CN104862387A - 棉花品种指纹图谱及数字化身份证的建立方法 - Google Patents

Abstract

一种棉花品种指纹图谱及数字化身份证的建立方法，包括步骤：S1、样本制备；S2、基因组DNA的提取和检测；S3、SSR-PCR分析；S4、数据统计；S5、指纹图谱的构建；S6、数字身份证的构建；S7、品种鉴定。通过上述方法所绘制的指纹图谱和数字身份证可以作为鉴定试验所用材料的标准化图谱，采用所列引物组合对现有的新陆早系列品种进行鉴定可以达到有效鉴定和区分的效果。其优点在于：(1)与现有资料相比，本发明制备的指纹图谱更加直观化，更具有实用性；(2)本发明获得新陆早系列材料各材料的身份证图谱都是唯一的，可以用于各材料的鉴定。

Description

棉花品种指纹图谱及数字化身份证的建立方法

技术领域

本发明涉及棉花品种鉴定技术领域，更具体地说，特别涉及一种棉花品种指纹图谱及数字化身份证的建立方法。

背景技术

棉花品种鉴定是育种、生产过程中的必要步骤，也是作物安全保存与评价中的重要手段。随着棉花品种选育过程的加快，引种与转基因技术应用范围与频率的加强，传统的形态学鉴定方法越来越不能满足鉴定的需要，DNA指纹鉴定技术以其简单、快速，易于自动化的特点在玉米、大豆、水稻]等作物品种鉴定过程中越来越广泛地得到应用。

新疆作为我国的一个重要产棉区，在全国的棉花生产、种质资源交流、保存与应用过程中具有重要的意义。新陆早系列品种的选育与推广在一定程度上代表着新疆地区棉花种植、栽培及选育的一个演替过程，在种质资源保存、应用方面具有举足轻重的意义。

目前，分子标记技术在棉花遗传多样性分析、种质鉴定等方面已经得到广泛应用，在新疆早熟陆地棉方面也有相关的报道。匡猛等采用36对多态性较好的SSR引物构建了中国3大棉区32份棉花主栽品种的指纹图谱，建立了这些种质鉴定的数据库，并分析了这些种质的遗传多样性。武耀廷等利用SSR标记检测了30个陆地棉栽培品种和4个杂交种亲本的多态性，并构建了杂交种的指纹图谱，用于分子鉴定与纯度检测。薛艳等采用52对SSR引物42个新疆早熟陆地棉进行了遗传多样性分析，并构建了特异的数字指纹图谱。刁明等采用12对RAPD引物对北疆50年来主栽棉花品种进行了遗传多样性分析，其中包括了7份新陆早系列品种材料。赵战胜等采用38个SSR引物对北疆33个早熟陆地棉品种进行遗传多样性分析，发现北疆棉花品种的遗传基础狭窄。虽然，利用分子标记技术分析新疆早熟陆地棉遗传多样性的研究较多，但随着品种数量的增加，研究结果存在着一定的局限性，需要持续地进行跟踪研究。

目前，对新疆早熟陆地棉系列品种构建指纹图谱的报道尚少，并且相关研究内容结果主要是“0、1”数据式，对于应用方面的意义较小，直观性较差。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种棉花品种指纹图谱及数字化身份证的建立方法，以解决上述问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种棉花品种指纹图谱及数字化身份证的建立方法，包括步骤：

S1、样本制备：提供棉花品种并对不同品种的棉花进行编号，并制表以便于后续数据的处理与溯源；

S2、基因组DNA的提取和检测：将上述提供的不同品种的棉花进行分组，每组实验材料随机连续选取10株，采集顶尖叶芽混合提取基因组DNA，提取方法参照Paterson等的方法，采用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量和浓度，-20℃保存备用；

S3、SSR-PCR分析：引物来自于CMD和相应的参考资料，PCR反应体系为20ul，其中各成分为：10×Buffer(含Mg2+)2.0ul，dNTP 0.4ul，引物2ul，5U Taq DNS聚合酶0.2ul，模板DNA2ul，其余用ddH2O补充至20ul；

扩增程序为：95℃预变性3min，94℃变性50s，55℃复性45s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸7min，4℃保存，PCR反应在Bio-Rad PCR仪中进行，扩增产物先在2.5％的琼脂糖凝胶上进行初步筛选，效果较好的再在6％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，银染显色，相机拍照、保存和计数；

S4、数据统计：依据SSR扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，在相同迁移位置上有带的记为“1”，无带的记为“0”；

S5、指纹图谱的构建：根据扩增结果及分子量Marker的片段大小，估算条带的大小，构建全部的棉花样品的DNA分子指纹图谱及数字化身份证；

其具体方法为：根据分子量Marker的片段大小的对数值与电泳迁移距离绘制DNA分子量标准曲线图，然后用直尺量出每个扩增片段在胶板上的迁移 距离，依据DNA分子量标准曲线图计算出每个片段的分子量，同时根据“0，1”数据绘制标准化的指纹图谱，记为“0”的用白色空格表示，记为“1”的用黑色空格表示；

S6、数字身份证的构建：为了提高DNA指纹身份证的实用性和参考价值，将图示化指纹图谱进一步数字化，选用多组数据构成每个品种的数字身份证，其中一组为实验样品名称，另外多组书记表示所用的核心鉴定引物及扩增片段的有无，表示为“引物1编号-0或1-引物2编号-0或1-......-引物7编号-0或1”；

S7、品种鉴定：采用上述方法给出的实验操作方法及引物，进行相应的扩增，数据统计，将统计的数据与本专利给出的指纹图谱及数字身份证即可得到鉴定结果。

优选地，所述棉花品种选用的是新陆早系列棉花样品。

采用上述方法制备指纹图谱及数字化身份证，与现有相关图谱相比，对现有的相关研究进行分析发现现有的新陆早系列图谱主要集中在“0，1”数据格式上，而缺乏直观性的图谱，这对于种子纯度鉴定，材料辨别的实际应用不便，而本专利通过相关的研究获得了能够鉴定新陆早系列材料的引物组合，并且将鉴定结果进行图示化和数字化，构建了各材料特有的图示化指纹图谱和数字身份证，这对于实际应用过程更加便利。本发明所绘制的指纹图谱和数字身份证可以作为鉴定试验所用材料的标准化图谱，采用所列引物组合对现有的新陆早系列品种进行鉴定可以达到有效鉴定和区分的效果。

其优点在于：

(1)与现有资料相比，本发明制备的指纹图谱更加直观化，更具有实用性；

(2)本发明获得新陆早系列品种各材料的身份证图谱都是唯一的，可以用于各材料的鉴定。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面 描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一种实施例中所采用的棉花品种及编号的对照表；

图2为本发明一种实施例中迁移距离与分子量的对照表；

图3为本发明一种实施例中41份新陆早系列材料的数字身份证图谱。

图4为本发明一种实施例中电泳条带迁移距离与DNA分子量对数关系图；

图5为本发明一种实施例中采用41份新陆早系列材料的图示化指纹图谱；

图6为本发明一种实施例中棉花品种指纹图谱及数字化身份证的建立方法的流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参考图1至图3以及图4至图6，其中，图1为本发明一种实施例中所采用的棉花品种及编号的对照表；图2为本发明一种实施例中迁移距离与分子量的对照表；图3为本发明一种实施例中41份新陆早系列材料的数字身份证图谱。图4为本发明一种实施例中电泳条带迁移距离与DNA分子量对数关系图；图5为本发明一种实施例中采用41份新陆早系列材料的图示化指纹图谱；图6为本发明一种实施例中棉花品种指纹图谱及数字化身份证的建立方法的流程图。

本发明提供了一种棉花品种指纹图谱及数字化身份证的建立方法，包括步骤：

S1、样本制备：提供棉花品种并对不同品种的棉花进行编号，并制表以便于后续数据的处理与溯源；

S2、基因组DNA的提取和检测：将上述提供的不同品种的棉花进行分组，每组实验材料随机连续选取10株，采集顶尖叶芽混合提取基因组DNA，提取 方法参照Paterson等的方法，采用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量和浓度，-20℃保存备用；

S3、SSR-PCR分析：引物来自于CMD和相应的参考资料，PCR反应体系为20ul，其中各成分为：10×Buffer(含Mg2+)2.0ul，dNTP 0.4ul，引物2ul，5U Taq DNS聚合酶0.2ul，模板DNA2ul，其余用ddH2O补充至20ul；

扩增程序为：95℃预变性3min，94℃变性50s，55℃复性45s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸7min，4℃保存，PCR反应在Bio-Rad PCR仪中进行，扩增产物先在2.5％的琼脂糖凝胶上进行初步筛选，效果较好的再在6％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，银染显色，相机拍照、保存和计数；

S4、数据统计：依据SSR扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，在相同迁移位置上有带的记为“1”，无带的记为“0”；

S5、指纹图谱的构建：根据扩增结果及分子量Marker的片段大小，估算条带的大小，构建全部的棉花样品的DNA分子指纹图谱及数字化身份证；

其具体方法为：根据分子量Marker的片段大小的对数值与电泳迁移距离绘制DNA分子量标准曲线图，然后用直尺量出每个扩增片段在胶板上的迁移距离，依据DNA分子量标准曲线图计算出每个片段的分子量，同时根据“0，1”数据绘制标准化的指纹图谱，记为“0”的用白色空格表示，记为“1”的用黑色空格表示；

S6、数字身份证的构建：为了提高DNA指纹身份证的实用性和参考价值，将图示化指纹图谱进一步数字化，选用多组数据构成每个品种的数字身份证，其中一组为实验样品名称，另外多组书记表示所用的核心鉴定引物及扩增片段的有无，表示为“引物1编号-0或1-引物2编号-0或1-......-引物7编号-0或1”；

S7、品种鉴定：采用上述方法给出的实验操作方法及引物，进行相应的扩增，数据统计，将统计的数据与本专利给出的指纹图谱及数字身份证即可得到鉴定结果。

优选地，所述棉花品种选用的是新陆早系列棉花样品。

采用上述方法制备指纹图谱及数字化身份证，与现有相关图谱相比，对现有的相关研究进行分析发现现有的新陆早系列图谱主要集中在“0，1”数 据格式上，而缺乏直观性的图谱，这对于种子纯度鉴定，材料辨别的实际应用不便，而本专利通过相关的研究获得了能够鉴定新陆早系列材料的引物组合，并且将鉴定结果进行图示化和数字化，构建了各材料特有的图示化指纹图谱和数字身份证，这对于实际应用过程更加便利。本发明所绘制的指纹图谱和数字身份证可以作为鉴定试验所用材料的标准化图谱，采用所列引物组合对现有的新陆早系列品种进行鉴定可以达到有效鉴定和区分的效果。

其优点在于：

(1)与现有资料相比，本发明制备的指纹图谱更加直观化，更具有实用性；

(2)本发明获得新陆早系列品种各材料的身份证图谱都是唯一的，可以用于各材料的鉴定。

上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (2)

1.一种棉花品种指纹图谱及数字化身份证的建立方法，其特征在于，包括：

步骤一、提供棉花品种并对不同品种的棉花进行编号，并制表以便于后续数据的处理与溯源；

步骤二、基因组DNA的提取和检测：将上述提供的不同品种的棉花进行分组，每组实验材料随机连续选取10株，采集顶尖叶芽混合提取基因组DNA，提取方法参照Paterson等的方法，采用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量和浓度，-20℃保存备用；

步骤三、SSR-PCR分析：引物来自于CMD和相应的参考资料，PCR反应体系为20ul，其中各成分为：10×Buffer(含Mg2+)2.0ul，dNTP 0.4ul，引物2ul，5U Taq DNS聚合酶0.2ul，模板DNA2ul，其余用ddH2O补充至20ul；

扩增程序为：95℃预变性3min，94℃变性50s，55℃复性45s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸7min，4℃保存，PCR反应在Bio-Rad PCR仪中进行，扩增产物先在2.5％的琼脂糖凝胶上进行初步筛选，效果较好的再在6％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，银染显色，相机拍照、保存和计数；

步骤四、数据统计：依据SSR扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，在相同迁移位置上有带的记为“1”，无带的记为“0”；

步骤五、指纹图谱的构建：根据扩增结果及分子量Marker的片段大小，估算条带的大小，构建全部的棉花样品的DNA分子指纹图谱及数字化身份证；

其具体方法为：根据分子量Marker的片段大小的对数值与电泳迁移距离绘制DNA分子量标准曲线图，然后用直尺量出每个扩增片段在胶板上的迁移距离，依据DNA分子量标准曲线图计算出每个片段的分子量，同时根据“0，1”数据绘制标准化的指纹图谱，记为“0”的用白色空格表示，记为“1”的用黑色空格表示；

步骤六、数字身份证的构建：为了提高DNA指纹身份证的实用性和参考价值，将图示化指纹图谱进一步数字化，选用多组数据构成每个品种的数字身份证，其中一组为实验样品名称，另外多组数据表示所用的核心鉴定引物及扩增片段的有无，表示为“引物1编号-0或1-引物2编号-0或1-... ...-引物7编号-0或1”；

步骤七、品种鉴定：采用上述方法给出的实验操作方法及引物，进行相应的扩增，数据统计，将统计的数据与本专利给出的指纹图谱及数字身份证即可得到鉴定结果。

2.根据权利要求1所述的棉花品种指纹图谱及数字化身份证的建立方法，其特征在于，

所述棉花品种选用的是新陆早系列棉花样品。