KR102096789B1 - 작약의 원산지 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용하여 작약의 원산지를 판별하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 명세서에는 작약의 원산지 판별용 프라이머 세트, 이를 포함하는 작약 원산지 판별용 키트 및 이를 이용하여 작약의 원산지를 판별하는 방법이 개시된다. 본 발명의 일 측면인 작약의 원산지 판별용 프라이머 세트는, 동종에 속하는 작약의 원산지를 판별하는데 사용될 수 있다. 특히, 작약의 원산지가 한국인지 또는 중국인지 여부를 높은 정확도로 판별할 수 있으며, 중국산 작약의 혼입여부를 판별하는데 활용될 수 있다.
Description
본 명세서에는 작약의 원산지 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용하여 작약의 원산지를 판별하는 방법이 개시된다.
최근 중국산 먹거리에 대한 불신의 반대급부로 국내산 먹거리에 대한 소비자들의 수요가 급증하고 있다. 일부 유통업자들은 이러한 소비자의 심리를 이용하여, 국내산에 비하여 값싼 중국산 먹거리의 원산지를 국산으로 둔갑시켜 판매하는 일이 빈번히 발생하고 있다. 이는 농수산물의 원산지 표시에 관한 법률 및 관련 규정을 위반한 행위일 뿐만 아니라, 소비자에게 잘못된 원산지 정보를 제공하여 유통질서를 어지럽히는 일이며, 국민의 먹거리 안전을 위협하는 행위이다.
작약(Paeonia lactiflora Pall.)은 예로부터 무월경의 개선, 팔다리 마비 증상을 완화시키는 용도로 사용되어 왔고, 최근에는 고혈압, 염증, 신경통, 신경쇠약 등 다양한 질환에도 효과가 있다는 연구결과가 나오면서 소비자의 관심이 크게 증가하고 있다. 따라서, 작약의 원산지를 명확히 판별하는 방법의 확립이 시급하나, 작약속 식물의 종을 판별하는 방법(한국 공개특허 제2013-0045636호 등)은 별론으로 하고, 원산지를 판별하는 방법에 대해서는 아직까지 연구된 바가 없다.
일 측면에서, 본 발명의 목적은, 간단하고 경제적으로 작약의 원산지를 판별하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명의 목적은, 중국산 작약과 국산 작약의 혼합여부를 판별하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 서열, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 서열, 및 이들 각각에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열 중 하나 이상의 염기서열을 포함하는 작약의 원산지 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 서열, 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 서열, 및 이들 각각에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열 중 하나 이상의 염기서열을 포함하는 작약의 원산지 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 측면인 작약의 원산지 판별용 프라이머 세트는, 동종에 속하는 작약의 원산지를 판별하는데 사용될 수 있다. 특히, 작약의 원산지가 한국인지 또는 중국인지 여부를 높은 정확도로 판별할 수 있어, 중국산 작약의 혼입여부를 판별하는데 활용될 수 있다.
도 1은, 한국산 작약의 PCR 결과를 보이는 도이다.
도 2는, 중국산 작약의 PCR 결과를 보이는 도이다.
도 2는, 중국산 작약의 PCR 결과를 보이는 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
일 측면에서, 본 발명은, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 서열, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 서열, 및 이들 각각에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열 중 하나 이상의 염기서열을 포함하는, 작약의 원산지 판별용 프라이머 세트이다.
또한 일 측면에서, 본 발명은, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 서열, 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 서열 및 이들 각각에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열 중 하나 이상의 염기서열을 포함하는, 작약의 원산지 판별용 프라이머 세트이다.
상기 프라이머는, SCAR marker(sequence-characterized amplified region marker)일 수 있다. 상기 프라이머는, RAPD(random amplified polymorphic DNA), ISSR(inter simple sequence repeat), SRAP(sequence-related amplified polymorphism)를 통해 확보된 다형성 밴드를 이용하여 제작된 것일 수 있다.
본 명세서에서 '원산지'란, 식물이 재배된 지역을 의미한다. 예컨대, 한국산 또는 국산이란, 한국에서 심어지고 길러진 것을 의미할 수 있고, 중국산은 중국에서 심어지고 길러진 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서, '프라이머'는 검출하고자 하는 유전자를 포함하는 유전자 시료의 증폭에 통상적으로 사용되는 일반적인 시발체를 의미한다.
본 명세서에서 '상보적인 서열(complementary sequence)'란, 특정 서열과 서로 염기쌍을 이루어 이중가닥 구조를 형성할 수 있는 염기배열을 의미한다.
상기 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 서열, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 서열, 및 이들 각각에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열 중 하나 이상의 염기서열을 포함하는, 작약의 원산지 판별용 프라이머 세트는, 한국산 작약을 판별하기 위한 것일 수 있다.
또한, 상기 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 서열, 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 서열 및 이들 각각에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열 중 하나 이상의 염기서열을 포함하는, 작약의 원산지 판별용 프라이머 세트는, 중국산 작약을 판별하기 위한 것일 수 있다.
상기 프라이머 세트는 예컨대, 포워드 프라이머(forward primer) 및 리버스 프라이머(reverse primer)로 구성될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 서열, 및 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열은, 정방향 프라이머이고, 상기 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 서열, 및 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열은, 역방향 프라이머일 수 있다.
또한, 일 구현예에서, 상기 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 서열, 및 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열은, 정방향 프라이머이고, 상기 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 서열, 및 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열은, 역방향 프라이머일 수 있다.
또한, 상기 작약은, Paeonia lactiflora일 수 있다. 즉, 본 발명은 일 측면에서, Paeonia lactiflora의 원산지를 구별하기 위한 것일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은, 상기 프라이머 세트를 포함하는 작약의 원산지 판별용 키트일 수 있다.
상기 서열번호 1 내지 4의 서열은 아래 표 1에 기재된 바와 같다.
| Primer name | Sequence | |
| 국산 작약 (P. lactiflora) 판별용 SCAR marker |
KPLF(Forward) | GAT TCG AAT TGA CTG G |
| KPLR(Reverse) | TCC CTT CTT AAA CCG AGC | |
| 중국산 작약 (P. lactiflora) 판별용 SCAR marker |
CPLF(Forward) | TAC TGG TGG CAT TCG CGT |
| CPLR(Reverse) | GTC AAT TCG TAC GCT GG |
일 측면에서, 본 발명은, 작약으로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 DNA를 주형으로 하고, 상기 작약의 원산지 판별용 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하는 단계; 상기 PCR의 증폭 산물을 전기영동하는 단계; 및 상기 전기영동된 증폭 산물의 크기를 측정하여 작약의 원산지를 판별하는 단계를 포함하는, 작약의 원산지 판별 방법이다.
일 측면에서, 상기 작약의 원산지를 판별하는 단계는, PCR의 증폭 산물의 크기가 480~520 bp인 경우 한국산 작약으로 판단하고, 380~420bp인 경우 중국산 작약으로 판단하는 것을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 한국산 작약은 상기 PCR의 증폭 산물의 크기가 500bp 일 수 있고, 중국산 작약은 400bp일 수 있다.
구체적으로, 한국산 작약 판별용 프라이머를 이용한 PCR의 증폭 산물이 500bp에서 확인되면 국산 작약으로 판단하고, 중국산 작약 판별용 프라이머를 이용한 PCR의 증폭 산물이 400bp에서 확인 되면 중국산 작약으로 판단할 수 있다. 두가지 증폭 산물이 모두 발견되면, 국산 작약과 중국산 작약이 혼합된 것으로 판단할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 PCR은, 하기 중 하나 이상의 조건을 포함할 수 있다.
90~100℃에서 3~7분 동안 초기 변성(initial denaturation); 90~100℃에서 25~35초간 변성(denaturation); 40~55℃에서 5~30초간 결합(annealing); 70~75℃에서 10~35초간 신장(extension); 및 70~75℃에서 3~7분간 최종신장(elongation).
일 구현예에서, 상기 PCR 조건은, 작약의 원산지를 판별하기 위하여 최적화된 것일 것 있다. 구체적으로, 한국산 작약을 판별할 경우에는, 상기 결합은, 40~50℃, 바람직하게는 42~47℃에서 15~25초, 바람직하게는 18~22초 동안 수행될 수 있다. 또한, 상기 신장의 경우, 상기 온도 범위에서 25~35초, 바람직하게는 28~32초간 수행될 수 있다. 또한, 상기 변성, 결합, 및 신장은 33~37회 수행될 수 있고, 일 구현예에서는 35회 수행될 수 있다.
한편, 중국산 작약을 판별할 경우에는, 상기 결합은 45~55℃, 바람직하게는 48~52℃에서 5~15초, 바람직하게는 8~12초 동안 수행될 수 있다. 또한, 상기 신장의 경우, 상기 온도 범위에서 10~20초, 바람직하게는 13~17초간 수행될 수 있다. 또한, 상기 변성, 결합, 및 신장은 38~42회 수행될 수 있고, 일 구현예에서는 40회 수행될 수 있다.
또한, 일 구현예에서, PCR에 사용된 반응액의 조성은 하기와 같을 수 있다.
| 성분 | 농도 |
| DNA polymerase | 0.8~1.2U |
| dNTPs | 각각 230~270μM |
| 프라이머 | 각각 2 μM |
| 주형 DNA | 48~52ng |
| 멸균 증류수 | 잔량 |
| 총 합 | 20㎕ |
일 구현예에서, 상기 PCR에 사용되는 용액의 조성은, 용액 총 20㎕ 당 DNA 폴리머라아제 1.0U, dNTPs 각 250?M, 한국산 및 중국산 작약 판별용 프라이머 각 2.0 μM, 주형 DNA 50ng, 및 잔량의 멸균 증류수를 포함할 수 있다.
이하, 실시예 및 시험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1] 작약 유전자의 추출 및 순도 확인
[실시예 1-1] 작약 유전자의 추출
DNA는 DNeasy plant mini 키트(QIAGEN) 등을 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 아래와 같이 추출하였다. 시료는, 국내산 작약시료의 경우 남원, 제천, 영월 등에서 재배 중인 작약을 표준시료로 사용하였으며, 중국산 작약시료의 경우 중국 작약 최대 산지인 안휘성, 사천성에서 재배된 작약을 표준시료로 사용하였다.
a. 시료(약 0.1 g)에 AP1 완충액 400 ㎕ 및 RNase A (100 ㎎/㎖) 4㎕를 넣어 혼합 후 65℃에서 10분간 반응시켰다(반응 중 샘플을 2~3회 혼합).
b. 반응액에 AP2 완충액 130 ㎕를 넣고 혼합하여 얼음에 5분간 방치 후 원심분리(14,000 x g, 5분)하였다.
c. 상층액을 QIAshredder mini spin 컬럼에 옮긴 후 원심분리(14,000 x g, 2분)하였다.
d. AP3/E 완충액을 용출액 1.5배에 해당되게 혼합 후 DNeasy Mini spin 컬럼에 넣고 원심분리(8,000 x g, 1분) 하였다.
e. AW 완충액 500 ㎕로 DNeasy Mini spin 컬럼을 2회 세척하였다.
f. AE 완충액 100 ㎕를 컬럼에 넣고 5분간 방치 후 원심 분리하여 (8,000 x g, 1분) 최종 용출하였다.
[실시예 1-2] 작약 유전자의 순도 확인
DNA 원액의 농도는 멸균증류수(또는 TE(Tris-EDTA) 완충용액, pH 8.0)로 적절히 희석한 후 분광광도계를 사용하여 260 nm에서 흡광도(Absorbance, A)를 측정하고, 그 값이 1일 때 DNA 농도가 50 ng/㎕인 것으로 하여 계산하였다. 한편, 추출된 DNA의 순도를 확인하기 위하여 230, 260, 280 nm에서 흡광도를 각각 측정하였다. A260/A280과 A260/A230이 1.7~2.0일 경우 PCR에 적합한 DNA로 판단하였다.
[실시예 2] SCAR marker 설계
3종의 Random Primer(RAPD, ISSR, SRAP : primer 250set)를 이용하여 유의성 있는 다형성 밴드를 확인 후, 아가로스겔을 이용한 전기영동 진행 후 타겟 밴드를 분리하였다. 분리한 아가로스겔은 Gel-Purification Kit(Bioneer)를 이용하여 분리/정제 한 후 염기서열 분석을 진행하였다. 염기서열 분석은 염기서열 분석업체(Bioneer)에서 진행 하였으며, 길이가 짧은 염기서열의 경우 정확도를 향상시키기위하여 Cloning단계를 거친 후 염기서열 분석을 진행 하였다. 분석이 완료된 염기서열 중 Primer 인접한 부위에서 SCAR marker 위치를 선정하였으며, Primer-Blast(NCBI)에서 Tm 값 및 self complementarity 여부 등과 다른 종의 유전자와의 결합유무를 확인한 후 결과를 토대로 프라이머를 제작하였다. 본 발명에서 개발한 프라이머 정보 상기 표 1과 같다.
[실시예 3] 다중 PCR을 통한 유전자 증폭 및 결과 확인
[실시예 3-1] PCR 수행
AccuPower PCR Premix (BIONEER, Korea)을 사용하여 PCR을 수행하였으며, 유전자 증폭 반응액 조성(표3)과 국산 작약과, 중국산 작약에 최적화된 반응조건(각 표4 및 표 5)은 아래와 같다.
| 성분 | 농도 |
| DNA polymerase | 1.0U |
| dNTPs | 250μM |
| 프라이머 | 중국산 작약/국산 작약 각 1 μM |
| 주형 DNA | 50ng |
| 멸균 증류수 | 잔량 |
| 총 합 | 20㎕ |
| 구분 | 온도 | 시간 | 반복 수 |
| 초기변성(Initial denaturation) | 95℃ | 5분 | 1회 |
| 변성(denaturation) 결합(annealing) 신장(extension) |
95℃ 45℃ 72℃ |
30초 20초 30초 |
35회 |
| 최종신장(elongation) | 72℃ | 5분 | 1회 |
| 보존 | 4℃ | - | - |
| 구분 | 온도 | 시간 | 반복 수 |
| 초기변성(Initial denaturation) | 95℃ | 5분 | 1회 |
| 변성(denaturation) 결합(annealing) 신장(extension) |
95℃ 50℃ 72℃ |
30초 10초 15초 |
30회 |
| 최종신장(elongation) | 72℃ | 5분 | 1회 |
| 보존 | 4℃ | - | - |
[실시예 3-2] PCR 결과 확인
유전자 증폭(PCR) 후에 결과 확인을 위해 본 발명에서는 최종 농도 1.5~2%의 아가로스를 칭량하여 전기영동 TAE (Tris-acetate/EDTA) 완충액을 넣고 가열함으로서 아가로스를 녹여 사용하였다.
전기영동의 경우 PCR 증폭산물에 염색액(gel loading buffer)을 혼합 후 겔의 각 홈에 시료를 넣으며, 양끝의 각 홈에는 PCR 증폭 산물의 크기를 식별하기에 적당한 표식 DNA (Marker DNA, 100bp DNA Ladder(Bioneer))을 넣고, 전압 100 V로 25~30분 진행 후 전기영동을 멈추고 화상분석기 등을 이용하여 전기영동 결과를 확인하였다.
그 결과, 국산 작약에서는 500bp, 중국산 작약에서는 400bp의 증폭산물을 확인 할 수 있었다(도 1 및 2). 이를 이용하여, 작약의 원산지가 국산인지 또는 중국산인지 여부를 판정할 수 있을 뿐만 아니라, 국산 작약과 중국산 작약이 혼합되어 있는지 여부도 판단할 수 있다.
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CPLR(primer for detecting Chinese PL-Reverse)
<400> 4
gtcaattcgt acgctgg 17
Claims (11)
- 작약의 원산지 판별용 프라이머 세트로서,
상기 세트는, 국산 작약 판별을 위한 것이고,
상기 세트는,
서열번호 1의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드, 또는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드; 및
서열번호 2의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드, 또는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 작약의 원산지 판별용 프라이머 세트. - 작약의 원산지 판별용 프라이머 세트로서,
상기 세트는, 중국산 작약 판별을 위한 것이고,
상기 세트는,
서열번호 3의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드, 또는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드; 및
서열번호 4의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드, 또는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 작약의 원산지 판별용 프라이머 세트. - 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드, 및 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드는, 정방향 프라이머이고,
상기 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드, 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드는, 역방향 프라이머인, 작약의 원산지 판별용 프라이머 세트. - 제2항에 있어서,
상기 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드, 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드는, 정방향 프라이머이고,
상기 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드, 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드는, 역방향 프라이머인, 작약의 원산지 판별용 프라이머 세트. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 작약은, Paeonia lactiflora인, 작약의 원산지 판별용 프라이머 세트. - 제1항, 제2항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는, 작약의 원산지 판별용 키트.
- 작약의 원산지 판별 방법으로서,
상기 방법은 작약의 원산지가 중국산인지 또는 국산인지 여부를 판별하기 위한 것이고,
상기 방법은, 작약으로부터 DNA를 추출하는 단계;
상기 추출된 DNA를 주형으로 하고, 제1항, 제2항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항의 작약의 원산지 판별용 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하는 단계;
상기 PCR의 증폭 산물을 전기영동하는 단계; 및
상기 전기영동된 증폭 산물의 크기를 측정하여 작약의 원산지를 판별하는 단계를 포함하는, 작약의 원산지 판별 방법. - 제9항에 있어서,
상기 작약의 원산지를 판별하는 단계는,
PCR의 증폭 산물의 크기가 480~520 bp인 경우 한국산 작약으로 판단하고, 380~420bp인 경우 중국산 작약으로 판단하는 것을 포함하는, 작약의 원산지 판별 방법. - 제9항에 있어서,
상기 PCR은 하기 중 하나 이상의 조건을 포함하는, 작약의 원산지 판별 방법:
90~100℃에서 3~7분 동안 초기 변성(initial denaturation);
90~100℃에서 25~35초간 변성(denaturation);
40~55℃에서 5~30초간 결합(annealing);
70~75℃에서 10~35초간 신장(extension); 및
70~75℃에서 3~7분간 최종신장(elongation).
Applications Claiming Priority (2)
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2018
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