KR20090130606A - 녹차 품종 분석용 프라이머 및 이를 이용하여 녹차 품종을식별하는 방법 - Google Patents

녹차 품종 분석용 프라이머 및 이를 이용하여 녹차 품종을식별하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20090130606A
KR20090130606A KR1020080056314A KR20080056314A KR20090130606A KR 20090130606 A KR20090130606 A KR 20090130606A KR 1020080056314 A KR1020080056314 A KR 1020080056314A KR 20080056314 A KR20080056314 A KR 20080056314A KR 20090130606 A KR20090130606 A KR 20090130606A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
green tea
seq
primer set
nos
primer
Prior art date
Application number
KR1020080056314A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101114310B1 (ko
Inventor
김경태
정강원
김종철
조규형
조아르나
윤호성
이은진
김루미
Original Assignee
재단법인 하동녹차연구소
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 재단법인 하동녹차연구소 filed Critical 재단법인 하동녹차연구소
Priority to KR1020080056314A priority Critical patent/KR101114310B1/ko
Publication of KR20090130606A publication Critical patent/KR20090130606A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101114310B1 publication Critical patent/KR101114310B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 5S rRNA NTS의 염기서열을 분석하고 페닐알라닌 암모니아 리게이즈, 찰콘 신쎄이즈 및 디하이드로플라보놀 4-리덕테이즈의 CAPS 패턴을 분석하는 방법으로 녹차 품종을 간단하고 고효율적으로 식별하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 분석에 사용되는 프라이머 세트 및 이를 포함하는 분석용 키트를 제공한다.
녹차품종식별, 분자마커, 하동야생차, 프라이머세트, 5S rRNA NTS 염기서열, CAPS 마커세트, PCR

Description

녹차 품종 분석용 프라이머 및 이를 이용하여 녹차 품종을 식별하는 방법 {Primers for identifying of green tea species and specific-identification methods of green tea species using the primers}
본 발명은 녹차 품종 분석용 프라이머 세트, 이를 포함하는 분석용 키트 및 상기 프라이머 세트들을 이용하여 녹차 품종을 정확, 간단 및 고효율적으로 식별하는 방법에 관한 것이다.
녹차는 차나무 (Camellia sinensis L. O Kuntze)의 어린 잎을 따서 만든 음료로서, 아시아 뿐 만 아니라 세계적으로 애용되는 기호음료이다. 차는 아시아 기원으로 주로 전통적인 녹차에 사용되는 잎이 작은 중국계 (Camellia sinensis L. var. sinesis)와 발효차에 주로 사용되는 잎이 크고 넓은 아삼계 (Camellia sinensis L. var. assamica)로 나뉜다. 주로 차는 인도, 중국, 스리랑카, 케냐, 일본에서 재배되며, 최근에는 우리나라에서의 재배도 점점 확대되고 있는 추세이다.
우리나라에 차가 전래된 시기는 신라 선덕여왕 때인 7세기로 추정되며, 직접 재배하게 된것은 828년 사신 대렴이 당나라에서 중국산 소엽종 종자를 가져와 지리산 일대에 심으면서부터로 추정된다. 한편, 일본의 경우에도 중국으로부터 비슷한 시기에 차 종자를 가져와 재배를 하기 시작하였다. 우리나라에서 야생으로 자생하고 있는 차나무가 언제 어디에서 전래되었는가에 대해서는 아직까지 명확하게 밝혀지고 있지 않다. 특히, 우리나라에서 가장 많이 재배되고 있는 품종인 야부키타(數北)는 중국으로부터의 도입종을 일본에서 육종한 재래품종으로 우리나라에서는 1927년부터 녹차 품종으로 본격적으로 재배하기 시작하여, 현재에도 국내 여러 곳에서 주 품종으로 재배되고 있다.
국내에서 최근에 차음료가 다양해지면서 녹차의 품종에 대한 관심이 높아지고 있다. 특히, 국산야생녹차의 우수성이 제기되면서 이와 다른 품종간의 구별을 할 수 있는 방법의 필요성이 대두되었다.
그러나, 다른 재배작물의 품종처럼 녹차의 경우에도 주요 국가에서 오랜기간 동안 같은 종 (species)안에서 농업적인 형질만의 선별과 고전 형태적인 형질들을 위주로만 육종이 이루어져 왔기 때문에, 유전자의 다형성화는 많이 결여되어 있다. 따라서 재래의 형태형질 및 몇몇 유전자 마커로만으로는 녹차 품종간의 구별이 거의 불가능하다. 최근에 차나무에 있어서 유전적 연관성을 나타내는 RAPD (randomly amplified polymorphic dna) 및 RFLP (restriction fragment length polymorphism) 마커들이 조금씩 알려지고 있으나 체계적인 분류체계는 확립되어 있지 않은 실정이다. 더구나, 야생녹차의 경우에는 마커 및 구별 방법에 대한 연구가 지금까지 거 의 진행된 바 없기 때문에 이들의 구별은 더 힘들다.
그러므로 국산야생녹차와 더불어 국산녹차재배품종과 일본의 개량품종, 및 중국품종 등을 분별할 수 있는 분자수준의 특이적인 표지인자의 개발이 절실히 요구된다. 특히, 최근에는 수입이 늘어난 중국산 녹차로부터의 국내우수품종의 보호차원에서도 이들과도 구별할 수 있는 방법의 개발이 필수적이다. 이는 녹차 품종간의 구별뿐만 아니라 녹차 품종의 효과적인 육종을 위해서도 필요하다.
이에 본 발명은 녹차 품종을 간편하고 효과적으로 구별하기 위하여, 하동지방에서 자생하는 야생차, 국내 재배 품종, 그리고 일본 품종 간에 유전적 차이를 보이는 유전자를 발굴하고, 상기 유전자를 분자 마커로 이용하여 녹차 품종을 효율적으로 식별할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 5S rRNA NTS, 페닐알라닌 암모니아 리게이즈, 찰콘 신쎄이즈 및 디하이드로플라보놀 4-리덕테이즈의 염기 서열에서 녹차 품종간에 유의한 차이가 나타나는 것을 확인하고, 상기 유전자에서의 이런 차이를 이용하여, 녹차 품종을 식별하였다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 5S rRNA NTS, 페닐알라닌 암모니아 리게이즈, 찰콘 신쎄이즈 및 디하이드로플라보놀 4-리덕테이즈에 대하여 상보적인 10 내지 30개의 연속 염기 서열을 가지는 정방향과 역방향 프라이머를 포함하는, 녹차 품종 분석용 프라이머 세트에 관한 것이다.
동종 (same species)안에서 품종간의 구별을 위해서는 품종만이 가지고 있는 특이적 유전자 서열과 이를 활용한 분자수준의 식별 마커가 최근 많이 활용되고 있으나, 녹차 품종간의 구별에 관한 방법이 거의 개발되지 않았다. 본 발명에서는 5S rRNA NTS 유전자의 서열이 녹차 품종 간에 상이함을 밝히고, 상기 유전자 서열을 비교분석하는 방법으로 녹차 품종을 효과적으로 식별할 수 있음을 또한 밝혔다. 또한, 녹차의 페닐프로파노이드 (phenylpropanoid) 생합성 과정에 중요한 역할을 하고 향기와 맛에 영향을 주는 페닐알라닌 암모니아 리게이즈 (henylalanine ammonia lygase: PAL), 찰콘 신쎄이즈 (Chalcone synthase : CHS)와 디하이드로플라보놀 4-리덕테이즈 (Dihydroflavonol 4-reductase : DFR)를 녹차 품종 구별을 위한 CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence) 마커 (Kaundum and Matsumoto, Theor. Appl.Genet. 2003, 106;375-383)로 이용할 수 있음을 밝혔다.
따라서, 본 발명은 시료내에서 상기 마커 유전자의 분석을 위한 특이적 표적 증폭에 이용되는 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에서, 용어 "프라이머"란 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성 할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 염기 서열을 의미하고, 보통, 7 내지 50, 보다 바람직하게는 10 내지 30개의 염기서열을 가진다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약과 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
구체적으로, 5S rRNA NTS에 특이적인 서열번호 1과 2의 염기 서열을 가지는 프라이머 세트를 제공한다. 또한, PAL에 특이적인 서열번호 3과 4, 서열번호 5와 6 및 서열번호 7과 8의 프라이머 세트, CHS에 특이적인 서열번호 9과 10의 프라이머 세트, 및 DFR에 특이적인 서열번호 11과 12 및 서열번호 13과 14의 염기 서열을 가지는 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트법, 포스포디 에스테르법, 디에틸포스모르아미다이트법 등을 이용하는 화학 합성법을 통하여 제조할 수 있다. 또한, 프라이머 염기 서열은 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 녹차 품종 분석용 프라이머 세트를 포함하는 녹차 품종 분석용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 검출용 키트는 염기 증폭에 사용되는 키트로, 상기 프라이머 세트외에도 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다. 본 발명의 키트는 검출 프라이머를 포함하는 용기, 증폭반응 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), dNTPs, 프라이머 연장 반응에 사용되는 주형-의존적인 효소 (예를 들어, 이.콜라이 DNA 폴리머라제 Ⅰ, 클레나우(Klenow) 단편, T4 DNA 폴리머라제, T7 DNA 폴리머라제, Taq DNA 폴리머라제, Pfu DNA 폴리머라제, Pwo DNA 폴리머라제, Tth DNA 폴리머라제), RNAse, 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 키트는 양성 및 음성 대조군을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 CAPS 분석에 사용되는 성분, 예를 들어, 1 종 이상의 제한효소와 반응 완충액 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 프라이머 세트를 이용하여, 녹차 품종을 효과적으로 식별할 수 있다.
하나의 구체적인 양태로서, 본 발명은 녹차 시료를 5S rRNA NTS에 대하여 상보적인 10 내지 30개의 연속 염기 서열을 가지는 프라이머 세트를 이용하여 PCR 수행하여 증폭한 후 염기서열 분석하는 단계를 포함하는, 녹차 품종을 식별하는 방법에 관한 것이다.
녹차 품종 간에 5S rRNA NTS 염기서열은 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이 확연한 차이가 나므로, 5S rRNA NTS 염기서열 분석으로 품종을 확실하게 구별할 수 있다. 염기서열 분석은 당분야에서 알려진 일반적 방법으로 수행할 수 있다.
또 다른 구체적인 양태로서, 본 발명은 녹차 시료를 페닐알라닌 암모니아 리게이즈, 찰콘 신쎄이즈 및 디하이드로플라보놀 4-리덕테이즈에서 1 이상 선택되는 유전자에 대하여 상보적인 10 내지 30개의 연속 염기 서열을 가지는 프라이머 세트를 이용하여 PCR 수행하여 증폭한 후 제한효소를 처리하는 단계를 포함하는, 녹차 품종을 식별하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 모니아 리게이즈, 찰콘 신쎄이즈 및 디하이드로플라보놀 4-리덕테이즈의 모든 유전자에 대하여 CAPS 분석을 하는 것이다. 상기의 CAPS 마커들의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응으로 각각 증폭된 산물을 Hind III, Dde I, Taq I, BamHI, BspH I, Hpa II 등의 제한효소로 처리한 후 이들 단편을 겔 전기영동 장치를 이용하여 분리하였을 때 나타난 밴드 패턴을 분석함으로써, 녹차 품종을 구별할 수 있다. 12개 품종의 구별 패턴은 표 4와 같다.
상기에서 설명한 바와 같이 본 발명은 5S rRNA NTS의 염기서열 분석하거나, 페닐알라닌 암모니아 리게이즈, 찰콘 신쎄이즈 및 디하이드로플라보놀 4-리덕테이즈를 CAPS 분석하였을 때 품종간에 나타나는 확연한 차이로 인하여, 국내 야생녹차, 국내 재배녹차 및 일본품종을 간단하고 효율적으로 품종을 구분할 수 있었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 국한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식 을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1. 녹차 품종에서의 DNA 추출 및 PCR 반응>
표 1에 기재된 하동야생차, 하동재배녹차 품종, 일본녹차 품종의 12 품종의 어린잎을 채취하여 -20℃에 보관한 후 잎 조직이 높지 않도록 액체질소로 냉각하면서 막자사발에 넣고 곱게 간 분말 1 ㎖을 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)를 이용하여 추출하였다.
품종 특이적 CAPS 마커 개발을 위하여 검정에 사용한 국내외 녹차 12품종
List of the various commercial tea cultivars and wildtype - green teas used in the development of CAPS marker set specific to green tea
Serial No. Name of the cultivar type
1. Hadong Cheon-nyeon tea 2. Hadong Sibaeji tea 3. Hadong Cultivar1 4. Hadong Wild tea1 5. Hadong Wild tea2 6. Hadong Wild tea2 7. Ujimidori 8. Kyomidori 9. Yabukita 10. Gokou 11. Komakage 12. Okumidori
이들을 아가로스겔 (Agarose gel) 전기영동하여 추출한 녹차 DNA의 양을 결정하였고 이를 바탕으로 PCR 반응을 위해 각 품종별로 20 ng/㎕의 DNA 스탁을 만들었다. PCR 증폭을 위하여 각 품종별 DNA를 2-5㎕ (40-100ng)을 각각의 0.5 μM 농도의 프라이머와, 200 μM 농도의 dNTP mixture 및 1 x ExTaq buffer와 0.5 units의 ExTaq polymerase (Takara,Japan)를 잘 썩은 후 전체의 반응액을 25㎕로 하였다. PCR 반응은 94℃에서 5분간 가열하여 DNA를 변성시킨 다음, 94℃에서 30초, 60℃에서 1분, 그리고 72℃에서 1분30초간 35회 반복 수행한 후, 72℃에서 10분간 최종 반응하였다. 그리고 0.8% 아가로스 겔(agarose gel)에서 100 볼트(volts)로 30분 동안 전기영동하였다 (데이터미제시). PCR 반응에는 상기한 바 있는 5S rRNA NTS 특이적 프라이머 세트와 페닐프로파노이드 생합성 과정의 PAL, CHS와 DFR의 유전자 특이적 CAPS 프라이머 세트를 사용하였다 (표 2).
품종 특이적 서열 분석을 위하여 활용된 5S rRNA NTS 유전자 및 CAPS 마커 개발에 활용된 페닐프로파노이드 (phenylpropanoid) 생합성 유전자 특이적 프라이머 세트
Amplified Regions Primers Restriction Enzymes
5S rRNA NTS 5’-GGATCCCATCAGAACTCC-3 (서열번호 1) 5’-GGTGCTTTAGTGCTGGTAT-3’ (서열번호 2)
PAL exon 5’-TCCATCAATCTATACACCTACCTG-3’(서열번호 3) Hpa II 5’-CCTTCTTTGGTCCTCCTATGTGA-3’ (서열번호 4) PAL intron 5’-CACATAGGAGGACCAAAGAAGG-3’ (서열번호 5) Dde I 5’-GGCAATGGTAAGATAGGGGGACT-3’ (서열번호 6) PAL exon 5’-AGTCCCCCTATCTTACATTGCC-3’ (서열번호 7) Taq I 5’-ATAGAAGAAACCAAGCCGGAAC-3’ (서열번호 8) CHS exon 5’-AAACCCAAATGTGTGTGCCTAC-3’ (서열번호 9) BspH I, Rsa I 5’-AGGATAAACAACACACAAGCGC-3’ (서열번호 10) DFR intron-1 5’-CCAGGAACACCAACAACCCGT-3’ (서열번호 11) Hind III 5’-CCATGCTGCTTTCTCTGCCAA-3’ (서열번호 12) DFR intron-2 5’-AACATTCCCACCAAGCCTAATC-3’ (서열번호 13) Hpa II 5’-ATGAGAACGACACAACTGGCAA-3’ (서열번호 14)
단일절편으로 확인된 이들 PCR 산물은 각각 5S rRNA NTS의 염기서열 분석 및 CAPS 방법을 통한 특이적 유전자 패턴의 분석에 사용하었다.
<실시예 2. 녹차 품종에서의 5S rRNA NTS의 특이적 염기서열 분석>
상기와 같이 PCR 반응 산물에 대해 염기서열분석(sequencing)을 실시한 후 GENETIX (Hitachi, Japan)등의 소프트웨어를 사용하여 염기서열을 분석하였다. 프라이머를 제외한 NTS 특이적 염기서열은 각각의 녹차 품종에서 184bp에서 199bp까지의 길이를 나타내었다. 이들 유전자 염기서열을 CLUSTAL 프로그램을 이용하여서 각각의 상동성을 나타내는 부분과 특이적인 염기서열을 나타내는 부분으로 구분을 하였다. 비교를 위하여 사용된 녹차의 7종류의 녹차 품종은 하동천년차 (Hadong Cheon-nyeon tea), 하동야생차 (Hadong wild tea), 하동재배녹차 (Hadong cultivar), 하동시배지차 (Hadong sibaeji tea), 일본녹차 품종 야부키타 (數北, Yabukita), 우지(宇治)재래품종 고코우(Gokou), 그리고 일본개량녹차 품종 오쿠미도리 (Okumidori) 로서 표 3에 나타내었다. 품종간의 식별에 사용할 수 있는 5S rRNA NTS의 특이적 염기서열은 도 1에 상세히 나타내었다.
품종 특이적 5S rRNA NTS 유전자 서열 분석에 사용된 녹차 품종
List of the various wildtype-green tea and commercial tea cultivars used in analysis of species-specific sequences of 5S rRNA NTS region
Serial No. Name of the cultivar type
1. Hadong Cheon-nyeon tea 2. Hadong Wild tea 3. Hadong Cultivar 4. Hadong Sibaeji tea 5. Yabukita 6. Gokou 7. Okumidori
< 실시예 3. 녹차 품종에서의 CAPS 프라이머세트를 이용한 특이적 염기서열 분석 방법의 개발>
상기에서와 같이 각각의 PAL, CHS와 DFR 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 생성된 PCR산물은 각각 497bp에서 1818bp의 크기로 단일절편으로 증폭됨이 확인되었다 (데이터 미제시). 이들을 표 4에 나타낸 Hind III, Dde I, Taq I, BamHI, BspH I, Hpa I, Hpa II의 제한효소 (Takara, Japan)로 37℃에서 60분간 제작자 프로토콜 (manufacture's instruction)에 따라서 처리한 후 이들 단편을 2.5% 아가로스겔에서 100 볼트(volts)로 50분 동안 전기영동하여 밴드를 분리한 후 나타난 밴드 패턴을 분석하였다 (도 2). 이 방법의 특징은 3종류의 유전자좌위에서 4가지의 특이적 유전자 서열을 CAPS 마커를 사용하여 증폭한 뒤 제한효소로 절단한 패턴을 각각 4가지부터 5가지 종류로 분류할 수 있는데 이들을 조합하면 46 X 5 = 20480가지의 고유의 패턴을 분석할 수 있는데 있다. 분석에 사용한 12가지 녹차 품종은 각각 고유의 다른 패턴을 가지고 있는 것이 판명되어, 본 발명에 의한 방법이 녹차 품종간의 식별에 아주 효과적이라는 것을 알 수 있다.
표 4에 나타난 바와 같이 국내품종 및 일본품종의 모든 품종이 각각의 마커에 대해 특이적인 패턴을 보이고 있다. 특히, 하동야생차는 하동재배품종과는 특이한 식별 패터을 보이고 있다. 그리고, 하동천년차는 PAL유전자에서 다른 품종들과는 다른 상동유전자 패턴을 보이고 있다. 따라서, 다른 국내품종 뿐 만 아니라, 일본품종들과는 특이한 PAL유전자 패턴을 보이고 있다는 새로운 사실이 본 발명에서 판명되었다. 또한, 하동재배녹차 품종에 있어서도 다른 품종들과는 특이한 식별 패턴을 나타내었다
품종 특이적 CAPS 마커를 이용한 12 국내외 녹차 품종의 유전자 패턴 분석 결과
Pattern of genotype CAPS Markers
Pex /H Pint /D Pex /T Cex /B Cex /R Dint -1/H Dint -2/H
Cheon-nyeon tea BB A 1 A 1 AA BB AB AB AB Gokou AB A 1 B AA AA BB AB AB Hadong Sibaeji tea AB A 1 B AB AB AB AB AB Hadong tea cultivar1 AB A 1 B AB BB AB AA AB Hadong wild tea1 AB A 1 B AA AB BB AA BB Hadong wild tea2 AB A 1 B AB AB BB AA BB Hadong wild tea3 BB A 1 A 1 BB BB BB AB AB Komakage AA A 1 A 1 AA AB BB AB BB Kyomidori AA A 1 B AA AB BB AB BB Okumidori BB A 1 A 2 BB BB AA AB AB Ujimidori AA BB AB AB AB AB AB Yabukita AB A 2 A 2 BB AB AB BB BB
본 발명의 5S rRNA NTS의 특이적 염기서열 분석 방법과 CAPS 마커들을 이용한 분석으로 하동야생녹차, 국내 재배품종 및 일본품종을 정확, 간단하면서도 효과적으로 식별할 수 있으므로 녹차산업 및 녹차육성에 유용하게 사용될 수 있고, 국산녹차 품종의 보호와 녹차나무의 계통분류에도 적용할 수 있다
도 1은 녹차 품종별 특이적 5S rRNA NTS 염기서열을 나타내는 그림이다. 화살표는 5S rRNA NTS 부분을 특이적으로 증폭시키는데 필요한 프라이머를 나타내고 있다. 하동야생차 및 일본품종이 특이적으로 가지고 있는 200bp 길이의 염기서열을 표시하였고, 중간에 같은 염기서열을 가지는 영역은 생략하였다.
도 2는 국내외 녹차 품종 12가지에 대하여 CAPS 마커세트로 PCR 수행 후, 제한효소 절단한 산물의 전기영동 결과를 나타내는 결과이다. 전기영동의 열 번호 (1-12)는 표 3의 녹차 품종을 나타내고 있다. 그리고, 사용한 CAPS 마커에 대한 결과는 PALexon/Hpa II(A), PALintron/Dde I(B), PALexon/Taq I(C), CHSexon/BspH I(D), CHSexon/Rsa I(E), DFRintron-1/Hind III(F), DFRintron-2/Hpa II(G)에 나타내었다.
<110> Institute of Hadong Green Tea <120> primers for identifying of green tea species and specific-identificatin methods of green tea species using the primers <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer1 for 5S rRNA NTS <400> 1 ggatcccatc agaactcc 18 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer2 for 5S rRNA NTS <400> 2 ggtgctttag tgctggtat 19 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer1 for PAL exon <400> 3 tccatcaatc tatacaccta cctg 24 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer2 for PAL exon <400> 4 ccttctttgg tcctcctatg tga 23 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer1 for PAL intron <400> 5 cacataggag gaccaaagaa gg 22 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer2 for PAL intron <400> 6 ggcaatggta agataggggg act 23 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer1 for PAL exon <400> 7 agtcccccta tcttacattg cc 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer2 for PAL exon <400> 8 atagaagaaa ccaagccgga ac 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer1 for CHS exon <400> 9 aaacccaaat gtgtgtgcct ac 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer2 for CHS exon <400> 10 aggataaaca acacacaagc gc 22 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer1 for DFR intron-1 <400> 11 ccaggaacac caacaacccg t 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer2 for DFR intron-1 <400> 12 ccatgctgct ttctctgcca a 21 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer1 for DFR intron-2 <400> 13 aacattccca ccaagcctaa tc 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer2 for DFR intron-2 <400> 14 atgagaacga cacaactggc aa 22

Claims (12)

  1. 5S rRNA NTS에 대하여 상보적인 10 내지 30개의 연속 염기 서열을 가지는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함하는, 녹차 품종 분석용 프라이머 세트.
  2. 제 1항에 있어서, 프라이머 세트는 서열번호 1과 2의 염기 서열을 가지는 것인, 녹차 품종 분석용 프라이머 세트.
  3. 페닐알라닌 암모니아 리게이즈, 찰콘 신쎄이즈 및 디하이드로플라보놀 4-리덕테이즈에서 1 내지 3개 선택되는 유전자에 대하여 상보적인 10 내지 30개의 연속 염기 서열을 가지는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함하는, 녹차 품종 분석용 프라이머 세트.
  4. 제 3항에 있어서, 페닐알라닌 암모니아 리게이즈에 특이적인 프라이머 세트는 서열번호 3과 4, 서열번호 5와 6, 서열번호 7과 8의 염기 서열을 가지는 프라이머 세트중에서 선택되고, 찰콘 신쎄이즈에 특이적인 프라이머 세트는 서열번호 9와 10의 염기 서열을 가지고, 디하이드로플라보놀 4-리덕테이즈에 특이적인 프라이머 세트는 서열번호 11과 12 및 서열번호 13과 14의 염기 서열을 가지는 프라이머 세트중에서 선택되는, 녹차 품종 분석용 프라이머 세트.
  5. 제 1항의 녹차 품종 분석용 프라이머 세트를 포함하는 녹차 품종 분석용 키트.
  6. 제 5항에 있어서, 프라이머 세트는 서열번호 1과 2의 염기 서열을 가지는 키트.
  7. 제 3항의 녹차 품종 분석용 프라이머 세트를 포함하는 녹차 품종 분석용 키트.
  8. 제 7항에 있어서, 프라이머 세트는 서열번호 3과 4, 서열번호 5와 6, 서열번호 7과 8, 서열번호 9와 10, 서열번호 11과 12 및 서열번호 13과 14로 기재된 염기 서열을 가지는 프라이머 세트중에서 1 내지 6개 선택되는 것인 키트.
  9. 녹차 시료를 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 증폭한 후, 염기서열 분석하는 단계를 포함하는, 녹차 품종을 식별하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 프라이머 세트는 서열번호 1과 2의 염기 서열을 가지는 것인 방법.
  11. 녹차 시료를 제 3항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 증폭한 후 제한효소를 처리하는 단계를 포함하는, 녹차 품종을 식별하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 3과 4, 서열번호 5와 6, 서열번호 7과 8, 서열번호 9와 10, 서열번호 11과 12, 또는 서열번호 13과 14의 염기 서열을 가지는 프라이머 세트를 포함하는 것인 방법.
KR1020080056314A 2008-06-16 2008-06-16 녹차 품종 분석용 프라이머 및 이를 이용하여 녹차 품종을식별하는 방법 KR101114310B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020080056314A KR101114310B1 (ko) 2008-06-16 2008-06-16 녹차 품종 분석용 프라이머 및 이를 이용하여 녹차 품종을식별하는 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020080056314A KR101114310B1 (ko) 2008-06-16 2008-06-16 녹차 품종 분석용 프라이머 및 이를 이용하여 녹차 품종을식별하는 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090130606A true KR20090130606A (ko) 2009-12-24
KR101114310B1 KR101114310B1 (ko) 2012-02-14

Family

ID=41690029

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020080056314A KR101114310B1 (ko) 2008-06-16 2008-06-16 녹차 품종 분석용 프라이머 및 이를 이용하여 녹차 품종을식별하는 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101114310B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102776271A (zh) * 2011-05-13 2012-11-14 刘本英 一种鉴定茶树无性系品种的分子标记方法
KR20150101146A (ko) * 2014-02-26 2015-09-03 안동대학교 산학협력단 도라지 분류용 프라이머 세트, 그를 이용한 도라지 분류방법, 및 그를 이용한 도라지 분류키트

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102265821B1 (ko) 2019-12-17 2021-06-15 전남대학교산학협력단 Lc-ms를 이용한 차나무 품종 및 찻잎 채취시기 판별방법 및 그 조성물

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102776271A (zh) * 2011-05-13 2012-11-14 刘本英 一种鉴定茶树无性系品种的分子标记方法
KR20150101146A (ko) * 2014-02-26 2015-09-03 안동대학교 산학협력단 도라지 분류용 프라이머 세트, 그를 이용한 도라지 분류방법, 및 그를 이용한 도라지 분류키트

Also Published As

Publication number Publication date
KR101114310B1 (ko) 2012-02-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101382409B1 (ko) 포도의 품종 판별용 스카 마커 및 이의 용도
KR101114310B1 (ko) 녹차 품종 분석용 프라이머 및 이를 이용하여 녹차 품종을식별하는 방법
KR101382406B1 (ko) 포도 품종 판별용 scar 프라이머 세트 및 이를 이용한 포도 품종 판별 방법
KR101748366B1 (ko) 토마토 잎곰팡이병 저항성 선별용 분자마커 및 그를 이용한 선별방법
KR101955074B1 (ko) 무 판별용 snp 마커
KR102121145B1 (ko) 표고버섯 배지 갈변 관련 유전자 abl과 abl 유전자의 변이를 구별하는 caps 마커 및 이의 용도
KR102299594B1 (ko) 표고버섯 품종 산백향을 구분할 수 있는 caps 마커 및 이의 용도
KR101802585B1 (ko) 향미 품종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도
EP0785281B1 (en) Genetic variety identifying method in hop
KR102077963B1 (ko) 향미 품종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도
KR102001786B1 (ko) 향미 품종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도
KR101855984B1 (ko) 단일염기다형성을 이용한 꾸지뽕 계통 판별용 마커 조성물, 및 이를 이용한 꾸지뽕 계통 및 교잡종 판별 방법
AU2012326092B2 (en) Materials and methods for detecting the aryloxyalkanoate dioxygenase gene (AAD-12) in plants
CN113943826B (zh) 与番茄抗颈腐根腐病基因Frl紧密连锁的分子标记及其应用
KR101914275B1 (ko) 향미 품종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도
CN102066576A (zh) 用于鉴别巴西橡胶树品种的方法和巴西橡胶树品种鉴别用试剂盒
KR101122109B1 (ko) 오이 내냉성 연관 유전자형 분석용 프라이머
KR20220141541A (ko) 표고버섯 품종 중 산조701호 또는 참아람 판별용 snp 마커 조성물 및 이의 용도
KR101122110B1 (ko) 오이 내냉성 연관 유전자형 분석용 프라이머
KR20230168683A (ko) 뿌리이상비대병 병원성 균주 검출을 위한 조성물
KR20220087095A (ko) 토마토 풋마름병 저항성 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 토마토 풋마름병 저항성 판별 방법
JP2011130741A (ja) ユーカリ属の種間雑種の樹種識別法
JP2010161951A (ja) パラゴムノキの品種判別方法及びパラゴムノキの品種判別用キット
JP2006050912A (ja) ユーカリ・グロブラス由来の新規ｄｎａおよびそれらを利用したユーカリ・グロブラスの個体識別方法
JP2009189253A (ja) パラゴムノキの品種判別方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
J201 Request for trial against refusal decision
B701 Decision to grant
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20141126

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151119

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161201

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171116

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181120

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200304

Year of fee payment: 9