CN105087803A

CN105087803A - 一种鉴定低酚棉花品种的方法

Info

Publication number: CN105087803A
Application number: CN201510543640.1A
Authority: CN
Inventors: 赵君; 肖松华; 刘剑光; 徐剑文; 吴巧娟
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-08-28
Filing date: 2015-08-28
Publication date: 2015-11-25

Abstract

本发明公开了一种鉴定低酚棉花品种的方法，通过提取各供试材料的基因组DNA，在棉花26个连锁群上分别选择3条SSR引物，以各供试材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增，分析PCR扩增结果，构建各低酚棉花品种的指纹图谱，筛选出不同品种的特征引物，其中有53对引物在不同供试材料间表现出稳定的多态性，利用最少2对特征引物组合即可将低酚棉品种区分开来；为今后低酚棉花的鉴定、开发和保护提供有力的技术支撑。

Description

一种鉴定低酚棉花品种的方法

技术领域

本发明涉及一种鉴定低酚棉花品种的方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

棉花是我国主要的经济作物，集纤维、蛋白、油用于一体，其中棉纤维已得到充分利用；蛋白、油来源于棉籽，棉籽中除了含有18％-20％的油脂外，还含有22％-24％的蛋白质。棉籽榨油后的棉仁粉，蛋白质含量更可高达45％-50％，远胜过稻米、小麦、甚至花生、大豆的蛋白质含量，而且含有小麦、稻米以至大豆所欠缺的一些人体所必需的基本氨基酸。棉仁中还含有35％以上的棉仁油，在食用油中，亚油酸含量最高的莫过于棉仁油。棉仁油的亚油酸含量高达55.6％，是一种亚油酸含量极高的高级保健油。因此，棉籽不仅是重要的植物油料，而且是世界上仅次于大豆的重要植物蛋白资源。但因棉籽中含有对人畜有毒的棉酚及其衍生物，棉籽蛋白质和油用资源的利用一直受到限制。棉酚及其衍生物是对人类和单胃动物有很高毒性的一种化学物质，但棉株部位的棉酚却是棉花自身防御病虫危害的重要组成部分，植株部位缺少棉酚会导致棉花病虫的危害而使产量大幅下降。因此，为了提高棉花的综合利用价值，科学家一直将选育不含棉酚的棉花品种作为工作重点。

在棉花中已发现多种类型的低酚基因资源，其中仅有两种类型即双隐性低酚(gl2gl3)和显性低酚(Gl2e)具有实际利用价值。Afifi等人通过32P辐射诱变海岛棉(G.barbadenceL.)，获得一个无腺体突变体，命名为“Bahtim110”。遗传研究结果表明，该性状受到一对显性主基因控制，并命名为Gl2e。它可以有效地抑制棉酚腺体的形成。董承光利用陆地棉遗传标准系TM-1和海岛棉无腺体突变品系海1构建的1599个F2单株，对无腺体突变基因Gl2e进行了精细定位。遗传研究进一步证明，该基因是一不完全显性单基因。利用SSR标记将Gl2e基因定位在CIR362和NAU2251b之间，遗传距离分别为9.27和0.96cM。经典遗传学分析表明，gl2和gl3两对隐性基因控制棉酚发育，分别位于棉花第12和26染色体，当两对隐性基因纯合时，棉花植株和棉籽均表现为无腺体。2001年张雪林等分析湘x9628棉酚发育特性表明：湘x9628植株有腺体、种子低棉酚特性由二对重叠隐性基因控制，等位性测验表明，其中一对基因是gl2的等位基因，另一对是gl3的复等位基因，它对gl3表现为隐性，可能是控制棉酚发育的一个新基因。

随着新技术在棉花育种中的应用，棉花产业的发展越来越快，新品种选育周期缩短，审定速度加快、品种数量增多。目前棉花品种选育过程中所用的亲本遗传基础愈加狭窄，骨干亲本数量有限且反复利用，在原品种基础上改良少数或单个性状的衍生品种增多，一些棉花新品种形态越来越相似，通过传统的形态标记方法鉴别越来越困难，而且鉴定结论也常常存在疑问。目前生产中使用的品种存在非常大的类同性，甚至用未审定的假品种充当新品种，严重影响种子市场秩序和农业生产安全。因此急需建立一套客观、可靠、易操作的鉴别技术为不同的棉花品种编制对应的指纹身份证号。这是司法鉴定品种真实性和纯度的迫切要求，也是对棉花新品种权保护的重要保证。随着现代分子生物技术的发展，分子标记技术由于不受取材部位、取材时间及环境的影响，已经被作为一种进行品种纯度和真实性鉴定的常规方法。目前，用于鉴定品种的分子标记类型很多，包括RAPD、SSR、ISSR、SRAP、AFLP等，其中SSR标记具有结果稳定，重复性好等特点，被认为是进行品种鉴定的一种比较理想的标记，被广泛应用在棉花品种指纹图谱构建和遗传多样性分析中。李成奇等利用20对SSR核心引物构建了百棉系列棉花自交系品种(系)的DNA指纹图谱。赵亮等利用26对SSR引物构建12个品种DNA指纹图谱。聂新辉等利用40对SSR引物构建了51份新陆早系列棉花品种的DNA指纹图谱。

低酚棉花品种的选育相对落后，但是随着中国内地棉花种植面积的不断减少以及植棉经济效益的降低，棉花育种家会越来越重视特种棉花品种的选育，其中低酚棉的种仁具有重要利用价值，所以通过选育低酚棉提高棉花的综合利用价值将会是其中一个重点方向和热点内容。我国从1986年开始用显性无腺体海岛棉品系海1与早熟、抗病、丰产的陆地棉杂交，把显性无腺体基因转入到陆地棉中，首次培育出了显性无腺体陆地棉新种质。目前已有20多个低酚棉品种通过省级以上审定并命名。低酚棉的种仁棉酚含量达到国家食用标准(＜0.02％)和国际食用标准(＜0.04％)，但是针对低酚棉的品种，还没有建立起精确的鉴定技术和方法。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种鉴定低酚棉花品种的方法，通过构建低酚棉品种指纹图谱，开发一套鉴定低酚棉品种的分子标记，为区分和保护不同低酚棉品种提供技术支持。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种鉴定低酚棉花品种的方法，包括如下步骤：提取各供试材料的基因组DNA，在棉花26个连锁群上分别选择3条SSR引物，以各供试材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增，分析PCR扩增结果，构建各低酚棉花品种的指纹图谱，筛选出不同品种的特征引物，其中有53对引物在不同供试材料间表现出稳定的多态性，利用最少2对特征引物组合即可将低酚棉品种区分开来；所述的53对引物分别为：NAU4044、NAU5499、JESPR304、NAU5384、NAU2161、BNL3441、NAU3469、NAU3386、NAU5015、NAU2121、NAU5434、NAU3206、NAU3654、BNL1604、NAU3964、BNL3255、NAU5318、BNL2590、BNL256、HAU2681、HAU2837、NAU3897、NAU3778、NAU5204NAU4863、NAU2765、NAU3736、JESPR243、NAU3733、NAU3714、BNL3955、NAU2907、NAU2162、BNL448、NAU2894、BNL852、NAU1221、BNL3806、BNL827、NAU3906、NAU2734、NAU2240、NAU5379、NAU5350、BNL3383、NAU5359、NAU3434、NAU4855和HAU2631，详见表1。

表153对引物

前述鉴定低酚棉花品种的方法中，步骤(1)中所述的供试材料为我国审定的低酚陆地棉品种9份，分别是冀棉19、冀棉21、冀棉27、湘棉18号、辽棉11号、中棉所18、中棉所20、汾低99和苏研608，以及低酚海岛棉海1和有酚陆地棉品种泗抗1号作为对照品种。

前述鉴定低酚棉花品种的方法中，所述的指纹图谱的构建方法为：将对照种的扩增带型记为1，后续泳道中遇到与其带型一致的记为1，不一致的记为2，遇到与带型2不一致的记为3，依次类推。获得供试品种SSR引物扩增的基因型代码后，将所有引物扩增基因型代码串联，按染色体号从小到大，先At亚组后Dt亚组的顺序依次排列，作为每一个品种的数字指纹。

前述鉴定低酚棉花品种的方法中，提取基因组DNA的方法为：

(1)将5g冻叶或鲜叶放入预冷的研钵中，加入液氮研磨，分2次加入10ml新鲜配制的提取缓冲液，转入50ml的离心管中，涡旋混匀，冰浴保存10min，4℃下4000rpm离心20min，弃上清；

(2)于沉淀中加入15ml65℃预热的裂解缓冲液，并用铜丝搅松，涡旋混匀，65℃水浴30min；

(3)加入15ml体积比为24:1的氯仿和异戊醇的混合液，翻转50次以上，15℃下4000rpm离心20min，将上清转入50ml的离心管中，加0.6体积的预冷的异丙醇，缓慢翻转30次，混匀，静置10min，4000rpm，室温下离心10min，弃上清，于沉淀中加入2ml70％的乙醇洗涤，并转入10ml的离心管中，10000rpm离心5min。倒掉上清液，通风干燥20min；

(4)加3mlTE缓冲液，溶解，65℃培养10～30min，加3ml的体积比为24∶1的氯仿和异戊醇混合液，缓慢翻转50次，混匀，室温静置5min，10000rpm离心10min；

(5)上清液转入10ml离心管中，加0.1体积的pH为5.2的3M醋酸钠，加等体积的异丙醇后翻转30次，放置30min，10000rpm离心5min，弃上清液，加2ml70％乙醇洗DNA小团，10000rpm离心5min。倒掉上清液，通风干燥20min；

(6)加3mlTE缓冲液溶解，65℃培养10～30min；

(7)加5μl10mg/ml的RNAaseA，37℃温育30～60min。加等体积的体积比为24∶1的氯仿和异戊醇混合液，缓慢翻转50次，混匀，室温静置5min，10000rpm离心10min；

(8)上清液转入10ml离心管中，加0.1体积的pH为5.2的3M醋酸钠，加等体积的异丙醇后翻转30次；

(9)将絮状沉淀挑入加有800μl70％乙醇的1.5ml的离心管中，10000rpm离心5min。弃上清液，自然通风干燥DNA小团；

(10)加200μlTE缓冲液在4℃下溶解DNA1～2天，-20℃保存；

(11)以5μl北京天根100bpDNALadder作为对照，将DNA依次稀释5倍、10倍和20倍，通过1％琼脂糖凝胶电泳，确定DNA的浓度、纯度以及完整性；

(12)根据提取DNA的浓度，用TE缓冲液将DNA稀释至20ng/μl工作液，混匀备用。

其中，步骤(1)所述的提取缓冲液配方为：葡萄糖6.936g、0.1MTris.HCl10.0ml、5mMNa.EDTA1.0ml、2％PVP20.0ml、体积分数为0.01的β-ME1.0ml、去离子水68.0ml。

步骤(2)所述的裂解缓冲液配方为：NaCl8.1816g、0.1MTris.HCl10ml、20mMNa.EDTA4.0ml、2％CTAB20ml、2％PVP20ml、体积分数为0.01的β-ME1.0ml、去离子水45.0ml。

步骤(4)及步骤(10)所述的TE缓冲液的配制方法为将1.0MTris-HCl溶液2.5ml和0.5MEDTA溶液0.5ml混匀，蒸馏水定容至250ml灭菌，调整PH＝8.0。

53对核心引物的电泳结果表明，9个陆地棉低酚品种具有各自的特征引物，冀棉19具有7对特征引物，分别是HAU2837、NAU5204、BNL3955、BNL3806、HAU2631、BNL3383和HAU2681；冀棉21具有2对特征引物，分别是NAU5434和BNL2590；冀棉27具有5对特征引物，分别是NAU1221、BNL3806、HAU2631、BNL3383和HAU2681；湘棉18号的特征引物只有NAU5379；辽棉11号具有4对特征引物，分别是BNL852、NAU5204、NAU3778和NAU5434；中棉所18号的的特异引物是HAU2631和NAU5434；中棉所20号的特异引物是BNL1604；汾低99的特异引物是JESPR304、BNL2590和NAU5434；苏研608具有5对特征引物，分别是NAU4044、NAU2907、NAU5350、BNL3383和BNL2590。利用最少2对引物组合即可将10份低酚棉品种区分开来，如NAU4404与NAU2681，NAU4404与BNL3171配对。

本发明的有益效果是：

低酚棉花品种具有重要利用价值，通过选育低酚棉提高棉花的综合利用价值将会是其中一个重点方向和热点内容。但是低酚棉品种的指纹图谱至今还未见报道，特别是不同低酚棉品种的特异鉴定引物筛选还没有报道，本发明首先筛选位于不同染色体的核心引物，利用其构建不同低酚棉花品种的指纹图谱，筛选不同品种的特征引物，来区分不同低酚棉品种。为今后低酚棉花的鉴定、开发和保护提供有力的技术支撑。

附图说明

图1是冀棉19特异引物电泳图

图2是冀棉21特异引物电泳图

图3是冀棉27特异引物电泳图

图4是湘棉18号特异引物电泳图

图5是辽棉11号特异引物电泳图

图6是中棉所18特异引物电泳图

图7是中棉所20特异引物电泳图

图8是汾低99特异引物电泳图

图9是苏研608特异引物电泳图

具体实施方式

下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

1、实验材料

收集目前我国审定的低酚陆地棉品种9份，分别是冀棉19、冀棉21、冀棉27、湘棉18号、辽棉11号、中棉所18、中棉所20、汾低99和苏研608；以低酚海岛棉海1和有酚陆地棉泗抗1号为对照。所有品种都来源于各育种单位，引入的品种严格自交繁殖保纯。

2、试验方法

2.1DNA提取和纯化：

在各供试材料中随机选择5株，取未展开叶片混合，用于基因组DNA的提取。

(1)将5g冻叶(或鲜叶)放入预冷的研钵中，加入液氮研磨。分2次加入10ml新鲜配制的提取缓冲液(表2)，转入50ml的离心管中，涡旋混匀，冰浴保存10min。4000rpm离心20min(4℃)，弃上清；

(2)于沉淀中加入15ml65℃预热的裂解缓冲液(表3)，并用铜丝搅松，涡旋混匀，65℃水浴30min；

(3)加入15ml氯仿∶异戊醇(24:1，体积比)混合液，翻转50次以上，4000rpm离心20min(15℃)，将上清转入50ml的离心管中，加0.6体积的预冷的异丙醇，缓慢翻转30次，混匀，静置10min，4000rpm，离心10min(室温)，弃上清，于沉淀中加入2ml70％的乙醇洗涤，并转入10ml的离心管中，10000rpm离心5min。倒掉上清液，通风干燥20min；

(4)加3mlTE缓冲液(PH＝8.0，1.0MTris-HCl溶液2.5ml和0.5MEDTA溶液0.5ml混匀，蒸馏水定容至250ml灭菌)溶解，65℃培养10～30min，加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1，体积比)，缓慢翻转50次，混匀，室温静置5min，10000rpm离心10min；

(5)上清液转入10ml离心管中，加0.1体积的3M醋酸钠(pH5.2)，加等体积的异丙醇后翻转30次，放置30min，10000rpm离心5min。弃上清液，加2ml70％乙醇洗DNA小团，10000rpm离心5min。倒掉上清液，通风干燥20min；

(6)加3mlTE缓冲液溶解，65℃培养10～30min；

(7)加5μlRNAaseA(10mg/ml)，37℃温育30～60min。加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1，体积比)，缓慢翻转50次，混匀，室温静置5min，10000rpm离心10min；

(8)上清液转入10ml离心管中，加0.1体积的3M醋酸钠(pH5.2)，加等体积的异丙醇后翻转30次；

(10)加200μlTE缓冲液[10mMTris/HCl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0)]溶解DNA(4℃，1～2天)，-20℃保存。

(11)以5μl北京天根100bpDNALadder作为对照，将DNA依次稀释5倍，10倍和20倍，通过1％琼脂糖凝胶电泳，确定DNA的浓度、纯度以及完整性。

(12)根据提取DNA的浓度，用TE将DNA稀释至20ng/μl工作液，混匀备用。

表2DNA提取缓冲液配方

表3裂解缓冲液配方

2.2PCR方法：

(1)引物来源

根据南京农业大学公布的遗传的图谱(Zhaoetal.,2013)，在棉花26个连锁群上分别选择3对引物，共计78对(表4)，引物类型包括NAU、HAU和BNL。所有引物信息可从http://www.genome.clemson.edu/projects/cotton网站下载。引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。

表4本发明所用引物序列

(2)所用试剂及主要仪器

PCR反应所用Taq酶和dNTPs均购自北京天为时代公司，PAGE胶所用试剂包括丙烯酰胺，甲叉丙烯酰胺，Tris-碱，硼酸，硝酸银，氢氧化钠，TEMED等试剂从剑纯生物科技公司采购。主要仪器包括东胜牌PCR仪，Eppendor高速冷冻离心机，水浴锅，摇床和北京六一仪器厂生产的电泳槽和电泳仪。

(3)PCR反应体系及扩增程序

PCR反应体系见表5。

表5PCR反应体系

PCR反应在东胜牌PCR仪上进行，反应程序为：

电泳溶液配制：

扩增产物采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶浓度9％，电泳缓冲液为0.5×TBE，180V恒压电泳1.5～2小时。

9％PAGE胶：43.5g丙烯酰胺，1.5g甲叉丙烯酰胺，100ml5×TBE，加蒸馏水定容至500ml，4℃保存。

10％过硫酸铵：10g过硫酸铵溶解在100ml蒸馏水中，4℃保存。

上样缓冲液：0.25g溴酚蓝+0.25g二甲苯氰+40g蔗糖，蒸馏水定容至100ml。

5×TBE：54gTris-碱，27.5g硼酸，0.5MEDTA(PH＝8.0)20ml，蒸馏水定容至1L，室温保存。

染色液：1g硝酸银+500ml蒸馏水。

显色液：7.5g氢氧化钠+750μL甲醛+500ml蒸馏水。

凝胶制备及电泳过程：

(1)用清水将玻璃板、胶条和梳子洗净，晾干备用。

(2)将玻璃板、胶条和梳子按要求安装好，并用1％的琼脂糖凝胶封底，待凝胶凝固，将其固定在电泳槽上。

(3)在锥形瓶中倒入已经配制好的9％的PAGE胶，加入10％AP和TEMED，迅速灌胶，灌满后插入梳子，15-20分钟后，拔出梳子，准备电泳。

(4)电泳前在PCR扩增产物中加入2μL上样缓冲液，拔掉梳子，将电泳缓冲液(1XTBE)加入正负极电泳槽中，缓冲液高度要超过短玻璃板，每个点样孔上样2μL，180V恒压电泳1.5～2小时。到蓝色指示标记距胶下面2cm即可停止，小心拆开玻璃板去除凝胶，并对凝胶进行标记。

染色及显色过程：

(1)固定：将拆下来的凝胶放入固定液中(10％乙醇+0.5％冰乙酸)12min，

(2)染色：固定结束后，将固定液到出去，将染色液倒入(0.2％硝酸银水溶液)，12min后，蒸馏水漂洗3次。

(3)显色：1.5％氢氧化钠+0.4％甲醛加入，摇晃，到胶片上条带显示清楚即可结束，适倒掉显色液，用自来水冲洗4次，将胶片放置在灯箱上拍照。

2.3指纹图谱构建：

参考颜静宛等对水稻分子身份证数据库的构建方法，将对照种的扩增带型记为1，后续泳道中遇到与其带型一致的记为1，不一致的记为2，遇到与带型2不一致的记为3，依次类推。获得供试品种SSR引物扩增的基因型代码后，将所有引物扩增基因型代码串联，按染色体号从小到大，先At亚组后Dt亚组的顺序依次排列，作为每一个品种的数字指纹。

本发明采用的低酚棉详情见表6。

表6本发明所用品种的名称、系谱来源、低酚性状来源和种仁棉酚含量

按照上述原则构建的低酚棉品种的分子指纹图谱见表7.

表7本发明所用品种的分子指纹图谱

从图1-9的电泳图中可知，每个品种都有自己的特征引物，图像中都有一条或几条特征带，各个品种的特征带存在区别，通过比较这些特征带，就可以确定待测品种的真伪和种类。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种鉴定低酚棉花品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：提取各供试材料的基因组DNA，在棉花26个连锁群上分别选择3条SSR引物，以各供试材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增，分析PCR扩增结果，构建各低酚棉花品种的指纹图谱，筛选出不同品种的特征引物，其中有53对引物在不同供试材料间表现出稳定的多态性，利用最少2对特征引物组合即可将低酚棉品种区分开来；所述的53对引物编号分别为：NAU4044、NAU5499、JESPR304、NAU5384、NAU2161、BNL3441、NAU3469、NAU3386、NAU5015、NAU2121、NAU5434、NAU3206、NAU3654、BNL1604、NAU3964、BNL3255、NAU5318、BNL2590、BNL256、HAU2681、HAU2837、NAU3897、NAU3778、NAU5204NAU4863、NAU2765、NAU3736、JESPR243、NAU3733、NAU3714、BNL3955、NAU2907、NAU2162、BNL448、NAU2894、BNL852、NAU1221、BNL3806、BNL827、NAU3906、NAU2734、NAU2240、NAU5379、NAU5350、BNL3383、NAU5359、NAU3434、NAU4855和HAU2631。

2.根据权利要求1所述的鉴定低酚棉花品种的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的供试材料为我国审定的低酚陆地棉品种9份，分别是冀棉19、冀棉21、冀棉27、湘棉18号、辽棉11号、中棉所18、中棉所20、汾低99和苏研608，以及低酚海岛棉海1和有酚陆地棉品种泗抗1号作为对照品种。

3.根据权利要求1所述的鉴定低酚棉花品种的方法，其特征在于，所述的指纹图谱的构建方法为：将对照种的扩增带型记为1，后续泳道中遇到与其带型一致的记为1，不一致的记为2，遇到与带型2不一致的记为3，依次类推。获得供试品种SSR引物扩增的基因型代码后，将所有引物扩增基因型代码串联，按染色体号从小到大，先At亚组后Dt亚组的顺序依次排列，作为每一个品种的数字指纹。

4.根据权利要求1所述的鉴定低酚棉花品种的方法，其特征在于，提取基因组DNA的方法为：

(5)上清液转入10ml离心管中，加0.1体积的pH为5.2的3M醋酸钠，加等体积的异丙醇后翻转30次，放置30min，10000rpm离心5min，弃上清液，加2ml70％乙醇洗DNA小团，10000rpm离心5min，倒掉上清液，通风干燥20min；

(6)加3mlTE缓冲液溶解，65℃培养10～30min；

(7)加5μl10mg/ml的RNAaseA，37℃温育30～60min，加等体积的体积比为24∶1的氯仿和异戊醇混合液，缓慢翻转50次，混匀，室温静置5min，10000rpm离心10min；

(9)将絮状沉淀挑入加有800μl70％乙醇的1.5ml的离心管中，10000rpm离心5min；弃上清液，自然通风干燥DNA小团；

(10)加200μlTE缓冲液在4℃下溶解DNA1～2天，-20℃保存；

5.根据权利要求4所述的鉴定低酚棉花品种的方法，其特征在于，步骤(1)所述的提取缓冲液配方为：葡萄糖6.936g、PH＝8.0的0.1MTris.HCl10.0ml、5mMNa.EDTA1.0ml、2％PVP20.0ml、体积分数为0.01的β-ME1.0ml、去离子水68.0ml。

6.根据权利要求4所述的鉴定低酚棉花品种的方法，其特征在于，步骤(2)所述的裂解缓冲液配方为：NaCl8.1816g、PH＝8.0的0.1MTris.HCl10ml、20mMNa.EDTA4.0ml、2％CTAB20ml、2％PVP20ml、体积分数为0.01的β-ME1.0ml、去离子水45.0ml。

7.根据权利要求4所述的鉴定低酚棉花品种的方法，其特征在于，步骤(4)及步骤(10)所述的TE缓冲液的配制方法为将1.0MTris-HCl溶液2.5ml和0.5MEDTA溶液0.5ml混匀，蒸馏水定容至250ml灭菌，调整PH＝8.0。

8.根据权利要求2所述的鉴定低酚棉花品种的方法，其特征在于，冀棉19具有7对特征引物，分别是HAU2837、NAU5204、BNL3955、BNL3806、HAU2631、BNL3383和HAU2681；冀棉21具有2对特征引物，分别是NAU5434和BNL2590；冀棉27具有5对特征引物，分别是NAU1221、BNL3806、HAU2631、BNL3383和HAU2681；湘棉18号的特征引物只有NAU5379；辽棉11号具有4对特征引物，分别是BNL852、NAU5204、NAU3778和NAU5434；中棉所18的特异引物是HAU2631和NAU5434；中棉所20的特异引物是BNL1604；汾低99的特异引物是JESPR304、BNL2590和NAU5434；苏研608具有5对特征引物，分别是NAU4044、NAU2907、NAU5350、BNL3383和BNL2590。