KR101912196B1 - 모란과 작약 구별을 위한 분자마커와 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 모란과 작약 구별을 위한 분자마커와 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 엽록체 서열 기반의 InDel 분자마커 및 상기 분자마커 증폭용 프라이머 세트는 모란과 작약을 간단하고 신속하게 구별할 수 있으므로, 모란과 작약이 혼용되는 것을 효과적으로 방지할 수 있을 것으로 사료된다.

Description

모란과 작약 구별을 위한 분자마커와 프라이머 세트 및 이의 용도{Molecular marker and primer set for discriminating Paeonia suffruticosa and Paeonia lactiflora and uses thereof}

본 발명은 모란과 작약 구별을 위한 분자마커, 상기 분자마커를 증폭하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.

최근 분자생물학의 급속한 발전으로 DNA 수준에서 유전자원의 다양성(bio-diversity) 연구를 가능케 하는 핵산 지문 분석 방법 및 다양한 DNA 마커들이 개발되었다. 이를 통해 유용 형질의 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류·동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석 등을 간단하고 신속하게 수행할 수 있게 되었다. 지금까지 개발된 PCR(polymerase chain reaction)을 이용한 지문분석법(fingerprinting)에는 RAPD(randomly amplified polymorphic DNAs) 방법, AFLP(amplified fragment length polymorphic DNA) 방법, SSR(simple sequence repeat) 방법 등이 있다. 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP 방법은 높은 DNA 다형성(polymorphism) 검출로 각광을 받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하며, SSR 방법은 DNA 반복 배열인 초위성체(microsatellite) 영역의 염기배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 개체 내의 초위성체를 분석하는 방법으로, 상기 단순염기서열의 반복수는 품종 간 또는 개체 간에 다르기 때문에 이 부분을 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타날 수 있으나, 고밀도 유전자지도 제작에는 충분하지 않다는 단점이 있다.

이에 반해 InDel(insertion/deletion) 마커는 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타나게 하는 장점을 유지하면서 고밀도 유전자지도 제작에는 충분하지 않는 SSR 마커의 단점을 보완하는 것으로, 특정 위치에 있는 DNA의 염기서열 분석을 통해 품종간 염기서열의 삽입 또는 결실을 기반으로 PCR 프라이머를 제작하는 방법이다.

식물의 경우는 핵, 미토콘드리아, 엽록체 게놈 등 3개의 게놈을 가지고 있다. 식물의 유전정보의 대다수는 핵 게놈에 존재하지만 게놈의 크기가 크고, 많은 인트론(intron)과 엑손(exon)으로 구성되어 있어, 특정 유전자의 염기 서열을 유전체 DNA(genomic DNA)로부터 분석하여 식물종의 보존이나 식별에 이용하는데는 제한적이며, 핵 리보솜 DNA(nuclear ribosomal DNA, nrDNA)의 ITS(internal transcribed spacer) 부위, 알코올탈수소효소(alcohol dehydrogenase)의 특정 인트론 부위 등이 이용된다. 식물 미토콘드리아 게놈의 경우 보통 400kb∼4,000kb 크기로, 동물 미토콘드리아와는 달리 크기가 크고 구조적으로 매우 불안정하며 염기서열이 매우 보존적이기 때문에 속, 종 수준 또는 그 이하의 분류군의 계통관계나 식별에 이용하는 것은 거의 의미가 없다.

반면에 식물 엽록체는 기원(origin)이나 진화(evolution)와 같은 엽록체 자체 연구뿐만 아니라, 유전학적인 연구에서도 매우 중요시되어왔다. 엽록체 게놈의 크기는 160Kb 내외이고 구조적으로 안정하며, 염기서열의 변이가 큰 비암호와 영역(non coding region)은 고유종의 식별, 아종 및 변종의 식별, 유전적 변이의 비교 분석에도 유용성이 보고되고 있다. 엽록체 게놈에 존재하는 120여개의 유전자 중 84개의 유전자가 단백질로 전사되는데 유전자에 따라서 진화속도가 크게 다르다. 어떤 보존적인 유전자는 고등 분류군의 계통에만 이용될 수 있으나 빨리 진화하는 유전자의 염기서열은 근연속이나 속내의 뚜렷한 종간의 유연관계를 논의하는데도 이용될 수 있다. 따라서 한국 특산속 식물의 타당성, 식별, 보존 전략을 세우는데 엽록체 게놈의 염기서열은 광범위하게 활용이 가능하다.

작약(Paeonia lactiflora)은 작약속(Paeonia)의 여러해살이풀로, 주로 산기슭이나 골짜기에서 자란다. 가지는 옆으로 길게 2m 이상 뻗고 털이 없으나 갈고리 같은 가시가 있으며, 높이는 60cm 정도이다. 뿌리는 여러 개가 나오지만 가늘고 양끝이 긴 뾰족한 원기둥 모양으로 굵으며, 잎은 어긋나고 밑부분의 것은 작은잎이 3장씩 두 번 나오는 겹잎이다. 작은 잎은 바소꼴 또는 타원형이나 때로는 2~3개로 갈라지며 잎맥 부분과 잎자루는 붉은색을 띤다. 잎 표면은 광택이 있고 뒷면은 연한 녹색이며 가장자리는 밋밋하다. 꽃은 5~6월에 줄기 끝에 1개가 피는데 지름 10 cm 이상으로 크고 아름다우며, 꽃의 색은 붉은색, 흰색 등 다양하다. 꽃은 주로 원예용으로 쓰며 뿌리는 진통, 복통, 월경통, 무월경, 토혈, 빈혈, 타박상 등을 치료하기 위한 약재로 쓰인다.

모란(Paeonia suffruticosa)은 작약속(Paeonia)에 속하는 낙엽관목으로, 전국 각지에서 자라며 주로 정원이나 담장 밑에서 관상용으로 재배하고 있다. 높이는 2m 가량이고 가지는 굵고 털이 없으며, 잎은 3엽으로 되어 있고 작은 잎은 달걀모양으로 2~5 개로 갈라진다. 잎 표면은 털이 없고 뒷면에 잔털이 있으며 흔히 흰빛이 돈다. 꽃은 양성으로 5월에 홍색으로 피고 지름 15 cm 이상이며 꽃턱이 주머니처럼 되어있어 씨방을 둘러싸고 있다. 한방에서는 주로 뿌리가 사용되며 소염제, 진통제 역할을 하여 두통, 총수염, 월결통, 부스럼 등의 치료에 사용되고 있다. 주된 화학성분은 페오놀(paeonol)로, 이는 알츠하이머 증상 개선 효과, 항 돌연변이 활성, 심근경색 완화효과 등에 관한 연구결과가 보고되었으며, 화장품 원료로 사용될 경우 항산화 활성 및 미백에도 효과가 있는 것으로 알려져있다.

모란의 꽃은 개화시기와 생김새가 작약과 매우 비슷하여 구분이 쉽지 않기 때문에 모란의 꽃은 작약의 꽃과 혼용될 가능이 높다. 따라서 모란과 작약을 쉽고 간단하게 구별할 수 있는 방법의 개발이 절실히 필요하나 아직까지 그에 대한 연구가 미미한 실정이다.

이에 본 발명자들은 모란 및 작약의 엽록체 서열에 기반한 InDel 분자마커를 개발하였고, 상기 분자마커를 증폭할 수 있는 프라이머를 제작하여 모란과 작약을 구별할 수 있음을 확인하였다.

한편, 한국등록특허 제1331740호에는 '작약에서 유래된 SSR 프라이머 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 중국등록특허 제103184290호에는 'SSAP 분자 마커를 활용한 모란 품종의 판별 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 모란과 작약 구별을 위한 분자마커와 프라이머 세트 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 모란(Paeonia suffruticosa)과 작약(Paeonia lactiflora)의 엽록체 게놈 염기서열을 비교하여 ycf1 및 tmY-GUA와 trnD-GCG 유전자간 부위에서 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 염기서열에 기반한 분자마커를 개발하였고, 상기 InDel 분자마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제작하여 모란 및 작약 시료를 대상으로 PCR을 수행한 결과, 본 발명의 InDel 분자마커가 모란과 작약을 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 모란(Paeonia suffruticosa)과 작약(Paeonia lactiflora) 간에 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 염기서열로 이루진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 모란과 작약 구별용 InDel 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 모란과 작약 구별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 InDel 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 모란과 작약 구별용 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 모란과 작약 구별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 모란과 작약을 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 InDel 분자마커는 모란 및 작약의 엽록체 게놈에서 삽입 또는 결실에 의한 다형성을 나타내는 염기서열에 기반한 것으로, 본 발명의 InDel 분자 마커를 이용하면 모란과 작약을 간단하고 신속하게 구별할 수 있으므로, 국내 화장품 원료 시장에서 유통되는 모란과 작약을 명확히 판별하여 원료의 혼용 방지 및 원료 품질관리에 대한 지표로서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

도 1은 모란과 작약 엽록체 게놈 염기서열 중 ycf1 유전자 영역을 비교한 결과이다. A; ycf1 유전자 영역 중 InDel 다형성이 나타난 부위를 보여주는 모식도, B; 모란과 작약간에 InDel 다형성을 보이는 염기서열에 기반한 분자마커 위치를 나타낸 모식도, 파란색; SSC1-2 프라이머 세트의 증폭 서열 구간.
도 2는 모란과 작약 엽록체 게놈 염기서열 중 tmY-GUA와 trnD-GCG 유전자 사이를 비교한 결과이다. A; tmY-GUA와 trnD-GCG 유전자간 영역에서 InDel 다형성이 나타난 부위를 보여주는 모식도, B; 모란과 작약간에 InDel 다형성을 보이는 염기서열에 기반한 분자마커 위치를 나타낸 모식도, 파란색; LSC9-1 프라이머 세트의 증폭 서열 구간.
도 3은 InDel 분자마커를 증폭시키기 위한 프라이머 세트를 이용한 모란 및 작약의 PCR 결과이다. A; ycf1 유전자 내 InDel 다형성 염기서열에 대한 SSC1-2 프라이머 세트를 이용한 PCR 결과, B; tmY-GUA와 trnD-GCG 유전자간 영역 내 InDel 다형성 염기서열에 대한 LSC9-1 프라이머 세트를 이용한 PCR 결과.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 모란(Paeonia suffruticosa)과 작약(Paeonia lactiflora) 간에 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 염기서열로 이루진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 모란과 작약 구별용 InDel 조성물을 제공한다.

상기 서열번호 1 내지 서열번호 4는 각각 삽입(insertion) 또는 결실(deletion) 부위의 염기서열을 포함하는 다형성 뉴클레오티드이다. InDel 다형성이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 일부가 중간에 더해지거나 없어져 품종 혹은 종간에 길이 차이가 생긴 경우를 포함하는 서열을 말한다. 상기 다형성 뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA가 될 수 있다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 InDel 조성물에 있어서, 상기 InDel 다형성 염기 정보는 표 2에 나타내었다.

또한, 본 발명은 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 모란과 작약 구별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 2개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 2개의 프라이머 세트, 즉, 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있다. 2개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면 모란과 작약을 더욱 효율적으로 구별할 수 있다.

상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 5, 6, 7 및 8의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 5의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 5, 6, 7 및 8의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 1 내지 서열번호 4의 염기서열의 InDel 다형성 뉴클레오티드, 이에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 모란과 작약 구별용 마이크로어레이를 제공한다.

바람직하게는, 상기 다형성 뉴클레오티드는 아미노-실란, 폴리-L-라이신 또는 알데히드의 활성기가 코팅된 기판에 고정될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 또는 플라스틱일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 다형성 뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 피에조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 다형성 뉴클레오티드 또는 그의 상보적 다형성 뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 모란과 작약 구별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

또한, 본 발명은

모란 또는 작약 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 모란과 작약을 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 모란 또는 작약 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 모란 또는 작약 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 조합은 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 모란과 작약을 구별하는 방법은 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 단계의 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 모란과 작약의 DNA 추출

모란(Paeonia suffruticosa)과 작약(Paeonia lactiflora)을 충북대학교 실험포장에서 재배되고 있는 개체의 잎을 채취하여 사용하였다. 모란과 작약의 잎을 각각 채취하여 액체 질소에 담궈 동결시킨 후 막자사발로 분쇄하였다. 상기 모란과 작약의 분쇄물을 이용하여 CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) 방법으로 게놈 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 TE 완충액에 용해시킨 후 보관하였다.

2. 중합효소연쇄반응(PCR)

상기 추출된 모란과 작약의 DNA를 10 ng/㎕로 희석하고, DNA 10 ng과 각 프라이머 10 pmole 및 기타 PCR 반응 시약을 혼합하여 최종 20 ㎕가 되도록 PCR 반응 혼합물을 제조한 후 PCR을 수행하였고, PCR 조건은 하기 표 1과 같다. PCR 증폭산물은 2% 아가로스 겔에 전기영동하여 확인하였다.

PCR 반응 조건

단계	온도(℃)	시간
전-변성	95	3분
변성	95	1분
결합	50	1분
신장	72	1분 30분
변성 단계로 돌아가 34회 추가 반복
최종 신장	72	10분
보관	4	∞

실시예 1. 모란과 작약의 엽록체 염기서열 비교 분석을 통한 변이지역 분석

상기에서 추출한 모란 및 작약의 게놈 DNA를 Theragen Etex에 의뢰하여 시퀀싱하였으며, CLC Genomics Workbench 7.5 program을 이용하여 어셈블리(assembly)를 하였다.

모란과 작약의 시퀀싱 결과 중, 엽록체 게놈 컨티그들 중, SSC(small single copy) 부분과 LSC(long single copy) 부분을 각각 정렬(alignment)한 후 비교하여, 삽입(insertion) 또는 결실(deletion)된 염기서열을 분석하였다.

그 결과, 모란과 작약 엽록체 게놈의 SSC 부분에 위치한 ycf1 유전자에 존재하는 24bp의 염기서열이 모란에서는 삽입되고 작약에서는 결실된 것을 확인하였다(도 1). 또한, 모란과 작약 엽록체 게놈의 LSC 영역에 위치한 tmY-GUA와 trnD-GUC의 유전자간 부위에 존재하는 108bp의 염기서열이 모란에서는 삽입되고 작약에서는 결실된 것을 확인하였다(도 2). 상기 삽입 또는 결실의 염기서열 정보는 하기 표 2와 같다.

실시예 2. 분자마커를 이용한 모란과 작약 구별

모란과 작약의 엽록체 염기서열 비교분석을 통해, ycf1 유전자 내 InDel 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트 PaeSSC1-2 및 tmY-GUA와 trnD-GUC의 유전자간 영역 내 InDel 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트 PaeLSC9-1을 제작하였다.

모란과 작약 구별용 프라이머

프라이머 명칭	염기서열(5'→3')	Tm (℃)	위치
PaeSSC1-2 F	GATTCGTTCAAGAAAAGCCA (서열번호 5)	50.31	ycf1
PaeSSC1-2 R	GCACGGAGCCTTTGATTATA (서열번호 6)	52.11
PaeLSC9-1 F	TCCACACGAATACGCACT (서열번호 7)	53.60	tmY-GUA ~ trnD-GUC
PaeLSC9-1 R	GGTTAATGGGGACGGACT (서열번호 8)	54.28

상기 프라이머 세트 PaeSSC1-2 및 PaeLSC9-1를 이용하여 모란과 작약을 구별할 수 있는지 확인하기 위해, 모란과 작약 각 3개체의 DNA 시료를 주형으로 하여 PCR 분석을 수행하였다.

그 결과, 모란과 작약에서 각각 다른 크기의 밴드가 나타나 모란과 작약이 정확하게 구별되는 것을 확인하였다(도 3). 따라서, 상기 결과를 통해 모란 및 작약 엽록체 게놈 서열에서 InDel 다형성을 보이는 염기서열에 기반한 본 발명의 분자마커와 이를 증폭하기 위한 프라이머 세트 PaeSSC1-2 및 PaeLSC9-1은 모란과 작약을 효과적으로 구별하기 위해 활용될 수 있음을 확인하였다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Molecular marker and primer set for discriminating Paeonia suffruticosa and Paeonia lactiflora and uses thereof <130> PN17368 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 167 <212> DNA <213> Paeonia suffruticosa <400> 1 gattcgttca agaaaagcca aacatgtagt gatttttact gataatcagc aaaaccccaa 60 tacttataat aacgaaagta ataatcctga tcaagcagac gagatatctt tgatacgtta 120 ttcgcaacaa tcagattttc gtcgaaatat aatcaaaggc tccgtgc 167 <210> 2 <211> 143 <212> DNA <213> Paeonia lactiflora <400> 2 gattcgttca agaaaagcca aacgtgtagt gatttttact gataataacg aaagtaataa 60 tcctgatcaa gcagacgaga tatctttgat acgttattcg caacaatcag attttcgtcg 120 aaatataatc aaaggctccg tgc 143 <210> 3 <211> 388 <212> DNA <213> Paeonia suffruticosa <400> 3 tccacacgaa tacgcacttt cgtgagggtg acatgaatca ggaatcggaa tcactagcaa 60 tccttttgct attgtcaaat cgattgaaaa tctatttttg ttttgaatga agaaaaaagg 120 ttgttttttt tttttttatt atttccgctt ttctttaaac tttagactta cagattctgg 180 tatgaatgta gatcattagc aaaatcggga aacaagcaaa taaatagaag ttgagggata 240 tagccgacag ttttctttat ttccgggcat ttatagaaaa cgaatgggta tatcatttca 300 tggcgagtct gcaaattttt tgggccgagc tggatttgaa ccagcgtaga catattgcca 360 acgaatttac agtccgtccc cattaacc 388 <210> 4 <211> 280 <212> DNA <213> Paeonia lactiflora <400> 4 tccacacgaa tacgcacttt cgtgagggtg acatgaatca ggaatcggaa tcactagcaa 60 tccttttgct attgtcaaat cgattgataa tctatatcgg gaaacaagca aataaataaa 120 agttgaggga tatagccgac agttttcttt atttccgggc atttatggaa aacgaatggg 180 tatatcattt catggcgagt ctgcaaattt tttgggccga gctggatttg aaccagcgta 240 gacatattgc caacgaattt acagtccgtc cccattaacc 280 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gattcgttca agaaaagcca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gcacggagcc tttgattata 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tccacacgaa tacgcact 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggttaatggg gacggact 18

Claims (8)

1. 모란(Paeonia suffruticosa)과 작약(Paeonia lactiflora) 간에 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 모란과 작약 구별용 InDel 조성물.
2. 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 모란과 작약 구별용 프라이머 세트.
3. 삭제
4. 제1항에 기재된 InDel의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 모란과 작약 구별용 마이크로어레이.
5. 제2항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 모란과 작약 구별용 키트.
6. 제5항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
7. 모란 또는 작약 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제2항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 모란과 작약을 구별하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.

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