KR102163238B1 - 당귀 속 식물로부터 일당귀를 판별하기 위한 엽록체 서열 기반 분자마커 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 당귀 속 식물로부터 일당귀(Angelica acutiloba)를 판별하기 위한 엽록체 서열 기반 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 분자마커는 국내 한약재 시장에서 유통되는 당귀 속 식물의 원료 혼용 방지 및 생산되는 당귀 속 식물의 품질 관리에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

당귀 속 식물로부터 일당귀를 판별하기 위한 엽록체 서열 기반 분자마커 및 이의 용도{Molecular marker based on chloroplast sequence for discriminating Angelica acutiloba from Angelica species and uses thereof}
본 발명은 당귀 속 식물로부터 일당귀(Angelica acutiloba)를 판별하기 위한 엽록체 서열 기반 InDel(Insertion/Deletion) 분자마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
일당귀(Angelica acutiloba kitagawa)는 일본에서 일본약국방(日本藥局方)에 기재되어 뿌리를 "당귀"라는 생약명의 한약재로 이용한다. 하지만 국내 대한약전에서는 한약재로 이용되는 "당귀"는 참당귀(Angelica gigas)를 기원으로하며, 일당귀(A. acutiloba)는 왜당귀, 일본당귀로 지정하고 한약재 용도의 "당귀"로 사용하지 않고 어린 잎을 식용으로 이용한다. 국내에는 일당귀, 참당귀(A. gigas), 바디나물(A. decursiva), 구릿대(A. dahurica) 등의 다양한 당귀 속 식물(Angelica species)이 분포하고 있으며, 이들은 한약재 및 식용으로 사용되어진다. 국내에서 일당귀는 잎이 부드럽고 참당귀에 비해 향이 강하지 않아 식용으로 많이 사용되고 있으나 간혹 참당귀(A. gigas)의 건조한 뿌리를 지칭하는 생약명 "당귀"로 오용되는 경우가 발생한다. 그 외에 바디나물의 경우 말린 뿌리를 생약명 "전호"로 해열, 진해, 거담에 쓰인다. 이처럼 국내에는 여러종의 당귀 속 식물이 다양한 용도의 한약재 및 식용으로 사용되고 있으나, 뿌리를 말려 절편형태로 가공되어 유통되는 한약재 시장에서 육안을 통한 원료식별은 제한적이기 때문에 정확환 원료판별 시스템이 요구된다.
약용식물의 판별방법으로는 크게 (1) 형태적 판별, (2) 이화학적 판별, (3) DNA 분자마커를 이용한 판별 등으로 나눌 수 있다. 식물의 형태적 특성에 의한 판별은 주로 판별코자 하는 식물의 화기의 구조 및 모양, 지상부 및 지하부의 형태 등 외관상 특징으로 구분하는 것이 일반적이다. 식물의 형태적 판별은 근연속실생식물의 종간 구분이 어려우며, 질적형질보다는 양적형질인 경우도 많아 재배 환경에 따른 변이가 일어날 수도 있을 뿐만 아니라, 타식에 의한 혼연 종 발생이 빈번하여 식물 종간 형태적 구분이 어렵다. 특히 약용식물은 약용부위에 따라 박피, 절편, 건조 등 다양한 방법으로 가공 유통되므로 전문가가 아니면 구분이 어려운 실정이다. 이화학적 성분분석에 의한 판별의 경우 분석을 위한 시간과 노력이 많이 들며, 약용식물의 재배환경 및 생육조건에 따라 약리적 성분에 변화가 올 수 있어 판별에 한계가 있다. DNA 분석에 의한 분자생물학적 식물판별기술은 위와 같은 문제점을 해결하기 위한 도구로서 인정받고 있는데, DNA 유전체는 환경의 변화에 따른 변화가 없으며, 가공 유통되어 식물 원재료를 쉽게 판별할 수 없는 한약재의 판별에도 유용하게 이용될 수 있다.
분자마커란 중합효소연쇄반응(Polymorphism Chain Reaction) 기술을 사용하여 다형성을 검출하는 방법으로 기본적으로 간단하고 신속하며 재배환경이나 식물의 발육단계, 연구자의 주관성 등 여러 환경적 요인으로부터 결과에 영향을 받지 않는다. InDel 마커는 DNA의 염기서열에서 삽입(insertion) 되거나 결실(deletion) 되어진 염기서열을 분자표지로 탐색하여 사용한다. cpInDel이란 엽록체 DNA 부위에 존재하는 InDel 부위를 말하며 비교적 엽록체 게놈 내에 고루 분포한다. 또한 특정 유전자 부위에 존재하여 아미노산의 종류를 결정짓는 코돈의 일부가 아니기 때문에 자연선발의 대상이 아니며, 표현형에 있어서 공우성의 특징을 나타낸다.
한편, 한국등록특허 제1811539호에는 'InDel 마커를 이용한 당귀 품종의 감별방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2018-0080915호에는 '당귀의 종 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용하여 당귀의 종을 판별하는 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 당귀 속 식물로부터 일당귀를 판별하기 위한 엽록체 서열 기반 분자마커 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 다양한 한약재 및 식용으로 이용되는 4종의 당귀 속 식물인 참당귀(Angelica gigas), 일당귀(A. acutiloba), 구릿대(A. dahurica) 및 바디나물(A. decursiva)의 엽록체 유전체 정보를 비교하여 일당귀의 엽록체 서열에서만 특이적으로 결실된 InDel 다형성에 기반한 분자마커를 개발하였고, 상기 분자마커를 이용하여 참당귀, 일당귀, 구릿대 및 바디나물 유전자원의 시료를 분석한 결과, 4종의 당귀 속 식물 중에서 일당귀만을 특이적으로 식별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 당귀 속 식물로부터 일당귀(Angelica acutiloba)를 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 당귀 속 식물로부터 일당귀를 판별하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 당귀 속 식물의 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 당귀 속 식물로부터 일당귀를 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명은 PCR 기술을 이용하여 당귀 속 4종의 식물 중 일당귀(Angelica acutiloba)에서 특이적으로 다형성을 보이는 InDel 마커를 개발하여 전기영동을 통해 증폭된 밴드의 패턴을 파악함으로써 신속하고 정확하게 일당귀를 식별할 수 있도록 하였다. 따라서, 본 발명의 분자마커는 국내 한약재 시장에서 유통되는 당귀 속 식물의 원료 혼용 방지 및 생산되는 당귀 속 식물의 품질 관리에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 일당귀(Angelica acutiloba)에서 특이적으로 염기 결실된 유전자좌위이다. Angelica gigas; 참당귀, Angelica decursiva; 바디나물, Angelica acutiloba; 일당귀, Angelica dahurica; 구릿대.
도 2는 Aa_D_CpInDel 마커를 이용한 PCR 증폭산물의 Fragment AnalyzeTM Automated CE System을 이용한 분석결과이다. A. gigas; 참당귀, A. acutiloba; 일당귀, A. dahurica; 구릿대, A. decursiva; 바디나물.
도 3은 Aa_D_CpInDel 마커를 이용한 PCR 증폭산물의 Fragment AnalyzeTM Automated CE System을 이용한 분석결과를 겔 전기영동 사진으로 시각화한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 당귀 속 식물로부터 일당귀(Angelica acutiloba)를 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트에 있어서, 상기 당귀 속 식물은 참당귀(Angelica gigas), 구릿대(A. dahurica) 및 바디나물(A. decursiva)일 수 있다.
본 발명의 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 참당귀, 구릿대 및 바디나물에서는 확인되지 않으나, 일당귀의 엽록체 서열에서만 특이적으로 결실된 223bp 염기를 확인할 수 있는 프라이머 세트로, 당귀 속 식물인 참당귀, 구릿대 및 바디나물로부터 일당귀만을 특이적으로 구분할 수 있는 프라이머 세트이다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 당귀 속 식물로부터 일당귀(Angelica acutiloba)를 판별하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한,
당귀 속 식물의 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 당귀 속 식물로부터 일당귀(Angelica acutiloba)를 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 당귀 속 식물의 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 당귀 속 식물의 시료는 이에 한정되지 않으나, 일당귀, 참당귀, 구릿대 및 바디나물로 의심되는 식물체의 뿌리, 혹은 이의 절편형태로 가공된 산물일 수 있다. 상기 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 전술한 것과 같다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 당귀 속 식물에서 일당귀를 판별하기 위한 방법은 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 단계 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 당귀 속 식물 자원수집 및 DNA 추출
실험에 사용된 참당귀(A. gigas), 일당귀(A. acutiloba), 구릿대(A. dahurica) 및 바디나물(A. decursiva)의 4개 종 당귀 속 식물은 국립원예특작과학원 및 국립수목원에서 종자를 분양받아 -80℃의 초저온 냉동고에 보관하였다. DNA 추출은 초고속 파쇄/균질화 장치인 TissueLyser Ⅱ(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 종자를 파쇄한 후 CTAB 방법을 사용하여 DNA를 추출하고 Tris-EDTA 버퍼에 용출하였다.
2. PCR을 이용한 DNA 증폭
CTAB 방법을 사용하여 추출한 참당귀, 일당귀, 구릿대 및 바디나물의 DNA를 5 ng/㎕로 희석하여 DNA 2 ㎕ (DNA 10 ng), 프라이머 혼합물 2 ㎕ (0.2 M 정방향 프라이머 1 ㎕, 0.2 M 역방향 프라이머 1 ㎕), Taq mixture 10 ㎕, 증류수 6 ㎕을 혼합하여 20 ㎕의 PCR 반응 혼합물을 만들었다. PCR 과정은 전변성 95℃ 5분; 변성(denaturation) 95℃ 30초, 결합(annealing) 48℃ 30초, 신장(extension) 72℃ 60초의 과정을 총 34회 반복; 최종 신장 72℃ 10분의 조건으로 수행하였다.
3. PCR에 사용된 엽록체 기반 InDel 마커
PCR에 사용된 엽록체 기반 InDel 마커 증폭용 프라이머 세트는 참당귀, 일당귀, 구릿대, 바디나물의 완성된 엽록체 서열(각각 순서대로 KX118044.2, KT963036.1, KT963037.1, KT781591.1)을 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information, https://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 수집하였다. 그 후, CLC Main Workbewnch 프로그램 version 8.0.1을 사용하여 비교 분석하였고, 일당귀(Angelica acutiloba)에서 특이적으로 염기가 결실된 유전자좌위를 선발하였고(도 1), 이를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제작하여 Angelica acutiloba_discrimination_chloroplast_InDel(이하, Aa_D_CpInDel) 마커를 개발하였다.
Aa_D_CpInDel 마커의 프라이머 염기서열 정보
프라이머명 서열(5'→3')
Aa_D_CpInDel Fwd CCTAGTAAAACCTCCCTC (서열번호 1)
Aa_D_CpInDel Rev TCGGCCAATCCTAATATTTC (서열번호 2)
실시예 1. PCR을 이용하여 다형성을 나타내는 Indel 마커의 다형성 판독
상기 개발된 분자마커 Aa_D_CpInDel를 이용하여, 당귀 속 식물에서 일당귀를 판별할 수 있는지 검증하였다. 참당귀, 일당귀, 구릿대 및 바디나물의 각 3개 자원, 총 12개 자원을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 증폭산물을 확인하기 위해 Fragment AnalyzeTM Automated CE System(Advanced Analytical Technologies, Inc. Ames. USA)을 사용하였다.
그 결과, 도 2 및 도 3에 개시된 것과 같이, 참당귀(A. gigas), 구릿대(A. dahurica) 및 바디나물(A. decursiva)에서는 347bp의 산물이 확인된 반면, 일당귀(A. acutiloba)에서는 124bp의 특이적 밴드가 확인되어, 당귀 속 식물 4종 중에서 일당귀 식물체만을 특이적으로 식별할 수 있음을 확인하였다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Molecular marker based on chloroplast sequence for discriminating Angelica acutiloba from Angelica species and uses thereof <130> PN19320 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cctagtaaaa cctccctc 18 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tcggccaatc ctaatatttc 20

Claims (7)

  1. 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 참당귀(Angelica gigas), 구릿대(A. dahurica) 및 바디나물(A. decursiva)로부터 일당귀(Angelica acutiloba)를 판별하기 위한 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 제1항의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 참당귀(Angelica gigas), 구릿대(A. dahurica) 및 바디나물(A. decursiva)로부터 일당귀(Angelica acutiloba)를 판별하기 위한 키트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  5. 당귀 속 식물의 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 참당귀(Angelica gigas), 구릿대(A. dahurica) 및 바디나물(A. decursiva)로부터 일당귀(Angelica acutiloba)를 판별하는 방법.
  6. 삭제
  7. 제5항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 참당귀, 구릿대 및 바디나물로부터 일당귀를 판별하는 방법.
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