CN102776271A - 一种鉴定茶树无性系品种的分子标记方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种鉴定茶树无性系品种的分子标记方法，属生物技术领域。包括以下步骤：将待测品种的1.0g鲜嫩芽叶放入研钵，加入液氮研磨至粉末状，加入CTAB缓冲液，1)65℃水浴30-60分钟，再加入DNA提取液，得到待测茶树品种的基因组DNA；2)以步骤1)提取的基因组DNA为模板，用SSR引物进行PCR扩增，将扩增产物进行10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到待测品种的电泳图谱；3)将待测品种的电泳图谱与按照所述步骤1)和2)的方法得到的标准茶树品种的电泳图谱进行比较，如待检品种与标准品种的谱带组成一致，则待测品种与标准品种为同一品种，得出待测品种纯度。本发明与其他方法相比，更能真实反映茶树品种的遗传背景和亲缘关系。该技术可作为鉴定茶树品种真伪的科学依据。

Description

一种鉴定茶树无性系品种的分子标记方法

技术领域：

本发明属于生物技术领域，涉及一种鉴定农作物品种纯度的方法，特别涉及一种鉴定茶树无性系品种纯度的分子标记方法。

背景技术：

茶叶是云南传统支柱产业之一，也是山区农民经济收入的重要来源。随着名优茶生产的发展，各地积极推进茶园良种化进程，经过多年努力，云南省无性系良种茶园面积已超过160万亩，良种化率达到30％。按照云南省委省政府每年发展无性系良种茶园面积10万亩的规划，年需良种苗木3亿株(每亩3000株)。同时，随着良种茶园的扩大，又大大促进了名优茶的发展，为茶农增收起到了巨大的作用。良种与名茶，相得益彰。统计还表明，无性系良种与当地群体种比较，其收益要高出1-3倍。因此，今后云南省对良种的需求将更加迫切。

茶树是多年生作物，良种一经应用，收益将是长期的。可是选育一个新品种需要十多年艰苦和细致的工作。由于技术条件的限制，以往品种种性真实性鉴定依据主要是形态特征和生化成分，因其易受环境条件、栽培措施和发育阶段的影响，可靠性不强。由于缺乏有效的品种鉴别手段，在良种推广过程中，出现品种假冒或有争议时难以进行有效的监督和仲裁。为了使云南省茶园良种化进程健康地发展，切实保护好新品种知识产权，迫切需要建立稳定可靠的茶树无性系品种鉴别方法和检验技术规程。

现已表明分子标记技术是进行作物品种鉴别的最有效手段(王忠华.DNA指纹图谱技术及其在作物品种资源中的应用[J].分子植物育种，2006，4(3)：425-430.)。这项技术的特点是：可反映不同品种基因组水平上的变异；不受环境条件变化的影响；具有遗传稳定性；多态性好等等。目前，已有多种分子标记技术在茶树品种鉴别研究上应用，并显示出很好的实用性。而与其他分子标记相比，SSR(Simple Sequence Repeat)标记技术具有多态性高、共显性、通用性好、开发快速、费用低等诸多优点，已在多种农作物遗传连锁图谱构建、遗传多样性研究、标记和定位基因以及分子标记辅助选择等方面得到应用，并发挥着越来越重要的作用。特别在茶树上，已经在茶树遗传多样性、亲缘关系、分子指纹图谱等方面开展了应用(刘振，王新超，赵丽萍，姚明哲，王平盛，许玫，唐一春，陈亮.基于EST-SSR的西南茶区茶树资源遗传多样性和亲缘关系分析.分子植物育种，2008，(6)1：100-110；姚明哲，刘振，陈亮，王新超，马春雷，梁月荣.利用EST-SSR分析江北茶区茶树资源的遗传多样性和遗传结构.茶叶科学，2009，29(3)：243-250；王丽鸳，刘本英，姜燕华，段云裳，成浩，周健，唐一春.用SSR分子标记研究茶组植物种间亲缘进化关系.茶叶科学，2009，29(5)：157-165.)。

云南科研单位选育的茶树无性系良种试验示范结果表明，这些品种具有优质、高产、高效、适应性广等特点，是茶区生产优质茶叶及改善茶区茶树品种结构的理想品种。为保证优质良种产生最大的经济效益、社会效益，需要一种权威、准确、稳定检测方法进行茶树无性系品种纯度的快速鉴定。

发明内容：

本发明目的是提供一种鉴定茶树无性系品种纯度的分子标记方法，它具有多态性高、遗传稳定、不受环境条件影响等优点，可以弥补传统检测方法的不足，从而为茶树品种的纯度检测建立起高效、准确、快速的鉴定方法。

本发明所提供的鉴定茶树无性系品种纯度的方法，包括以下步骤：

1)按照如下方法提取待测茶树品种的基因组DNA：将待检测品种的1.0g鲜嫩芽叶放入研钵中，加入液氮充分研磨至粉末状，加入CTAB缓冲液，65℃水浴30-60分钟，再加入DNA提取液，提取得到待检测茶树品种的基因组DNA。

2)按照如下方法对待检测茶树品种进行PCR扩增：以步骤1)提取的基因组DNA为模板，用SSR引物进行PCR扩增，将所得到的PCR扩增产物进行10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到待检测茶树品种的电泳图谱。

3)将待检测茶树品种的电泳图谱与按照所述步骤1)和2)的方法得到的标准茶树品种的电泳图谱进行比较，如待检测品种与标准品种的谱带(带型)组成一致，则待检测品种与标准品种为同一品种，得出待检测的品种纯度。

所述SSR引物对标准茶树品种能产生特异的谱带，可从现有的茶树SSR引物中选取。

所述的标准品种为已知的茶树无性系品种。

所述CTAB缓冲液的组成为每100ml水溶液中含有2g CTAB，pH 8.0的10ml1mol/L Tris-HCI，4ml 0.5mol/L EDTA，28ml 5mol/L NaCl，1mlβ-巯基乙醇。

所述DNA提取液是由体积比为24∶1的三氯甲烷和异戊醇配成的混合液。

所述PCR扩增的扩增程序为：先95℃变性3-5min，然后进行如下30-35个循环：94℃变性30-35s，53℃、54℃、55℃、56℃、58℃或60℃复性30-35s，72℃延伸50s，最后72℃延伸10min。

所述茶树品种为茶树无性系品种，其中云南茶树无性系品种主要有：佛香1号、佛香2号、佛香3号、佛香4号、佛香5号、云茶1号、云茶春毫、云茶春韵、紫娟、云抗10号、云抗12号、云抗14号、云抗17号、云抗27号、云抗37号、云抗43号、云抗47号、云抗48号、云抗50号、73-11、76-38、云选9号、长叶白毫、73-8、云瑰、矮丰、云梅等共27个云南茶树无性系品种。

所述SSR引物由序列表中2对引物SSR12、SSR42组成。

所述PCR扩增的扩增程序为：先95℃变性3min，然后进行如下35个循环：94℃变性30s，53℃、54℃、55℃、56℃、58℃或60℃复性30s，72℃延伸50s，最后72℃延伸10min。

本发明对常规SSR分子标记技术的一些操作环节进行了改进和修改，修改后的实验方法保留了SSR标记的特色和关键技术，简化了实验步骤，降低了技术含量，用于鉴定茶树品种纯度。该方法操作简单，能够在短时间对样品进行快速鉴定。

本发明的优点：

1、针对SSR扩增对DNA质量要求不高的特点，简化了DNA提取程序。与常规SSR分析相比，省略了DNA纯化和降解RNA等步骤，节约时间和试剂费用。

2、常规SSR分析时一般采用测序胶，即变性聚丙烯酰胺凝胶。制胶技术要求高，电泳上样前须对样品DNA的PCR扩增产物进行变性处理，电泳缓冲液和电泳后胶板的染色与显色试剂用量大。本发明采用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶，制胶简便。电泳前不需变性，操作简单，胶量、电泳缓冲液和染色与显色的试剂节约一半。

3、一般的生物工程公司可提供扩增反应液的试剂或扩增试剂盒。制胶和染色易掌握，图谱清晰。由于基因组DNA中SSR的多态性丰富，遗传性不受环境影响，其结果准确。

本发明的积极效果：

其积极的效果是：建立稳定可靠的茶树无性系品种鉴别方法和检验技术规程，促进茶树良种化进程健康发展，切实保护好茶树新品种知识产权，保障茶叶产业健康、稳定、可持续发展。

附图说明：

图1为整个技术流程图

图2、图3为部分待检测茶树品种和标准茶树品种(佛香3号)的电泳图谱。

M：50bp分子量标准；1：云抗10号；2：佛香3号；3：佛香1号；4：紫娟；5：待检测品种-1；6：待检测品种-2；7：待检测品种-3；8：待检测品种-4；9：待检测品种-5；箭头所示为佛香3号的特异带型。

具体实施方式：

一、本发明所用的主要试剂配制

1、1mol/L Tris-HCI(pH 8.0)

100ml：12.1g Tris-HCI(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)，加去离子水至100ml，NaOH(氢氧化钠)调pH 8.0。

2、0.5mol/L EDTA(pH 8.0)

100ml：18.6g EDTA(乙二胺四乙酸二钠)，2g NaOH，4℃保存备用。

3、5mol/L NaCl

100ml：29.2g NaCl(氯化钠)，加去离子水至100ml。

4、CTAB缓冲液

100ml：2g CTAB，pH 8.0的10ml 1mol/L Tris-HCI，4ml 0.5mol/L EDTA，28ml 5mol/L NaCl，1mlβ-巯基乙醇。

5、CTAB/NaCl缓冲液

100ml：10g CTAB，4.1g NaCl，加去离子水溶解定容100ml。

6、DNA提取液(三氯甲烷∶异戊醇/24v∶1v)

100ml：4ml异戊醇溶于96ml三氯甲烷。

7、3mol/L NaAc(pH5.2)

100ml：60ml H₂O中加入40.824g NaAc 3H₂O，溶解后，用冰醋酸调pH至5.2，然后定溶100ml，灭菌。

8、5×TBE(Tris-硼酸)电泳缓冲液

1000ml：54g Tris(三羟甲基氨基甲烷)，27.5g硼酸，20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，加去离子水至1000ml。

9、高盐TE缓冲液

500ml：100ml 5mol/L NaCl，5ml 1mol/L Tris-HCI(pH 8.0)，0.1ml 0.5mol/LEDTA(pH 8.0)，加水定容500ml，灭菌。

10、70％乙醇

100ml：70ml无水乙醇，加水30ml至100ml。

11、30％丙烯酰胺

100ml：29g丙烯酰胺，1g N、N-二甲叉双丙烯酰胺，37℃助溶，加去离子水定容至100ml。

12、6×londing Buffer(上样缓冲液)

100ml：0.25g溴酚蓝，0.25g二甲苯青F F，40g蔗糖，加水溶解定容至100ml。

13、10％过硫酸铵

10ml：1g过硫酸铵，加去离子水至10ml。

14、固定液(10％乙醇)

500ml：50ml乙醇，2.5ml乙酸，加去离子水至500ml。

15、染色液(0.2AgNO₃)

500ml：0.1g AgNO₃(硝酸银)，加去离子水至500ml。

16、显色液

100ml：1.5g NaOH，500μl甲醛，加去离子水100ml。

二、鉴定茶树品种纯度的方法

1、样品选取

采集待检测茶树无性系品种的一芽二叶鲜嫩芽叶，-20℃保存备用。

2、待检测茶树品种基因组DNA的提取

1)将1.0g鲜嫩芽叶放入研钵中，加入液氮充分研磨，研磨至粉末状，转入1.5ml离心管中，加入0.6ml CTAB提取液(2％CTAB，0.1M Tris，20mmolEDTA，1.4M NaCl，pH 8.0)，震荡混匀，然后转入65℃水浴锅保温50min，期间不断摇匀。

2)随后加入等体积(0.6ml)氯仿/异戊醇(24∶1)，充分混匀。

3)室温下10000rpm，离心10min，吸上清液(0.4ml)于新的1.5ml离心管中，加入1/10体积CTAB/NaCl(10％CTAB，0.7M NaCl)，用等体积氯仿/异戊醇(24∶1)抽提。

4)室温下10000rpm，离心8min，吸上清液(0.4ml)于新的1.5ml离心管中，上清液中加入2/3体积的异丙醇，混匀后于-20℃放置1h，5000rpm，离心5min，收集沉淀。

5)加入0.4ml高盐缓冲液(10mmol Tris，0.1mmol ETDA，1M NaCl，pH 8.0)溶解沉淀，60℃水浴锅保温30min。然后10000rpm，离心5min，去除不能溶解杂质，吸上清液(约0.4ml)于新的1.5ml离心管中(无沉淀属正常现象)。

6)加入1/10体积NaAc(pH 5.2)及2/3体积体积的异丙醇，混匀后于-20℃放置30min。然后5000rpm离心5min，倒掉上清液，收集沉淀。

7)用70％的乙醇洗DNA沉淀3次，每次2min，将离心管倒置于吸水纸上，使DNA干燥，最后溶于300μl超纯水(ddH₂O)中，并加入2μl RNase(4mg/ml)，恒温箱37℃保温30min，-20℃冰箱保存备用。

3、PCR扩增

以步骤2提取的待检测茶树品种的基因组DNA为模板，用SSR引物进行PCR扩增。其中，PCR扩增体系如下：扩增体积为10μl，其成分为：1.0μl 20-50ng/μltemplate DNA，0.4μl 10μmol/l primer，1.0μl 10×PCR buffer(Mg²⁺+free)0.7μl 25mmol/l MgCI₂，0.2μl 10nmol/l dNTP，0.1μl 5U/μl Taq DNA polymerase，6.6μl灭菌ddH₂O。

PCR扩增程序：先95℃变性3min，然后进行如下35个循环：94℃变性30s，53℃、54℃、55℃、56℃、58℃或60℃复性30s，72℃延伸50s，最后72℃延伸10min。

4、凝胶制备

将配好10％非变性聚丙烯酰胺凝胶灌入事先做好的20×20cm的两块玻璃板的间隙中(1mm厚)，立即插入样品梳，10-15min内聚合，聚合后小心抽出样品梳，并用洗瓶冲洗样品胶孔。

5、凝胶电泳

扩增产物加入1μl上样缓冲液，上样电泳。电泳缓冲液为1×TBE，恒压电压150V，电泳2h 30min左右。

6、凝胶银染

1)电泳完毕后，取下胶板，在500ml固定液中固定12-15min(可同时固定2-4块胶)。

2)去离子水漂洗2次，每次5min。

3)0.2％硝酸银染色液染色12-15min(可同时染色2-4块胶)。

4)去离子水快速漂洗10-20s。

5)放入预冷的500ml显色液显色，不断摇动，至谱带显出(可同时显色2-4块胶)。

6)终止反应，用蒸馏水漂洗1次。

7)把染色后的凝胶进行带型分析或扫描纪录，或放入5％的甘油溶液中浸泡30min左右制成干胶，室温干燥后，进行带型分析或扫描纪录。

7、鉴定

将待检测样品的SSR扩增产物的电泳图谱，与按照上述步骤1至6的方法获得的标准茶树品种的电泳图谱相比较，根据待检测茶树品种样品SSR扩增产物和标准茶树品种SSR扩增产物的DNA谱带的组成(带型)的一致性，鉴定茶树品种纯度。

本发明的方法对任一茶树无性系品种有效，但SSR引物有别，下面以茶树无性系品种佛香3号以及引物SSR12、SSR42为实用范例。

实施例1、以佛香3号为标准茶树品种鉴定茶树品种纯度。

鉴定前对来源于云南省的27个品种(含佛香3号)进行了SSR标记的筛选，发现SSR引物SSR12、SSR42对佛香3号的基因组DNA可产生特异的谱带，因此，用引物SSR12、SSR42对佛香3号供检样品的DNA进行分析。

1、样品选取

从云南茶树无性系品种中选取待检测品种佛香3号及其他4个待检测品种(对照)，为检验鉴定效果，再掺入云抗10号、佛香1号、紫娟等茶树品种，采集待检测茶树无性系品种的一芽二叶鲜嫩芽叶，-20℃保存备用。

2、茶树品种基因组DNA的提取

1)将1.0g鲜嫩芽叶放入研钵中，加入液氮充分研磨，研磨至粉末状，转入1.5ml离心管中，加入0.6ml CTAB提取液(2％CTAB，0.1M Tris，20mmolEDTA，1.4M NaCl，pH 8.0)，震荡混匀，然后转入65℃水浴锅保温50min，期间不断摇匀。

2)随后加入等体积(0.6ml)氯仿/异戊醇(24∶1)，充分混匀。

3)室温下10000rpm，离心10min，吸上清液(0.4ml)于新的1.5ml离心管中，加入1/10体积CTAB/NaCl(10％CTAB，0.7M NaCl)，用等体积氯仿/异戊醇(24∶1)抽提。

4)室温下10000rpm，离心8min，吸上清液(0.4ml)于新的1.5ml离心管中，上清液中加入2/3体积的异丙醇，混匀后于-20℃放置1h，5000rpm，离心5min，收集沉淀。

5)加入0.4ml高盐缓冲液(10mmol Tris，0.1mmol ETDA，1M NaCl，pH 8.0)溶解沉淀，60℃水浴锅保温30min。然后10000rpm，离心5min，去除不能溶解杂质，吸上清液(约0.4ml)于新的1.5ml离心管中(无沉淀属正常现象)。

6)加入1/10体积NaAc(pH 5.2)及2/3体积体积的异丙醇，混匀后于-20℃放置30min。然后5000rpm离心5min，倒掉上清液，收集沉淀。

7)用70％的乙醇洗DNA沉淀3次，每次2min，将离心管倒置于吸水纸上，使DNA干燥，最后溶于300μl超纯水(ddH₂O)中，并加入2μl RNase(4mg/ml)，恒温箱37℃保温30min，-20℃冰箱保存备用。

3、SSR引物的PCR扩增

以步骤2提取的待检测茶树品种的基因组DNA为模板，用SSR引物进行PCR扩增。其中，PCR扩增体系如下：扩增体积为10μl，其成分为：1.0μl 20-50ng/μltemplate DNA，0.4μl 10μmol/l primer，1.0μl 10×PCR buffer(Mg²⁺+free)0.7μl 25mmol/l MgCI₂，0.2μl 10nmol/l dNTP，0.1μl 5U/μl Taq DNA polymerase，6.6μl灭菌ddH₂O。

PCR扩增程序：先95℃变性3min，然后进行如下35个循环：94℃变性30s，53℃、54℃、55℃、56℃、58℃或60℃复性30s，72℃延伸50s，最后72℃延伸10min。

4、凝胶制备

将配好10％非变性聚丙烯酰胺凝胶灌入事先做好的20×20cm的两块玻璃板的间隙中(1mm厚)，立即插入样品梳，10-15min内聚合，聚合后小心抽出样品梳，并用洗瓶冲洗样品胶孔。

5、凝胶电泳

扩增产物加入1μl上样缓冲液，上样电泳。电泳缓冲液为1×TBE，恒压电压150V，电泳2h 30min左右。

6、凝胶银染

1)电泳完毕后，取下胶板，在500ml固定液中固定12-15min(可同时固定2-4块胶)。

2)去离子水漂洗2次，每次5min。

3)0.2％硝酸银染色液染色12-15min(可同时染色2-4块胶)。

4)去离子水快速漂洗10-20s。

5)放入预冷的500ml显色液显色，不断摇动，至谱带显出(可同时显色2-4块胶)。

6)终止反应，用蒸馏水漂洗1次。

7)把染色后的凝胶进行带型分析或扫描纪录，或放入5％的甘油溶液中浸泡30min左右制成干胶，室温干燥后，进行带型分析或扫描纪录。

7、鉴定

将待检测样品的SSR扩增产物的电泳图谱，与按照上述步骤1至6的方法获得的标准茶树品种的电泳图谱相比较，根据待检测茶树品种样SSR扩增产物和标准茶树品种SSR扩增产物的DNA谱带的组成(带型)的一致性，鉴定茶树品种纯度。结果表明，5个待检测品种中只有待检测品种-1的SSR图谱带型与佛香3号相同，其他品种与佛香3号和待检测品种-1带型有差异，与预选掺杂的情况相符，说明待检测品种-1是佛香3号，其他4个待检测品种则不是佛香3号。部分待检测品种和标准品种佛香3号的电泳图谱如图2、图3所示，图中，M：50bp分子量标准；1：云抗10号；2：佛香3号；3：佛香1号；4：紫娟；5：待检测品种-1；6：待检测品种-2；7：待检测品种-3；8：待检测品种-4；9：待检测品种-5；箭头所示为佛香3号的特异带型。

Claims (10)

1.一种鉴定茶树无性系品种的分子标记方法，包括以下步骤：

1)按照如下方法提取待检测茶树品种的基因组DNA：将待检测品种的1.0g鲜嫩芽叶放入研钵中，加入液氮充分研磨至粉末状，加入CTAB缓冲液，65℃水浴30-60分钟，再加入DNA提取液，提取得到待检测茶树品种的基因组DNA。

2)按照如下方法对待检测茶树品种进行PCR扩增：以步骤1)提取的基因组DNA为模板，用SSR引物进行PCR扩增，将所得到的PCR扩增产物进行10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到待检测茶树品种的电泳图谱。

3)将待检测茶树品种的电泳图谱与按照所述步骤1)和2)的方法得到的标准茶树品种的电泳图谱进行比较，如待检测品种与标准品种的谱带(带型)组成一致，则待检测品种与标准品种为同一品种，得出待检测的品种纯度。

2.根据权力要求1所述的方法，其特征在于：所述SSR引物对标准茶树品种能产生特异的谱带。

3.根据权力要求1所述的方法，其特征在于：所述CTAB缓冲液的组成为每100ml水溶液中含有2g CTAB，pH 8.0的10ml 1mol/L Tris-HCI，4ml 0.5mol/L EDTA，28ml 5mol/L NaCl，1mlβ-巯基乙醇。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述DNA提取液是由体积比为24∶1的三氯甲烷和异戊醇配成的混合液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的扩增程序为：先95℃变性3-5min，然后进行如下30-35个循环：94℃变性30-35s，53℃、54℃、55℃、56℃、58℃或60℃复性30-35s，72℃延伸50s，最后72℃延伸10min。

6.根据权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：所述茶树品种为茶树无性系品种，其中云南茶树无性系品种主要有：佛香1号、佛香2号、佛香3号、佛香4号、佛香5号、云茶1号、云茶春毫、云茶春韵、紫娟、云抗10号、云抗12号、云抗14号、云抗17号、云抗27号、云抗37号、云抗43号、云抗47号、云抗48号、云抗50号、73-11、76-38、云选9号、长叶白毫、73-8、云瑰、矮丰、云梅等共27个云南茶树无性系品种。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述SSR引物为由序列表中的2对引物SSR12和SSR42组成。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的扩增程序为：先95℃变性3min，然后进行如下35个循环：94℃变性30s，53℃、54℃、55℃、56℃、58℃或60℃复性30s，72℃延伸50s，最后72℃延伸10min。

9.根据权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中将所得到的PCR扩增产物进行10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

10.根据权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中水浴时间为50分钟。

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