KR102009712B1 - 대추 복조 품종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대추 복조 품종 판별용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 대추 복조 품종 판별용 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 대추 복조 품종 판별 방법에 관한 것이다.

Description

대추 복조 품종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도{Primer set for discriminating Zizyphus jujuba 'Bokjo' cultivar and uses thereof}

본 발명은 대추 복조 품종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.

대추 (Zizyphus jujuba) 나무의 열매는 예로부터 한약재와 식용을 위해 다양한 용도로 널리 이용되어 온 과실이다. 최근에는 높은 항산화 효과와 암세포 증식 억제 효과 등의 효능이 있다는 것도 알려졌다. 이러한 다양한 이용 및 높은 가치에도 불구하고, 정확한 대추 품종 구분을 위한 방법은 아직 미미한 실정이다. 기존의 품종 구별 방법은 육안으로 구별되는 형태적 특성에 근거한 것이나, 이와 같은 방법은 환경에 의해 많은 영향을 받으므로 정확한 품종 구별 방법으로써는 한계를 가진다. 그러나, 대추의 유전체 정보에 근거한 마커의 개발은 염기서열에 의해 구분되는 것이므로 영양번식을 하는 대추에 있어 정확한 품종 구별을 가능하게 한다. 유전체 정보에 근거한 여러 가지 형태의 마커 중 InDel(Insertion/Deletion) 마커는 PCR(polymerase chain reaction) 기술을 이용하여 다형성을 검출하는 방법으로 비교적 간단한 방법으로 신속한 분석 결과를 얻을 수 있는 방법이다. 유전체 내에 삽입(insertion)되거나 결실된(deletion) 염기서열은 종간(intra species)뿐만 아니라 종내(inter species)에서도 다양한 길이로 존재하여, InDel 마커는 품종 구분에 적합한 분자마커이다.

한편, 한국등록특허 제1693410호에는 보은, 미조 및 상왕 품종을 판별할 수 있는 '대추 품종 판별용 RAPD 프라이머'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1860232호에는 추석 및 보은 품종을 판별할 수 있는 'SSR 마커를 이용한 대추 품종의 감별방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 대추 복조 품종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 대추 품종인 복조, 월출, 무등 및 금성의 잎을 채취하여 게노믹 DNA를 추출하고, 추출한 게노믹 DNA의 염기서열 분석을 수행하여 각 품종의 엽록체 서열에서 InDel 다형성을 보이는 마커를 탐색한 후, InDel 마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제작하여 PCR 분석을 수행한 결과, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트가 다른 품종과 대비되는 복조 품종 특이적인 밴드 패턴을 보여주는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 대추 복조 품종 판별을 위한 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 시약을 포함하는 대추 복조 품종 판별을 위한 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 대추 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 대추 복조 품종의 판별 방법을 제공한다.

본 발명의 프라이머 세트를 이용하면 대추 복조 품종의 구분이 가능하므로, 국내 시장에서 유통되어지는 대추의 품종 혼용을 방지하며, 과수 작물이 품종으로써 갖추어야 할 요건인 구별성, 균일성, 안정성, 품종 명칭 등을 포함한 품질 관리에 유용하게 이용될 수 있는 효과가 있다.

도 1은 Zjcpindel 14 프라이머 세트를 이용한 복조, 월출, 무등, 금성 DNA 시료의 PCR 수행 결과이다.

석 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 대추 복조 품종 판별을 위한 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 대추의 엽록체 게놈 상의 rbcL~accD 사이의 인트론에 위치하는 InDel 마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트로, 대추 품종 복조, 월출, 무등 및 금성 중에서 복조 품종만을 특이적으로 판별할 수 있는 프라이머 세트이다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 시약을 포함하는 대추 복조 품종 판별을 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한,

대추 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 대추 복조 품종의 판별 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 대추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 전술한 것과 같다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 대추 복조 품종을 판별하기 위한 방법은 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 단계 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 대추의 게노믹 DNA 추출

충북 보은에 위치한 대추연구소에서 입수한 대추 품종 복조, 월출, 무등, 금성의 잎을 채취하여 Biomedic Plant Genomic DNA Extraction 키트(바이오메딕, 한국)를 이용하여 게노믹 DNA를 추출하였다.

2. 프라이머 제작

추출한 게노믹 DNA의 게놈 시퀀싱을 Illumina Hi-seq 2500을 이용하여 수행하여 엽록체의 서열을 조립하고, 각 대추 품종의 엽록체 서열을 정렬시켜 복조와 다른 국내 품종에서 현저하게 차이가 있는 Indel 다형성 부위를 찾아, 상기 InDel 다형성 위치를 증폭시키는 프라이머 세트를 제작하였다. 상기 InDel 다형성 부위는 대추의 엽록체 게놈(GenBank accession no. KU351660)의 rbcL~accD 사이의 인트론에 위치하는 것으로 확인되었다.

3. PCR을 이용한 DNA 증폭

제작한 프라이머 세트(Zjcpindel 14)의 품종 구분 기능을 확인하기 위하여 Zjcpindel 14를 이용하여 복조, 월출, 무등 및 금성의 4품종, 총 14개체에 대해 PCR을 수행하였다.

Zjcpindel 14 프라이머 세트 서열정보

프라이머 명칭	염기서열 정보(5'→3')
Zjcpindel 14-F	GAACCCGCTATTTGCTAT (서열번호 1)
Zjcpindel 14-R	GCTTTCTTGCCCCTATTT (서열번호 2)

CTAB 방법을 사용하여 추출한 DNA를 5 ng/㎕의 농도로 희석하여, 총 10 ng의 게노믹 DNA, 정방향 및 역방향 프라이머 각 2 uM, 2X Taq mix 10㎕, 증류수 4㎕를 혼합하여 20㎕의 PCR 반응 혼합물을 만들었다. PCR 과정은 전변성(pre-denaturation) 95℃ 180초; 변성 95℃ 30초, 어닐링(annealing) 55℃ 30초, 신장(extension) 72℃ 30초, 총 35회 반복; 최종 신장 72℃ 300초 조건으로 수행하였다.

실시예 1. PCR을 이용하여 다형성을 나타내는 Indel 마커의 다형성 판독

복조, 월출, 무등, 금성의 DNA 시료 및 Zjcpindel 14 프라이머 세트를 이용한 PCR을 수행한 후, PCR 산물을 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 분석한 결과, 복조 품종에서만 298 bp의 밴드가 나타났고, 나머지 3개의 품종에서는 400 bp의 밴드가 확인되어, Zjcpindel 14 프라이머 세트를 이용하면 대추 품종 중 복조 품종만을 특이적으로 판별할 수 있음을 확인할 수 있었다(도 1).

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Primer set for discriminating Zizyphus jujuba 'Bokjo' cultivar and uses thereof <130> PN18428 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gaacccgcta tttgctat 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gctttcttgc ccctattt 18

Claims (5)

1. 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 대추 월출, 무등 및 금성 품종으로부터 복조 품종 판별을 위한 프라이머 세트.
2. 제1항의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 시약을 포함하는 대추 월출, 무등 및 금성 품종으로부터 복조 품종 판별을 위한 키트.
3. 제2항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 대추 월출, 무등 및 금성 품종으로부터 복조 품종 판별을 위한 키트.
4. 대추 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 대추 월출, 무등 및 금성 품종으로부터 복조 품종의 판별 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 대추 월출, 무등 및 금성 품종으로부터 복조 품종의 판별 방법.

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