CN106244681A

CN106244681A - 一种利用基因组ssr和est‑ssr指纹图谱鉴别绿豆品种的方法及应用

Info

Publication number: CN106244681A
Application number: CN201610613942.6A
Authority: CN
Inventors: 陈红霖; 程须珍; 王丽侠; 王素华
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-07-28
Filing date: 2016-07-28
Publication date: 2016-12-21

Abstract

本发明提供一种利用基因组SSR和EST‑SSR指纹图谱鉴别绿豆品种的方法及应用，属于植物品种鉴别技术领域。本发明提供5对基因组SSR和5对EST‑SSR引物组成的标记组合，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑20所示，进而构建了30种绿豆的指纹图谱，根据该图谱，采用本发明提供的标记组合可在4小时之内即可完成绿豆种子品种鉴定与遗传多样性评价工作，具有高效、准确、低成本、操作简便的优点。本发明的方法可以对绿豆种子真伪进行有效监控，从DNA水平揭示品种的遗传变异与亲缘关系，保护了作物品种，防止假冒伪劣品种进入市场，也为绿豆品种选育过程中优异种质的合理利用提供了技术支持，具有良好的应用前景。

Description

一种利用基因组SSR和EST-SSR指纹图谱鉴别绿豆品种的方法及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和植物品种鉴别技术领域，特别是涉及一种利用基因组SSR和EST-SSR指纹图谱鉴别绿豆品种的方法及应用。

背景技术

绿豆(Vigna radiata(Linn.)Wilczek.)，属于豆科，在中国已有两千年的栽培史。是我国重要的粮食作物。因其具有重要的营养价值和医用价值，现已作为重要的功能型食品进行开发。近年来，随着种植业结构的调整和人们膳食结构的改变，人们对绿豆的需求量日益增加，种植面积逐年扩大。研究表明病虫害严重影响绿豆种子萌发和产量等方面。鉴于此，深入研究抗虫绿豆品种中参与抗虫的基因及抗虫机理，对筛选抗虫能力较强的优势品种及抗虫育种材料的筛选具有十分重要的意义。

由于地域间引种利用，绿豆品种同种异名现象十分严重，地方品种遗传相似性高，传统的形态学和细胞学鉴定方法很难做到准确而真实的鉴定绿豆的品种差别，为此需要在分子水平上进行分析鉴定。

DNA指纹图谱能够从DNA水平上鉴定出品种间的差异或遗传相似性。而微卫星(又称为简单重复序列，SSR)是由1-6个核苷酸组成的短序列串联重复多次而组成的一段DNA。由于微卫星中重复单元的重复次数不同，因而扩增出的微卫星序列的长度呈现多态性。微卫星序列具有多态性较高，重复性和稳定性好等特点，是十分有效的分子标记，被广泛应用于品种鉴定、指纹图谱构建等领域。为了有效保护我国绿豆的品种知识产权，有必要在我国开展绿豆开发微卫星标记开发，并应用于绿豆优良品种“分子身份证”构建的研究。SSR根据序列来源一般分为基因组gSSR(genomic SSR)和EST-SSR(eSSR)两种。EST-SSR是基于表达序列标签开发微卫星的一种新型分子标记，与基因组SSR相比，EST-SSR具有在植物物种之间可转移性的优点。目前，EST-SSR被广泛应用于植物基因组学研究如遗传图谱构建、比较作图、遗传多样性评价、种质鉴定、系统发育与进化研究等方面。

目前常用的栽培绿豆品种鉴定方法主要有：1、表型性状鉴定法：该方法通过不同品种间表型性状差异对不同品种进行鉴定，虽然比较直观、快捷，但对表型性状相近的品种则无法鉴定；2、DNA分子标记法：该方法利用各类DNA分子标记在基因水平上对不同品种进行鉴定，其中SSR分子标记因其具有共显性、多态性高、扩增稳定、快速经济等特点而应用最为普遍，目前已公布绿豆EST-SSR分子标记数达到了13134对。如何有效地利用这些分子标记实现对绿豆品种的高效稳定鉴定是现有技术亟待解决的问题

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效、准确、低成本的利用基因组SSR和EST-SSR指纹图谱鉴别绿豆品种的方法。本发明的目的还在于提供该方法的应用。

为实现上述目的，本发明以30份代表性绿豆品种基因组DNA为模板，通过分析绿豆基因组序列和EST序列，合成核心基因组SSR和EST-SSR引物。经过筛选，分别有5对基因组SSR和5对EST-SSR引物组成的分子标记组合可完全鉴别30份绿豆品种的差异。

所述的30份代表性绿豆品种分别为：嫩绿1号，保942-40-2，安9910，兴绿1号，安05-4，保9815-36，潍8901-32，郑绿8号，豫绿1号，鄂绿1号，豫绿4号，中绿3号，保861-10-6，冀绿1号，中绿5号，白绿6号，安黑绿1号，保865-18-9，吉绿4号，吉绿9346，冀绿9239，晋绿豆2号，辽绿6号，苏绿1号，苏绿3号，洮绿3号，豫绿5号，郑绿5号，鄂绿2号和辽绿27号。

筛选上述引物的方法为：

步骤一，初筛引物：筛选出在不同绿豆品种间具有多态性、带型清晰且能够稳定重复的SSR初筛引物；

步骤二，复筛引物：利用PowerMarker和Popgen软件计算在步骤一获得的SSR初筛引物的等位基因数(Na)，多态性信息量(PIC)和Shannon信息指数(I)，筛选出在绿豆品种间多态性信息含量值最高、等位位点数最多、重复性好、扩增带型清晰度搞、染色体分布均匀的SSR引物作为绿豆品种指纹图谱库构建的核心引物。

基于上述筛选方法，本发明提供5对基因组SSR和5对EST-SSR引物组成的标记组合的核心引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-20所示。

即所述5个SSR分子标记通过以下引物对扩增得到：SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10所示的引物；所述5个EST-SSR分子标记通过以下引物对扩增得到：SEQ ID NO.11-12、SEQ ID NO.13-14、SEQ ID NO.15-16、SEQ IDNO.17-18、SEQ ID NO.19-20所示的引物。

含有上述分子标记组合的试剂盒也属于本发明的保护范围。

本发明提供了上述分子标记组合或含有其的试剂盒在鉴定绿豆品种中的应用。

本发明提供了上述分子标记组合或含有其的试剂盒在构建绿豆品种特征指纹图谱中的应用。

本发明提供了上述分子标记组合或含有其的试剂盒在绿豆种质资源改良或育种中的应用。

本发明提供一种绿豆品种特征指纹图谱，以上述的分子标记组合对不同绿豆品种的DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，银染显色，根据标准DNA分子量和引物的迁移率记录电泳结果，依据扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，在相同迁移位置上有带的记为“1”，无带的记为“0”，建立SSR基因型信息数据，按照引物顺序进行编码，得到的指纹代码即为绿豆品种的特征指纹图谱。

在本发明的实施例中，通过本发明的分子标记组合进行PCR扩增后，根据上述判断方法，获得了30种绿豆品种的特征指纹图谱如下：

本发明提供了上述绿豆品种特征指纹图谱在绿豆种质资源改良或育种中的应用。

进一步地，本发明提供一种鉴定绿豆品种的方法，包括如下步骤：

(1)提取待检绿豆品种的DNA，以本发明筛选得到的分子标记组合中的10对引物对分别对待检绿豆品种的DNA进行PCR扩增；

(2)扩增产物通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，银染显色，根据扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，在相同迁移位置上有带的记为“1”，无带的记为“0”，按照引物顺序进行编码，将得到的指纹代码与上述的绿豆品种的特征指纹图谱进行比对，确定待测绿豆品种。

本发明鉴定绿豆品种的方法中，步骤(1)的PCR，其20μL反应体系：DNA模板0.8μL，上下游引物各10pmol L^-1 0.2μL，10×PCR不含Mg²⁺的buffer 2μL，25mmol L^-1Mg²⁺1.2μL，10mmol L^-1的dNTP 0.5μL，5UμL^-1的Taq酶0.2μL，ddH₂O 14.9μL；

PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，51-60℃退火45s，72℃延伸45s，进行32-35个循环，最后72℃延伸5min。

优选地，退火温度为55℃，循环次数为33次。

其中，步骤(2)采用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，200V稳压电泳2-2.5h，至加样缓冲液移到凝胶底部时电泳结束。

本发明提供了上述方法在绿豆种质资源改良中的应用。

本发明绿豆DNA指纹图谱的构建方法，利用了SSR引物对某一绿豆品种DNA进行扩增，得到一个特定的指纹，而一组SSR引物对该特定的品种进行DNA扩增就会使该品种将可能会得到一组特有的DNA指纹，于是本发明方法采用引物组合鉴别的方法对引物进行再次分析和筛选，使每一个品种都找到了它特有的DNA指纹。本发明是基于SSR分子标记鉴定法建立的，利用均匀分布在栽培绿豆染色体组、多态性好、PCR扩增稳定的10对SSR引物组成的一套引物对不同栽培绿豆品种进行鉴定的技术体系，本发明的SSR和EST-SSR引物的扩增产物带型间大小差异明显，能够很好的区分不同的品种。对同一品种内的个体间的扩增产物，其带型一致。本发明的检测方法在4小时之内即可完成绿豆种子品种鉴定与遗传多样性评价工作，具有高效、准确、低成本、操作简便等优势。同时本发明的检测方法可以有效的对绿豆种子真伪进行监控，从DNA水平揭示品种的遗传变异与亲缘关系，保护了作物品种，防止假冒伪劣品种进入市场，也为绿豆品种选育过程中优异种质的合理利用提供了技术参考。

附图说明

图1为30份代表性绿豆品种聚类分析结果图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。

实施例1用于鉴定绿豆品种的SSR和EST-SSR引物的筛选

本实施例以我国绿豆主产区代表性推广的30个绿豆品种(来源于国家农作物种质资源保存中心)基因组DNA为模板，通过分析绿豆基因组序列和EST序列，合成核心基因组SSR和EST-SSR引物。经过筛选，分别有5对基因组SSR和5对EST-SSR引物组成的分子标记组合可完全鉴别30份绿豆品种的差异。

30份代表性绿豆品种分别为：嫩绿1号，保942-40-2，安9910，兴绿1号，安05-4，保9815-36，潍8901-32，郑绿8号，豫绿1号，鄂绿1号，豫绿4号，中绿3号，保861-10-6，冀绿1号，中绿5号，白绿6号，安黑绿1号，保865-18-9，吉绿4号，吉绿9346，冀绿9239，晋绿豆2号，辽绿6号，苏绿1号，苏绿3号，洮绿3号，豫绿5号，郑绿5号，鄂绿2号和辽绿27号。

筛选上述引物的方法为：

步骤一，初筛引物：分别筛选出中绿3号，中绿5号，白绿6号，晋绿豆2号，辽绿6号，苏绿1号，苏绿3号，郑绿5号8个不同绿豆品种间具有多态性丰富、等位变异间易于区分、带型清晰且能够稳定重复的SSR初筛引物；

步骤二，复筛引物：利用PowerMarker和Popgen软件计算引物位点的等位基因数(Na)，多态性信息量(PIC)和Shannon信息指数(I)，筛选出在绿豆品种间多态性信息含量值最高、等位位点数最多、重复性好、扩增带型清晰度搞、染色体分布均匀的SSR引物作为绿豆品种指纹图谱库构建的核心引物。

最终筛选得到5对基因组SSR分子标记和5对EST-SSR分子标记。

表1 10对SSR核心引物表(Mg代表基因组SSR，Me代表EST-SSR)

上述表1的引物分别对应5个SSR分子标记：SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQID NO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10所示的引物；5个EST-SSR分子标记：SEQ IDNO.11-12、SEQ ID NO.13-14、SEQ ID NO.15-16、SEQ ID NO.17-18、SEQ ID NO.19-20所示的引物。

实施例2绿豆品种特征指纹图谱的构建与绿豆品种鉴定方法的建立

1、绿豆品种总DNA提取

将绿豆种植于土壤中，室温培养，长出两周后取绿豆幼叶在液氮冷冻后于-80℃保存备用。取各品种绿豆幼嫩的叶片0.2g于1.5mL离心管中，加入液氮研磨成粉末。采用CTAB法提取DNA，操作实验步骤按照试剂盒说明书进行。用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测总DNA的质量，然后将总DNA稀释成100ng/μL，储存于-20℃备用。

2、以实施例1所述30份绿豆品种为材料，利用实施例1筛选得到的5对基因组SSR分子标记和5对EST-SSR分子标记合成的SSR引物分别对实施例1所述的30份代表性绿豆品种的DNA进行PCR扩增，PCR反应试验中采用的PCR反应体系为20μL体系：DNA模板0.8μL，上下游引物各10pmol L^-1 0.2μL，10×PCR buffer(不含Mg²⁺)2μL，Mg²⁺(25mmol L^-1)1.2μL，dNTP(10mmol L^-1)0.5μL，Taq酶(5UμL^-1)0.2μL，ddH₂O 14.9μL，总计20.0μL。

PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，51-60℃退火45s，72℃延伸45s，进行32-35个循环，最后72℃延伸5min。本实施例优化条件参数发现，退火温度55℃，循环33次，可以达到最佳综合检测效果。

凝胶电泳及银染显色：扩增产物采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色，照相记录。

3、绿豆品种DNA特征指纹图谱的构建

根据DNA分子量标准和引物的迁移率记录结果，依据SSR扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，在相同迁移位置上有带的记为“1”，无带的记为“0”，建立实施例1所述30份绿豆品种SSR基因型信息数据库，按照引物顺序进行编码，得到的指纹代码即为该品种的指纹图谱，见表2。

表2利用10对SSR引物构建30个代表性推广绿豆品种的指纹信息

利用PowerMarker和Popgen软件计算引物位点的等位基因数(Na)、基因多样性指数(He)、多态性信息量(PIC)和Shannon信息指数(I)。表3为10对SSR引物对30份绿豆品种基因多样性分析结果，在30份绿豆品种中，10个SSR标记共检测出39个等位基因，每个位点检测出等位基因数至多为7个，平均每个位点3.9个。引物的多态性信息量(PIC)变化范围是0.3092～0.6606，平均为0.4666，Shannon信息指数(I)变化范围是0.6109～1.4745，平均为0.9498。

表3 10对SSR引物对30份绿豆品种基因多样性分析结果

利用PowerMarker计算出30个绿豆品种间的遗传距离，见表4-表7。结果显示各品种间遗传距离在0.5385-0.9487之间，30个绿豆品种的平均遗传距离为0.7208，选用的引物均有良好的多态性及鉴别能力，能有效区分30个绿豆品种。

表4绿豆品种间的遗传相似系数(1)

表5绿豆品种间的遗传相似系数(2)

表6绿豆品种间的遗传相似系数(3)

表7绿豆品种间的遗传相似系数(4)

4、鉴定绿豆品种方法的建立

(1)提取待检绿豆品种的DNA，以本发明实施例1筛选得到的分子标记组合中的10对引物对分别对待检绿豆品种的DNA进行PCR扩增；20μL PCR反应体系：DNA模板0.8μL，上下游引物各10pmol L^-10.2μL，10×PCR不含Mg²⁺的buffer 2μL，25mmol L^-1Mg²⁺1.2μL，10mmolL^-1的dNTP 0.5μL，5UμL^-1的Taq酶0.2μL，ddH₂O 14.9μL；

PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，进行33个循环，最后72℃延伸5min。

(2)采用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，200V稳压电泳2-2.5h，至加样缓冲液移到凝胶底部时电泳结束。根据扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，在相同迁移位置上有带的记为“1”，无带的记为“0”，按照引物顺序进行编码，将得到的指纹代码与上述的绿豆品种的特征指纹图谱进行比对，确定待测绿豆品种。

实施例3本发明鉴定绿豆品种方法的应用

提取中绿3号和中绿5号叶片的DNA。以本发明实施例1筛选得到的分子标记组合中的10对引物分别对待检绿豆品种的DNA进行PCR扩增；参照本发明实施例2的PCR反应体系，PCR反应程序，聚丙烯酰胺凝胶电泳和条带记录的方法，将得到的指纹代码与上述的绿豆品种的特征指纹图谱进行比对，发现中绿3号的指纹代码为000010000100000100001010010001000100101，中绿5号的指纹代码为000010000100000100100010010001010000101，与表2中绿3号和中绿5号的指纹代码相同，说明应用本发明实施例2提供的鉴别绿豆品种的方法准确性较高，适合推广使用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种用于鉴别绿豆品种的分子标记组合，其特征在于，含有5个SSR分子标记和5个EST-SSR分子标记，

所述5个SSR分子标记通过以下引物对扩增得到：SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQID NO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10所示的引物；

所述5个EST-SSR分子标记通过以下引物对扩增得到：SEQ ID NO.11-12、SEQ IDNO.13-14、SEQ ID NO.15-16、SEQ ID NO.17-18、SEQ ID NO.19-20所示的引物。

2.含有权利要求1所述分子标记组合的试剂盒。

3.权利要求1所述的分子标记组合或权利要求2所述的试剂盒在鉴定绿豆品种中的应用。

4.权利要求1所述的分子标记组合或权利要求2所述的试剂盒在构建绿豆品种特征指纹图谱中的应用。

5.一种绿豆品种特征指纹图谱，其特征在于，以权利要求1所述的分子标记组合对不同绿豆品种的DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，银染显色，根据标准DNA分子量和引物的迁移率记录电泳结果，依据扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，在相同迁移位置上有带的记为“1”，无带的记为“0”，建立SSR基因型信息数据，按照引物顺序进行编码，得到的指纹代码即为绿豆品种的特征指纹图谱。

6.如权利要求5所述的绿豆品种特征指纹图谱，其特征在于，30种绿豆品种的特征指纹图谱如下：

7.一种鉴定绿豆品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待检绿豆品种的DNA，以权利要求1所述的分子标记组合中的10对引物对分别对检绿豆品种的DNA进行PCR扩增；

(2)扩增产物通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，银染显色，根据扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，在相同迁移位置上有带的记为“1”，无带的记为“0”，按照引物顺序进行编码，将得到的指纹代码与权利要求5或6所述的绿豆品种的特征指纹图谱进行比对，确定待测绿豆品种。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)的PCR，其20μL反应体系：DNA模板0.8μL，上下游引物各10pmol L^-1 0.2μL，10×PCR不含Mg²⁺的buffer 2μL，25mmol L^-1Mg²⁺1.2μL，10mmol L^-1的dNTP0.5μL，5UμL^-1的Taq酶0.2μL，ddH₂O 14.9μL；

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，步骤(2)采用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，200V稳压电泳2-2.5h，至加样缓冲液移到凝胶底部时电泳结束。

10.权利要求1所述的分子标记组合或权利要求2所述的试剂盒或权利要求5或6所述的绿豆品种特征指纹图谱或权利要求7-9任一所述的方法在绿豆种质资源改良中的应用。