CN105132551A - 一种利用ssr分子标记筛选小麦近似品种的方法 - Google Patents

一种利用ssr分子标记筛选小麦近似品种的方法 Download PDF

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孙加梅
王东建
李华
仙丽娜
王雪梅
王秀娟
王伟
王穆穆
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Abstract

本发明公开了一种利用SSR分子标记筛选小麦近似品种的方法。它首先提取供试品种DNA；然后利用如序列表SEQ？ID？No.1～42所示的21对基本核心SSR荧光标记引物和如序列表SEQ？ID？No.43～84所示的21对扩展核心SSR荧光标记引物分别对供试品种模板DNA进行PCR扩增；PCR产物经电泳检测采集数据；然后利用PowerMarker对采集的数据进行分析得到品种之间的遗传距离，遗传距离小于0.2的判定为近似品种。该方法提高了试验精确度，降低了试验成本。

Description

一种利用SSR分子标记筛选小麦近似品种的方法
技术领域
本发明涉及一种筛选小麦近似品种的方法，属于农业的小麦育种与应用技术领域。
背景技术
小麦属于禾本科的小麦属，它是世界上最早栽培的农作物之一。我国于1997年开始实施植物新品种保护制度。根据中国《植物新品种保护条例》规定，植物新品种必需具备特异性，一致性和稳定性(简称DUS)才能授予品种权。近年来，随着中国植物育种者品种权意识的不断增强，申请保护的植物新品种数量逐年增长。不仅如此，农业部《主要农作物品种审定办法》要求，申请审定的小麦品种必须具备特异性，一致性和稳定性。
特异性测试是DUS测试的重点和难点。特异性是指申请品种应当明显区别于申请日以前所有已知的同属或同种品种。为鉴定一个小麦品种具备特异性，需要证明该品种不同于已知的每个小麦品种。已知的小麦品种数以万计，将每一个申请DUS测试的品种(“申请品种”)与这些品种进行田间种植比较，实践上是不可行的。为此，需要通过一些筛选机制将那些不需要种植即可知道与申请品种明显不同的品种排除，只种植那些不确定与申请品种是否有明显差异的品种，即近似品种。因此，近似品种的选择又是特异性测试的关键环节。
目前，近似品种的筛选主要通过已知品种的地理来源、类型和分组性状进行。测试机构首先建立已知品种的表型性状数据库，利用品种地理来源、品种类型和分组性状逐个排除差异明显的品种，最后筛选出近似品种。该方法的有以下几个缺点：(1)小麦已知品种数量众多，品种类型和分组性状少，育成品种相似度高，大量申请品种筛选出几十甚至上百个近似品种，降低了试验精确度，加大了试验成本；(2)测试机构需要事先知道申请品种的分组性状数据，往往申请人不能提供准确的分组性状数据，导致近似品种筛选错误，测试机构需要另外耗费一个生长周期的时间采集分组性状数据，消耗大量的时间，劳力和财力。
本发明申请人自己的专利201310119954.X公开了一种小麦SSR指纹图谱构建方法，该专利的主要目的是利用25对荧光标记引物构建指纹图谱，然后根据品种间差异位点数来鉴定是否是相似品种。申请人后续研究中发现采用上述方法鉴定近似品种存在以下问题有待进一步改进：(1)位点差异法不能精确描述品种间不同类型位点的遗传差异(例如，一个杂合位点与纯合位点间的位点差异与两个纯合位点间的差异，使用位点差异时是相同的)；(2)位点差异法的判定为：品种间差异位点数<3为近似品种；因此位点差异法对分子数据的准确性要求极高，在实践中需要大量投入才能达到；(3)同时该专利中采用的分子标记数偏少，用其进行筛选近似品种准确性差。
发明内容
本发明克服了上述现有技术的不足，提供了一种利用SSR分子标记筛选小麦近似品种的方法。该方法在小麦每对染色体上选用2个SSR分子标记，共选用了42个分子标记，根据遗传距离来筛选近似品种，该方法高效、准确。
本发明的技术方案是：一种利用SSR分子标记筛选小麦近似品种的方法，其特征是，
(1)提取供试品种DNA；
(2)用21对基本核心SSR荧光标记引物和21对扩展核心SSR荧光标记引物分别对供试品种模板DNA进行PCR扩增；
所述21对基本核心SSR荧光标记引物为Xgwm357-1A、Xbarc61-1B、Xgdm111-1D、Xbarc5-2A、Xgwm429-2B、Xcau15-2D、Xgwm155-3A、Xcau5-3B、Xgwm161-3D、Xgwm610-4A、Xgwm513-4B、Xcfd84-4D、Xcfa2155-5A、Xbhw129-5B、Xcfd8-5D、Xgwm570-6A、Xbarc14-6B、Xcfd76-6D、Xgpw2269-7A、Xwmc73-7B、Xgwm428-7D，其核苷酸序列依次如序列表SEQIDNo.1～42所示；
所述21对扩展核心SSR荧光标记引物为Xcfa2153-1A、Xbarc81-1B、Xcfd28-1D、Xgwm445-2A、Xbarc7-2B、Xgwm296-2D、Xgwm2-3A、Xgwm566-3B、Xgwm341-3D、Xcau2-4A、Xgwm495-4B、Xbarc105-4D、Xbarc1-5、Xbarc4-5B、Xgdm43-5D、Xgwm617-6A、Xgwm219-6B、Xcfd33-6D、Xcfa2123-7A、Xgwm344-7B、Xgwm44-7D；其核苷酸序列依次如序列表SEQIDNo.43～84所示。
(3)PCR产物经电泳检测采集数据；
(4)利用PowerMarker对采集的数据进行分析得到品种之间的遗传距离，遗传距离小于0.2的判定为近似品种。
上述步骤(1)-(3)的具体步骤同专利201310119954.X。
本发明的有益效果是：(1)本发明利用42对分子标记引物对小麦品种进行扩增、分析得到大量的分子数据，分别计算品种两两之间的分子距离。两者相比较，当遗传距离≥0.2时，所有成对品种之间都有明显差异，最终确定与申请品种的遗传距离小于0.2的已知品种为近似品种，这样只把遗传距离小于0.2的品种在田间种植，减少了大量的时间，劳力和财力；提高了试验精确度，降低了试验成本；(2)与专利201310119954.X采用位点差异筛选近似品种相比，分子距离法选用的阈值更为宽松，同时不会大量增加近似品种的数量；因选用的分子距离阈值足够大，可以允许一定程度的分子数据错误的存在，而不影响特异性测试结果；(3)小麦共有3个基因组21对染色体，为了更好的代表小麦品种间的遗传变异，选用的SSR分子标记尽可能的均匀分布到不同的染色体组上，本发明在小麦每对染色体上选用2个SSR分子标记；分子标记的数量多，分布均匀，对染色体覆盖更完整，更好的反映品种间的遗传变异差异；本发明基于本发明42个分子标记计算出的遗传距离和品种间的表型距离相关性更强，更有利于近似品种筛选的准确性，严谨性；筛选结果更可靠；筛选出的近似品种数量更少；进一步降低了特异性测试的成本；提高了实验的精确度。
具体实施方式
1、提取供试品种样品的DNA
采用CTAB法提取供试品种(如表1所示的36份申请品种和如表2所示的99份已知品种)的DNA，提取方法同专利201310119954.X。
表136份申请品种
表299份已知品种
2、核心引物选择
小麦共有21对染色体，本发明在小麦每对染色体上选用2个SSR分子标记，共选用了42个分子标记；通过分析引物在染色体上的分布、多态性水平、PCR扩增稳定性和扩增产物带型，选择了能够同时满足普通变性胶电泳检测和毛细管荧光检测两种技术平台的引物共42对，作为小麦品种鉴定的核心引物(表3-4)。
表321对核心引物
3、利用42对SSR引物对供试品种进行PCR扩增
PCR扩增采用25μL的反应体系，含每种dNTP0.25mmol/L，正向引物、反向引物各0.4μmol/L，TaqDNA聚合酶1.0单位，1×PCR缓冲液(不含Mg2+)，MgCl21.5mmol/L，样品DNA10-40ng。反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，65℃退火45s，72℃延伸45s，每循环降1℃，共15个循环；94℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
4、毛细管电泳
将FAM和HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，TAMRA和ROX荧光标记的PCR产物稀释10倍。分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合，从混合液中吸取1μL加入到DNA分析仪专用深孔板孔中。板中各孔分别加入0.1μLLIZ500分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺。将样品在PCR仪上95℃变性5min，取出，立即置于碎冰上，冷却10min以上。瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上(ABI3730XL)。除待测样品外，每个SSR位点还应同时包括3～4个参照品种的扩增产物。
5、分析毛细管电泳结果
用GENEMAPPER进行图像分析和数据采集。以pBR322DNA/MspI为DNA分子量标准，根据参照品种的扩增片段大小，确定待测样品该位点的等位变异大小。纯合位点的等位变异记录为X/X，杂合位点的等位变异记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异片段大小，小片段在前，大片段在后，无效等位变异记录为0/0。得到136个品种分别采用42对引物PCR扩增产物的等位变异大小。
6、利用PowerMarker对采集的数据进行分析得到品种之间的遗传距离
(1)把上述步骤得到的数据转换成文本文档；
(2)导入数据
打开PowerMarker软件，Dataset---右键----import----Browse-----打开要聚类的txt文件，在ColumnDelimeters下选中Tab，Comma和Space三项-----next-----这时会看到Column和Type两列，点击Cloumn下的“DNA”(这时Type列的第一格为Marker)，再点一下Categorical(蓝色，带下划线)(这时Type列的第一格变成Categorical)。在右边的level-1column下选择“DNA”-----next------不修改-----next----不修改-----finish。到此，成功导入数据。
(3)数据导入成功后，点击Analysis-----summary------summarystatisticas----选择powermarker(导入时的文件名)----submit---分析结果弹出来----在结果的界面上双击，数据用excel打开。
(4)点击Analysis-----Phylogeny----computefrequency---选择powermarker(文件名)，option选择Computefrequencyatlevel-1---submit.(此步结果是为下一步服务)；
(5)Analysis-----Phylogeny----frequencybaseddistance----选择powermarker.Frequency，右边ChooseMethods选择Nei1973---submit计算出遗传距离保存到excel(表5)；
(6)根据表5中的数据，筛选出与申请品种遗传距离小于0.2的已知品种，即为该品种的近似品种(表6)。
表5遗传距离
续表5
续表5
表6筛选出的近似品种

Claims (1)

1.一种利用SSR分子标记筛选小麦近似品种的方法，其特征是，
(1)提取供试品种DNA；
(2)用21对基本核心SSR荧光标记引物和21对扩展核心SSR荧光标记引物分别对供试品种模板DNA进行PCR扩增；
所述21对基本核心SSR荧光标记引物为Xgwm357-1A、Xbarc61-1B、Xgdm111-1D、Xbarc5-2A、Xgwm429-2B、Xcau15-2D、Xgwm155-3A、Xcau5-3B、Xgwm161-3D、Xgwm610-4A、Xgwm513-4B、Xcfd84-4D、Xcfa2155-5A、Xbhw129-5B、Xcfd8-5D、Xgwm570-6A、Xbarc14-6B、Xcfd76-6D、Xgpw2269-7A、Xwmc73-7B、Xgwm428-7D，其核苷酸序列依次如序列表SEQIDNo.1～42所示；
所述21对扩展核心SSR荧光标记引物为Xcfa2153-1A、Xbarc81-1B、Xcfd28-1D、Xgwm445-2A、Xbarc7-2B、Xgwm296-2D、Xgwm2-3A、Xgwm566-3B、Xgwm341-3D、Xcau2-4A、Xgwm495-4B、Xbarc105-4D、Xbarc1-5、Xbarc4-5B、Xgdm43-5D、Xgwm617-6A、Xgwm219-6B、Xcfd33-6D、Xcfa2123-7A、Xgwm344-7B、Xgwm44-7D；其核苷酸序列依次如序列表SEQIDNo.43～84所示。
(3)PCR产物经电泳检测采集数据；
(4)利用PowerMarker对采集的数据进行分析得到品种之间的遗传距离，遗传距离小于0.2的判定为近似品种。
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