해가 심각한 실정이다. 따라서 이러한 고온과 염류 장해 등의 문제를 해결하기 위한 방안의 하나로 인삼 육종분야에서 환경 저항성 인삼 신품종 개발이 이루어지고 있다.

최근 국내 연구진에 의해 염류에 강하고, 다수성의 특성을 지닌 인삼 신품종 ‘천량’이 개발되었다. 천량은 기존 품종인 천풍에 비해 수량이 10% 정도 많고, 염류에 대한 저항성이 강하며, 고온에도 잘 견디는 등 품질이 우수하여 기후변화에도 적응력이 높은 것으로 보고되었다. 또한 기억력과 학습기능 증진에 관여하는 것으로 알려진 Rg₁과 Rg₂ 등의 사포닌 함량이 높은 특성이 있다 (Kim et al., 2013).

이에 본 발명자들은 인삼 신품종인 천량의 유전적 구별성과 균일성을 확보하고, 신품종의 대내외 지적재산권을 행사하기 위한 수단 마련을 위해 천량 품종 특이적인 DNA 마커를 개발하고자 예의 노력한 결과, 천량 품종에 특이적인 프라이머를 선별하였으며, 상기 프라이머를 이용하면 다른 고려인삼 품종과 천량 품종을 확실하게 구별할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 첫번째 해결하려는 과제는 고려인삼 천량 품종 판별용 DNA 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 두번째 해결하려는 과제는 상기 천량 품종 판별용 DNA 마커를 이용한 천량 품종 판별방법을 제공하는 것이다.

상술한 본 발명의 첫번째 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 천량 품종 판별용 프라이머 세트를 포함한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 본 발명의 천량 품종 판별용 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트; 를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 실시예에 따르면, 본 발명의 프라이머는 올리고뉴클레오티드이며, STS(Sequence Tagged Site) 프라이머일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명의 천량 품종 판별용 프라이머 세트는 인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)으로부터 유래된 것 일 수 있다.

또한, 본 발명은 상술한 본 발명의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약; 을 포함하는 천량 품종 판별용 키트를 포함한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 혼합물, DNA 중합효소 및 완충액(buffer solution)으로 이루어진군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 두번째 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 (a) 인삼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 DNA를 주형으로, 상술한 바에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하여 증폭 산물을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭 산물을 검출하는 단계; 를 포함하는 천량 품종 판별방법을 포함한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 (b) 단계의 증폭반응은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 실시예에 따르면, 상기 (c) 단계의 증폭 산물 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 증폭산물의 길이는 250 내지 400bp(base pair)일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 증폭산물의 길이가 250 내지 280bp 이면 천량 품종, 300 내지 400bp 이면 천량을 제외한 다른 고려인삼 품종으로 판별할 수 있다.

본 발명의 천량 품종 판별용 프라이머 세트는 천량 품종의 유전자를 특이적으로 인식할 수 있어, 인삼 신품종인 천량 품종을 타품종으로부터 효과적으로 구별할 수 있으므로, 천량의 육종자원 선발 효율 증진 및 타품종 유입을 제거하는데 유용하게 활용될 수 있다.

또한, 본원 발명의 천량 품종 판별방법을 이용하여, 산업체에서는 품종과 원산지 보증된 원재료를 사용하여 신뢰할 수 있는 제품을 만들 수 있어, 국내산을 선호하는 소비자의 신뢰도 향상에도 기여할 수 있다.

도 1은 천량 품종 판별용 프라이머 세트 (A) 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트(MFGp 0019) 또는 (B) 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트( MFGp 0248)를 이용하여 천량을 포함한 고려인삼 11종의 증폭반응을 수행한 결과를 나타낸 데이터이다 (lane 1, 천풍; lane 2, 연풍; lane 3, 고풍; lane 4, 금풍; lane 5, 선풍; lane 6, 선운; lane 7, 선원; lane 8, 청선; lane 9, 선향; lane 10, 천량; lane 11, K-1; M, 100bp DNA ladder).
도 2는 천량 품종 특이적인 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트(MFGp 0019)의 재현성을 검정한 데이터이다 (lane 1~10, 천량; M, 100bp DNA ladder).
도 3은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트(MFGp 0019)에 의해서 증폭된 천량을 포함한 고려인삼 11종의 증폭산물(DNA 단편)의 염기서열을 비교한 데이터이다 (박스 : 결실된 염기서열 부위; 화살표 : 프라이머 부착 부위).
도 4는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트(MFGp 0248)에 의해서 증폭된 천량을 포함한 고려인삼 11종의 증폭산물(DNA 단편)의 염기서열을 비교한 데이터이다 (박스 : 결실된 염기서열 부위; 화살표 : 프라이머 부착 부위).

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 중국, 미국, 캐나다 등 인삼 산업 경쟁국과의 FTA 체결로 인한 시장개방과 최근 문제시 되고 있는 인삼 신품종의 해외 불법 유출에 대비하기 위하여, 국내 국가연구기관에서 최초로 개발한 인삼 신품종 천량의 유전적 구별성과 균일성을 확보하고, 더 나아가 신품종의 대내외 지적재산권을 행사하기 위한 수단으로써 천량 품종 특이적인 DNA 마커의 개발이 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 천량 품종 판별용 프라이머 세트를 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 인삼 신품종인 천량 품종을 타품종으로부터 효과적으로 구별할 수 있으므로, 천량의 육종자원 선발 효율 증진 및 타품종 유입을 제거하는데 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명의 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3'-hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사 효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형이 가능하다. 이러한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 당업계에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제작하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 "프라이머(primer)"는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로서, 적합한 조건(4가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다.

본 발명은 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 천량 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머 세트; 또는 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머 세트;를 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머 세트; 및 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머 세트;를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 본 발명의 프라이머는 올리고뉴클레오티드이며, STS(Sequence Tagged Site) 프라이머일 수 있다. 일 수 있다.

상기 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 80 내지 500bp의 길이로 사용할 수 있다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybridcomplex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적인 것을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 천량 품종 판별용 프라이머 세트는 인삼(Panaxginseng C. A. Meyer)으로부터 유래된 것일 수 있다. 본 발명의 프라이머는 통상적으로 프라이머를 선별하기 위해 구축할 수 있는 라이브러리에서 얻어진 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 인삼의 지노믹 DNA 라이브러리(gemonic DNA library)를 구축할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 천량 품종 판별용 프라이머 세트를 선별하기 위해 인삼의 지노믹 DNA 라이브러리(gemonic DNA library)를 제작하여 이를 해독한 염기서열정보로부터 208 쌍의 STS(Sequence Tagged Site) 프라이머를 디자인하였다. 상기 STS 프라이머는 천량을 포함하는 고려인삼 11종(표 1; 천량, 천풍, 연풍, 고풍, 금풍, 선풍, 선운, 선원, 청선, 선향, K-1)을 대상으로 분석하여 품종 간 차이를 나타내는 2종의 프라이머, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트인 MFGp 0019 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트인 MFGp 0248를 선별하였다.

도 1은 천량 품종 판별용 프라이머 세트 (A) 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트(MFGp 0019) 또는 (B) 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트( MFGp 0248)를 이용하여 천량을 포함한 고려인삼 11종의 증폭반응을 수행한 결과를 나타낸 것이다.

먼저, MFGp 0019 프라이머 세트를 이용하여 PCR한 결과, 약 250~400bp 사이에서 두 개의 DNA 단편이 증폭되었으며, 천량 품종은 약 250~280bp, 천량 품종을 제외한 다른 10종의 고려인삼 품종(천풍, 연풍, 고풍, 금풍, 선풍, 선운, 선원, 청선, 선향, K-1)은 약 350~400bp 크기의 DNA 단편이 증폭되는 것을 확인하였다 (도 1A).

이들의 차이는 염기서열의 삽입 또는 결실 (Insertion or Deletion)에 의한 것으로 추측되었으며, 이러한 결과를 정확하게 확인하기 위하여 두 개의 PCR 증폭산물의 염기서열을 분석한 결과, 천풍을 포함한 10품종 (천풍, 연풍, 고풍, 금풍, 선풍, 선운, 선원, 청선, 선향, K-1)은 389bp 크기의 염기서열이 확인되었고, 반면 천량은 264bp 크기의 특이적인 염기서열을 확인할 수 있었는데, 114~238bp 위치에서 125bp의 염기서열 결실이 확인되어 고려인삼 10품종과 뚜렷한 차이를 나타내는 것을 확인하였다 (도 3).

다음으로, MFGp 0248 프라이머 세트를 이용하여 PCR한 결과, 약 250~350bp 사이에서 두 개의 DNA 단편이 증폭되었으며, 천량을 포함한 6품종 (연풍, 선풍, 선운, 선원, 천량, K-1)은 약 250~280bp, 그외에 나머지 5품종(천풍, 고풍, 금풍, 청선, 선향)은 약 300~350bp 크기의 DNA 단편이 증폭되는 것을 확인하였다 (도 1B).

이는 MFGp 0019 프라이머 세트를 이용한 결과와 동일하게 염기서열의 삽입 또는 결실에 의한 차이인 것으로 판단되어, 두 개의 PCR 증폭산물의 염기서열을 분석한 결과, 천풍, 고풍, 금풍, 청선 및 선향의 5품종은 307bp 크기의 염기서열이 확인된 반면, 천량을 포함한 6품종 (연풍, 선풍, 선운, 선원, 천량, K-1)은 염기서열의 길이가 254bp로써 86~138bp 위치에서 53bp의 염기 결실이 관찰되었다 (도 4).

또한, 도 2에 나타난 바와 같이, MFGp 0019 프라이머의 재현성을 검정하기 위하여 천량 10개체를 대상으로 PCR을 수행한 결과, 10개체 모두 동일한 크기의 DNA 단편이 확인되는 것을 관찰하였다.

즉, 본원발명의 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 천량 품종 판별용 프라이머 세트는 천량 유전자를 특이적으로 증폭하여 다른 고려인삼 품종들 간의 명확한 구별이 가능하여, 효과적으로 천량 품종을 판별할 수 있는 것을 확인하였다.

아울러, 상기 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 천량 품종 판별용 프라이머 세트는 삽입 또는 결실을 기반으로 하는 DNA 마커는 공우성 (co-dominant)을 나타내는 것이 특징으로, 아가로스겔에서 쉽게 확인할 수 있는 장점이 있어 대량의 유전자원 분석과 품종 판별 등의 목적에 효율적으로 사용할 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약; 을 포함하는 천량 품종 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 통상적으로 천량 품종 판별용 키트에 포함되는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 혼합물, DNA 중합효소 및 완충액(buffer solution) 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함할 수 있다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함할 수 있다.

상기 키트에 포함되는 프라이머 세트는 천량 품종 판별용 프라이머 증폭용 프라이머 세트이며, 상기 키트에 포함되는 프라이머 세트는 본 발명의 천량 품종 판별용 프라이머 세트를 이용하여 당업자가 용이하게 디자인할 수 있으며, 이와 같이 디자인된 프라이머 세트는 본 발명의 범위 내에 포함된다. 바람직하게는, 상기 천량 품종을 대상으로 삽입 또는 결실(In/Del)에 의한 다형성 분석을 실시하고, 품종 특이적인 In/Del DNA 마커를 선발하여, 선발된 In/Del DNA 마커의 염기서열 분석 결과를 토대로 프라이머 세트를 디자인할 수 있다. 상술한 바와 같이, 디자인된 프라이머 세트는 선발 In/Del DNA 마커 4개의 염기를 포함하거나 포함하지 않는 DNA 프라이머 세트가 제작될 수 있다.

본 발명은 또한, (a) 인삼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 DNA를 주형으로, 상술한 바에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하여 증폭 산물을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭 산물을 검출하는 단계; 를 포함하는 천량 품종 판별방법을 제공한다.

먼저, (a) 단계는 인삼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계이다. 상기 인삼 시료는 천량 품종 판별이 필요한 인삼이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 고려인삼(Panax ginseng C. A. Meyer), 중국삼(Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen) 및 미국삼(Panax quinquefolius L.)으로 이루어진 군 중 어느 1종 이상일 수 있다.

게놈 DNA 분리는 통상적으로 식물체에서 게놈 DNA를 분리하는데 사용되는 방법이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 인삼 시료를 분쇄 및/또는 파쇄하여 분말상태로 제조한 후 식물체 DNA 추출에 사용되는 키트를 사용하여 게놈 DNA를 분리할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 식물체 DNA 추출에 사용되는 키트는 독일에 소재한 퀴아젠(QIAGEN)사의 DNeasy Plant Mini Kit를 사용할 수 있다.

다음으로, (b) 단계는 상기 (a)단계의 DNA를 주형으로 상술한 바와 같은 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계이다.

본 발명에서, 상기 증폭반응은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 수행하였으나, 상기 표적 서열을 증폭하는 방법은 통상적으로 식물의 품종 판별방법에서 표적 서열을 증폭하는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법을 사용할 수 있다.

상기 방법 중 중합효소연쇄반응(PCR)이란, 중합효소를 이용하여 표적 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 서열을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수 있다.

또한, 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 통상적으로 프라이머 표지 물질로 사용되는 것이라면, 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 브롬화에티디움(ethidium bromide) 또는 훽스트(Hoechst) 33258 염료를 사용할 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.

나아가, 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트을 포함하는 것을 사용할 수 있다.

다음, 상기 (c) 단계는 증폭 산물을 검출하는 단계이다.

상기 증폭 산물을 검출하는 방법은 통상적으로 증폭된 산물을 검출하는 방법이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있다.

상기 모세관 전기영동은 예를 들면, 에이비 시퀀서(ABi Sequencer)를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 상기 증폭 산물의 방사성을 측정할 수 있다.

또한, 본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 천량 품종 판별방법은 검출된 증폭 산물을 천량 품종 표준의 증폭 산물과 비교하여 품종을 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 증폭산물의 길이는 250 내지 400bp(base pair)일 수 있으며, 증폭산물의 길이가 250 내지 280bp 이면 천량 품종, 300 내지 400bp 이면 천량을 제외한 다른 고려인삼 품종으로 판별할 수 있다.

상기에서 상술한 바와 같이, 서열번호 1 및 서열번호 2의 MFGp 0019 프라이머 세트를 이용하여 생성된 증폭산물의 크기를 분석하여 보면, 천량의 경우 264bp 크기의 DNA 단편이 증폭되는 반면, 천량 이외의 고려인삼 10품종은 389bp 크기의 DNA 단편이 증폭되는 것을 확인할 수 있다. 또한 서열번호 3 및 서열번호 4의 MFGp 0248 프라이머 세트를 이용하여 생성된 증폭산물의 크기를 분석하여 보면, 천량의 경우 254bp크기의 DNA 단편이 증폭되는 반면, 천풍, 고풍, 금풍, 청선 및 선향의 5품종은 307bp 크기의 DNA 단편이 증폭되는 것을 확인할 수 있다.

즉, 본 발명의 천량 판별용 프라이머 세트, 천량 판별용 키트 및 천량 품종 판별방법은 천량 유전자를 특이적으로 증폭하여 다른 고려인삼 품종들 간의 명확한 구별이 가능하므로 효과적으로 천량 품종을 판별할 수 있으며, 본 발명의 프라이머 세트는 모두 삽입 또는 결실을 기반으로 하는 공우성 마커로써, 누구나 손쉽게 이용할 수 있으며 또한 기존에 개발된 인삼 품종 판별용 STS 마커와 조합하여 사용할 수 있는 장점이 있다. 따라서, 본 발명의 천량 판별용 프라이머 세트는 염류에 강하고 수량이 높은 천량 품종의 유전적 구별성과 균일성 확보, 과학적인 종자관리 및 해외 종자 불법 유출과 재래종의 신품종 둔갑 등 각종 종자사고에 대응할 수 있는 원천 기술로 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.

인삼 품종 준비 및 DNA 추출

1-1 : 시료 준비

본 발명에 이용된 인삼 품종은 하기 표 1에 나타내었다.

본 발명에 사용된 고려인삼 11품종의 품종 명칭 및 주요특성

번호	품종명	분류	주요특성	육성 지역
1	천풍	고려인삼 품종	홍삼 가공용	충청북도 음성
2	연풍		다수성
3	고풍		사포닌 고함유
4	금풍		병 저항성
5	선풍		다수성
6	선운		다수성
7	선원		홍상 가공용
8	청선		청경종
9	선향		향기성분 고함유
10	천량		내염성 및 다수성
11	K-1		다수성

본 연구에서 사용한 재료는 충청북도 음성군 소재 농촌진흥청 국립원예특작과학원 인삼특작부 시험연구 포장에서 재배중인 천풍, 연풍, 고풍, 금풍, 선풍, 선운, 선원, 청선, 선향, K-1, 천량 등 11품종을 대상으로 하였으며, 인삼의 연근 (年根)은 4년생을 기준으로 하였다 (표 1). 인삼 재배, 병해충 방제 및 기타 관리는 인삼 GAP 표준재배지침서에 준하였다 (Rural Development Administration, 2009). DNA 추출은 샘플을 액체질소로 급랭시켜 막자사발을 이용하여 분말상태가 되도록 마쇄한 후, DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Germany)을 이용하여 제작사가 제공한 매뉴얼에 따라 추출하였다.

1-2 : DNA 추출 및 정량

인삼 식물체로부터 genomic DNA를 확보하기 위하여 4년생 잎을 채취하여 세척한 후 암실냉장 조건에서 하루 동안 보관하였다. 이후 액체질소로 급랭시켜 막자사발과 유봉을 이용하여 고운 분말 상태가 되도록 마쇄한 후, 분말 상태의 시료를 2 ㎖ 튜브에 10 ㎎ 넣고, 68℃로 미리 가열된 추출버퍼Ⅰ용액 300 ㎕ (extraction buffer type-Ⅰ; 50 mM Tris, 25 mM EDTA 및 0.35 M sorbitol), 5% 사코실(sarcosyl) 용액 50 ㎕, 5M 염화나트륨(NaCl) 용액 60 ㎕ 및 CTAB(Cetyltrimethylammonium bromide; 8.6%) 35 ㎕를 넣어, 68℃ 조건의 항온 수조에 30분 동안 처리하면서 시료가 뭉치지 않도록 5분 간격으로 흔들어 주었다.

다음으로, PIC (phenol 25 : chloroform 24 : isoamylalchohol 1) 용액을 600 ㎕ 첨가하여 시료가 잘 섞이도록 1분 이상 흔들어준 후, 10℃에서 12,000 rpm으로 15분간 원심분리를 하였고, PIC를 통해 분리된 상층액 450 ~ 500 ㎕를 새 튜브에 옮긴 후, 3M 아세트산나트륨(NaOAC; pH 5.2) 50 ㎕, 이소프로필 알코올(Isopropyl alcohol) 600 ㎕를 각각 넣어 하얀 펠릿이 생성될 때까지 흔들어준 뒤 -70℃의 초저온 냉장고에 20분간 방치하여 펠릿을 응축시켰다.

응축된 펠릿을 확보하기 위하여 10℃에서 12,000 rpm으로 5분 동안 원심분리 하여 펠릿을 제외한 나머지 용액을 버린 후, 에탄올 (70%) 600 ㎕를 넣어 1분 이상 흔들어 주었으며, 10℃에서 12,000 rpm으로 2분간 원심분리 하여 에탄올을 버린 후 실온에서 펠릿을 건조하였다. 완전히 건조된 펠릿은 Tris-EDTA 버퍼를 100 ㎕ 넣어 실온에서 잘 녹여주었다. 이러한 과정을 거쳐 추출된 DNA는 Nano Drop (Thermo Fisher Scientific, 미국) 기기를 이용하여 농도를 측정하였으며, 농도 측정이 완료된 각각의 DNA 샘플들은 멸균된 증류수를 이용하여 최종 DNA 농도를 5 ng/㎕로 각각 정량하였다.

상기의 샘플은 이후의 천량 특이적 품종 판별을 위한 인삼 시료로 사용하였다.

천량 품종 특이적 프라이머 제작 및 선별

2-1 : 천량 품종 특이적 프라이머 제작

천량 품종 특이적 프라이머를 제작하기 위해 공지된 방법인 메틸레이션 필터링(methylation filtering; MF) 기법(Bang KH et al ., Biological and Pharmaceutical Bulletin , 33:1579, 2010)을 활용하여 인삼의 지노믹 DNA 라이브러리(genomic DNA library)를 제작하였으며, 이들을 해독한 염기서열 정보로부터 208쌍의 STS 프라이머들을 디자인하였다 ((주)바이오니아, 한국).

2-2 : 천량 품종 특이적 프라이머 선별

상기 208쌍의 STS 프라이머에서 천량 품종에 특이적인 프라이머를 선별하기 위해 표 1에 기재된 국내인삼 11품종을 대상으로 분석을 수행하였다.

상기 분석은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR) 방법을 이용하였으며, PCR 반응을 위한 조성물은 실시예 1-2의 DNA ng, 상기 208쌍의 STS 프라이머(20 pmole forward 및 reverse primer), 2.5 mM dNTP, 10×PCR buffer, 1unit Taq DNA polymerase (Inclone, 한국)을 혼합하여 총 반응액을 20㎕로 조정하였다. PCR 반응은 BioRad 사의 thermal cycler (C-1000, USA)를 이용하여 94에서 5분간 초기변성 후, 95에서 30초 변성, 55~65에서 40초 결합, 72에서 1분간 신장 조건으로 총 35회 반복한 후 마지막으로 72에서 10분 간 신장반응을 수행하였다. 증폭된 DNA 산물은 1.5% 아가로스 겔(agarose gel)에서 150 볼트(Volt)로 전기영동한 후, Safe Gel Stain (Inclone, 한국)으로 염색한 다음, UV-일루미네이터(UV-illuminator; BioRad, 미국)를 이용하여 PCR에 의한 증폭산물을 확인하였다.

선발된 STS 프라이머 세트 정보

Primer name	Forward primer	sequence(5'->3')	서열번호	PCR Information
				PCR product Size (bp)	Anneal. temp.(℃)
MFGp0019	Forward	GGAGAAAATTATATGCACCAACC	서열번호 1	264~389	65
	Reverse	TCCCAACTTGCATTTTCACA	서열번호 2
MFGp0248	Forward	GGGAGCTGATCCGGAGATAG	서열번호 3	254~307	65
	Reverse	GGGAAAGCGTTCAGCTCTTA	서열번호 4

상기 방법으로 천량 품종 특이적 프라이머를 선별한 결과, 표 2에 나타난 바와 같이 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트(MFGp0019); 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트(MFGp0248)를 선별하였다.

천량 품종 특이적 프라이머 세트를 이용한 천량 품종 선별 및 염기서열 분석

3-1 : 천량 품종 특이적 프라이머 세트를 이용한 천량 품종 선별

실시예 2에서 선별된 2 종의 천량 품종 특이적 프라이머 세트(MFGp0019 및 MFGp0248)을 이용하여 천량 품종을 특이적으로 선별할 수 있는지 알아보기 위해 표 1에 기재된 국내인삼 11품종을 대상으로 분석을 수행하였다.

천량 품종 특이적 프라이머 세트를 이용한 천량 품종 선별방법은 실시예 2의 PCR 방법과 동일한 방법으로 수행하였다.

서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트(MFGp0019)를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 도 1A에 나타난 바와 같이, 약 250~400bp 사이에서 두 개의 DNA 단편이 증폭되었으며, 천량 품종은 약 250~280bp, 천량 품종을 제외한 다른 10종의 고려인삼 품종(천풍, 연풍, 고풍, 금풍, 선풍, 선운, 선원, 청선, 선향, K-1)은 약 350~400bp 크기의 DNA 단편이 증폭되는 것을 확인하였다 (도 1A).

서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트(MFGp 0248)를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 도 1B에 나타난 바와 같이, 약 250~350bp 사이에서 두 개의 DNA 단편이 증폭되었으며, 천량을 포함한 6품종 (연풍, 선풍, 선운, 선원, 천량, K-1)은 약 250~280bp, 그외에 나머지 5품종(천풍, 고풍, 금풍, 청선, 선향)은 약 300~350bp 크기의 DNA 단편이 증폭되는 것을 확인하였다.

3-2 : 천량 품종 특이적 프라이머 세트에 의해 증폭된 증폭산물의 염기서열 분석

실시예 3-1의 천량 및 고려인삼의 증폭산물의 차이는 염기서열의 삽입 또는 결실(Insertion or Deletion)에 의한 것으로 추측되었으며, 이러한 결과를 정확하게 확인하기 위하여 두 개의 PCR 증폭산물의 염기서열을 분석하였다.

품종 간 다형성을 나타내는 PCR 산물들은 Mega Quick-spin Kit(Intron Bio, 한국)를 사용하여 정제한 후 자동 염기서열 분석장치(Genetic Analyzer 3130XL, (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열은 Bioedit 프로그램을 이용하여 편집하였고 no gap으로 저장한 후 Cluster X (ver. 1.83)로 염기서열을 정렬하였다.

서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트(MFGp0019)를 이용하여 증폭한 인삼 품종의 증폭산물은 도 3에 나타난 바와 같이, 천풍을 포함한 10품종 (천풍, 연풍, 고풍, 금풍, 선풍, 선운, 선원, 청선, 선향, K-1)은 389bp 크기의 염기서열이 확인되었고, 반면 천량은 264bp 크기의 특이적인 염기서열을 확인할 수 있었다. 천량 품종은 다른 고려인삼 10 종의 품종과는 달리 증폭산물의 114~238bp 위치에 해당하는 125bp의 염기서열이 결실되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트(MFGp 0248)를 이용하여 증폭한 인삼 품종의 증폭산물은 도 4에 나타난 바와 같이, 천풍, 고풍, 금풍, 청선 및 선향의 5품종은 307bp 크기의 염기서열이 확인된 반면, 천량을 포함한 6품종 (연풍, 선풍, 선운, 선원, 천량, K-1)은 염기서열의 길이가 254bp로써 86~138bp 위치에서 53bp의 염기 결실이 관찰되었다.

즉, 본 발명의 프라이머 세트를 사용하는 경우, 천량 품종과 다른 고려인삼 10품종과 뚜렷한 차이를 나타내므로 다른 인삼 판별 방법에 비해 천량 품종을 매우 정확하고 용이하게 판별할 수 있으며, 상기 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 천량 품종 판별용 프라이머 세트는 삽입 또는 결실을 기반으로 하는 DNA 마커는 공우성 (co-dominant)을 나타내는 것이 특징으로, 아가로스겔에서 쉽게 확인할 수 있는 장점이 있어 대량의 유전자원 분석과 품종 판별 등의 목적에 효율적으로 사용할 수 있다.

이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Primer Sets for Discrimination of Cheonryang Cultivar of Korean Ginseng and and uses thereof <130> 1040931 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MFGp0019 Forward Primer <400> 1 ggagaaaatt atatgcacca acc 23 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MFGp0019 Reverse Primer <400> 2 tcccaacttg cattttcaca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MFGp0248 Forward Primer <400> 3 gggagctgat ccggagatag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MFGp0248 Reverse Primer <400> 4 gggaaagcgt tcagctctta 20

Claims

서열번호 1 및 2의 프라이머 세트를 포함하는 천량 품종 판별용 프라이머 세트.
삭제
제1항에 있어서, 상기 프라이머는 올리고뉴클레오티드이며, STS(Sequence Tagged Site) 프라이머인 것을 특징으로 하는 천량 품종 판별용 프라이머 세트.
제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 천량 품종 판별용 프라이머 세트.
제1항, 제3항 또는 제4항 중 어느 한 항의 천량 품종 판별용 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약; 을 포함하는 천량 품종 판별용 키트.
제5항에 있어서, 상기 시약은 dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 혼합물, DNA 중합효소 및 완충액(buffer solution)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 천량 품종 판별용 키트.
(a) 인삼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 DNA를 주형으로, 제1항, 제3항 또는 제4항 중 어느 한 항의 천량 품종 판별용 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하여 증폭 산물을 제조하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 증폭 산물을 검출하는 단계;
를 포함하는 천량 품종 판별방법.
제7항에 있어서, 상기 (b) 단계의 증폭반응은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하는 것을 특징으로 하는 천량 품종 판별방법.
제7항에 있어서, 상기 (c) 단계의 증폭 산물 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행하는 것을 특징으로 하는 천량 품종 판별방법.
제7항에 있어서, 상기 증폭산물의 길이는 250 내지 400bp(base pair)인 것을 특징으로 하는 천량 품종 판별방법.
제7항에 있어서, 증폭산물의 길이가 250 내지 280bp이면 천량 품종, 300 내지 400bp이면 천량을 제외한 다른 고려인삼 품종인 것을 특징으로 하는 천량 품종 판별방법.