CN109868328B - 鉴定紫斑牡丹品种的ssr分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物分子标记辅助育种技术领域，具体涉及鉴定紫斑牡丹品种的SSR分子标记及应用。本发明提供用于鉴定紫斑牡丹品种的包括12个EST‑SSR分子标记的SSR分子标记组合以及如SEQ ID NO.1～24所示的对应的引物组合。在此基础上，本发明建立了264个紫斑牡丹品种的分子身份证和鉴定牡丹品种的方法，该方法具有分辨力高、灵敏度好、结果可靠准确、高效快速等优点，能够准确快速地将264个不同的紫斑牡丹品种进行区分，确定待测紫斑牡丹的品种，实现了高效、低成本、操作方便的紫斑牡丹品种鉴定，可用于紫斑牡丹品种分子身份证构建、品种鉴定及遗传多样性分析等，应用前景十分广阔。
Description
技术领域
本发明涉及植物分子标记辅助育种技术领域，具体涉及鉴定紫斑牡丹品种的SSR分子标记及应用。
背景技术
牡丹(Paeonia sect.Moutan)花大色艳，深受世界人民喜爱，是中国的传统名花。目前，全世界约有牡丹品种2000多个，约17个品种群(Cheng，2007)，中国作为牡丹的原产地，有1600多年的栽培与育种历史，积累了大量的优良栽培品种，现有栽培品种1000多个，主要有中原、西北、江南、西南四个大的栽培品种群。紫斑牡丹(Paeonia rockii)品种群也叫西北牡丹品种群，因花瓣基部有一个明显的紫斑而闻名，具有重要的观赏价值和药用价值。据不完全统计，紫斑牡丹品种数量大概在300个左右(陈德忠，2003；成仿云，2005；李嘉珏，2005)。其品种群数量仅次于中原牡丹品种群，是中国牡丹第二大品种群(李嘉珏，1998)。自2011年国家卫生部正式批准牡丹籽油作为新资源食品以后，紫斑牡丹作为木本油料作物也受到了高度重视(史国安，2014)。稳定准确的品种资源是保证紫斑牡丹产业的发展的基础。但是，目前紫斑牡丹品种名称十分混乱，同物异名以及同名异物现象严重，十分不利于紫斑牡丹的推广应用(成仿云，2005)。
DNA(Deoxyribonucleic acid)分子标记是以遗传物质核苷酸序列变异为基础的遗传标记，反映了个体在DNA水平上的遗传变异，能稳定遗传(张德强等，2000)。与传统的形态学标记、生物化学标记相比，分子标记具有以下优势：(1)在生物体的不同部位、不同发育时期都能检测出来，不受环境的影响；(2)不同个体变异丰富，多态性高；(3)标记类型丰富，数量多；(4)大多数标记为共显性，能有效区分纯合体和杂合体。在观赏植物中，研究人员已经利用SRAP、RAPD、CDDP、SSR等标记构建了绣线菊属(Spiraea)(刘慧民等，2009)、中原牡丹(Paeonia suffruticosa)(李莹莹，2013)、百合属(Lilium)(徐雷锋等，2014)、兰属(Cymbidium)(唐源江等，2015)、芍药组(Sect.Paeonia)(张建军等，2015；张嘉等，2016；万映伶等，2018)、莲属(Nelumbo)(薛建华，2016)等的分子身份证。传统的紫斑牡丹品种鉴定主要根据花型、花色、叶型、叶色等形态特征或农艺性状进行鉴定，主要测试品种的特异性、一致性和稳定性。这种表型鉴定方法一般只适用于那些表型差异较大的品种，而且极易受到环境影响。目前，形态特征鉴别是区分紫斑牡丹品种最直观的方法，但这种方法通常只能在花期进行，而且常常因为主观原因产生误判，鉴定效率较低。而且关于分子标记鉴定紫斑牡丹品种的体系尚待完善，紫斑牡丹品种分子身份证的构建尚未见报道，因此，通过利用分子标记建立的紫斑牡丹品种唯一的分子身份证来鉴定花色花型相近的品种是十分必要的。与其他的分子标记相比，SSR分子标记检测具有灵敏度高、数量丰富、多态性高、共显性、重复性好和操作简单等特点，是用来鉴定紫斑牡丹品种的理想标记。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供用于紫斑牡丹品种鉴定的SSR分子标记组合以及鉴定紫斑牡丹品种的方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
首先，本发明从牡丹的第一张高密度遗传图谱(Cai，2015；吴静，2016)的5个连锁群上选取全部的72对EST-SSR，合成对应的普通引物后，以随机选取的6个紫斑牡丹的基因组DNA作为模板DNA采用这72对EST-SSR引物进行扩增，扩增产物使用6％变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染方法进行分析，最终筛选出多态性丰富的34个EST-SSR，作为用于紫斑牡丹品种鉴定的初步筛选SSR组合。在此基础上，以264个紫斑牡丹品种作为供试材料，以所有供试材料的基因组DNA为模板采用34个EST-SSR对应的引物进行PCR扩增，扩增结果进行测序检测，得到每个品种在每个SSR位点的毛细管电泳图。采用GeneMarker V2.2.0对毛细管电泳图进行数据分析，得到每个紫斑牡丹品种在每个SSR位点的带型，基于最少引物鉴定最多品种的原则，在上述34个SSR分子标记组合中进一步筛选获得能够覆盖264个紫斑牡丹品种多态性的最少数量的SSR分子标记组合，包括12个SSR分子标记。另一方面，根据上述获得的264个品种在12个SSR的每个SSR位点的扩增片段大小进行排序，依次赋值，将每个品种的12个赋值按顺序串联，最终得到264个紫斑牡丹品种的分子身份证。
具体地，本发明提供鉴定紫斑牡丹品种的SSR分子标记组合，包括如下EST-SSR分子标记：GBGY01000096、GBGY01000354、GBGY01000168、GBGY01000120、GBGY01000272、GBGY01000068、GBGY01000365、GBGY01000074、GBGY01000160、GBGY01000223、GBGY01000161、GBGY01000189。
上述EST-SSR分子标记可采用如下引物对扩增得到：
GBGY01000096：SEQ ID NO.1-2；GBGY01000354：SEQ ID NO.3-4；GBGY01000168：SEQ ID NO.5-6；GBGY01000120：SEQ ID NO.7-8；GBGY01000272：SEQ ID NO.9-10；GBGY01000068：SEQ ID NO.11-12；GBGY01000365：SEQ ID NO.13-14；GBGY01000074：SEQ IDNO.15-16；GBGY01000160：SEQ ID NO.17-18；GBGY01000223：SEQ ID NO.19-20；GBGY01000161：SEQ ID NO.21-22；GBGY01000189：SEQ ID NO.23-24。
针对EST-SSR分子标记，本发明提供鉴定紫斑牡丹品种的引物组合，包括如SEQ IDNO.1～24所示的引物对。
上述如SEQ ID NO.1～24所示的引物对依次分别用于扩增上述12个EST-SSR分子标记。
进一步地，本发明提供包含所述鉴定紫斑牡丹品种的引物组合的试剂盒。
在此基础上，本发明提供所述鉴定紫斑牡丹品种的SSR分子标记组合或所述鉴定紫斑牡丹品种的引物组合或包含所述引物组合的试剂盒的如下任意一种应用：
(1)在牡丹品种鉴定中的应用；
(2)在牡丹遗传图谱或分子身份证构建中的应用；
(3)在牡丹遗传育种中的应用；
(4)在牡丹亲缘关系或遗传多样性分析中的应用。
利用本发明提供的SSR分子标记组合或用于扩增所述SSR分子标记的引物组合，本发明获得了紫斑牡丹种质资源的分子身份证。
本发明提供紫斑牡丹种质资源的分子身份证，其为利用所述鉴定紫斑牡丹品种的引物组合对紫斑牡丹种质资源进行PCR扩增，分析PCR扩增产物的带型，将所述牡丹种质资源在每个SSR位点的PCR扩增产物片段按从小到大的顺序依次在1～9和A～Z范围内进行赋值，未获得扩增片段的赋值为0；将GBGY01000096、GBGY01000354、GBGY01000168、GBGY01000120、GBGY01000272、GBGY01000068、GBGY01000365、GBGY01000074、GBGY01000160、GBGY01000223、GBGY01000161、GBGY01000189每个SSR位点的赋值按从前至后的按顺序依次串联，得到紫斑牡丹种质资源的分子身份证。
本发明提供264个紫斑牡丹的分子身份证，具体如表1所示：
表1 264个紫斑牡丹的分子身份证
本发明还提供紫斑牡丹品种的鉴定方法，其为采用所述鉴定紫斑牡丹品种的引物组合对待测紫斑牡丹的基因组DNA进行扩增，根据扩增片段的带型鉴定紫斑牡丹的品种。
具体地，所述紫斑牡丹品种的鉴定方法包括如下步骤：
(1)提取待测紫斑牡丹的基因组DNA；
(2)以所述基因组DNA为模板采用所述用于紫斑牡丹品种的鉴定引物组合(SEQ IDNO.1～24)进行PCR扩增；
(3)采用毛细管电泳检测PCR扩增产物，将所述牡丹种质资源在每个SSR位点的PCR扩增产物片段按从小到大的顺序依次在1～9和A～Z范围内进行赋值，未获得扩增片段的赋值为0；将GBGY01000096、GBGY01000354、GBGY01000168、GBGY01000120、GBGY01000272、GBGY01000068、GBGY01000365、GBGY01000074、GBGY01000160、GBGY01000223、GBGY01000161、GBGY01000189每个SSR位点的赋值按从前至后的依次串联，得到紫斑牡丹种质资源的分子身份证，将其与本发明提供的紫斑牡丹种质资源的分子身份证(如表1所示)进行比对，确定待测紫斑牡丹品种。
优选地，上述步骤(2)中，所述PCR扩增的反应程序如下：94℃4min；94℃30s，50-60℃30s，72℃50s，35个循环；72℃min。
优选地，上述步骤(2)中，所述PCR扩增的10μL反应体系如下：无色2×Power TaqPCR Master MIX 5μL，上下游引物(10μmol/L)0.5μL，DNA模板1μL，ddH2O补齐至10μL。
为便于检测和区分不同SSR位点的扩增片段，可以将上述引物对中的上游引物进行荧光素标记。优选地，上述步骤(2)中，根据所述引物组合中各引物对的扩增片段大小差异将引物对进行分组，一个组合内的各引物对的扩增片段大小应当具有明显差异，每组引物对中的一条引物分别采用选自FAM、HEX、TAMRA、ROX荧光素中的一种进行标记；根据荧光信号确定步骤(3)中所述待测紫斑牡丹在每个SSR位点的PCR扩增产物片段大小。
本发明中，将每个SSR位点的PCR扩增产物片段按从小到大的顺序依次在1～9和A～Z范围内进行赋值的原则为：以两个等位基因的扩增片段大小相等且最小为最小值，其中一个等位基因片段大小不变，另一个等位基因片段大小依次增加，依次排在其后，再向后排列之前定为不变的等位基因片段大小增加的片段，以此类推；赋值顺序从小到大为1、2、3、4、5、6、7、8、9、A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V、W、X、Y、Z，没有检测到扩增产物的位点赋值为0。
依据上述原则具体举例说明如下：如果本发明所述的264个紫斑牡丹品种在一个SSR位点的PCR扩增片段共有15个多态性片段，其从小到大的排序和赋值规则如下：第一位119/119，赋值1，第二位119/120，赋值2，第三位119/121，赋值3，第四位119/122，赋值4，第五位120/120，赋值5，第六位120/121，赋值6，第七位120/122，赋值7，第八位121/121，赋值8，第九位121/122，赋值9，第十位121/123，赋值A，第十一位122/122，赋值B，第十二位122/123，赋值C，第十三位122/124，赋值D，第十四位122/124，赋值E，第十五位123/123，赋值F。
本发明还提供所述紫斑牡丹种质资源的分子身份证或所述鉴定紫斑牡丹品种的方法在紫斑牡丹品种鉴定或种质资源改良中的应用。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明通过大量筛选确定了覆盖目前几乎所有紫斑牡丹品种多态性的能够用于紫斑牡丹品种鉴定的最优SSR分子标记组合以及高效扩增SSR分子标记的引物组合，在此基础上建立了264个紫斑牡丹品种的分子身份证和鉴定牡丹品种的方法。利用本发明提供的分子标记组合和引物组合进行紫斑牡丹的品种鉴定，具有扩增片段清晰、差异明显、分辨力高、灵敏度好、结果可靠准确、高效快速等优点，能够准确快速地将264个不同的紫斑牡丹品种进行区分。结合本发明提供的分子身份证，能够准确确定待测紫斑牡丹的品种。实现了高效、低成本、操作方便的紫斑牡丹品种鉴定。本发明提供的分子标记组合、引物组合可用于紫斑牡丹品种分子身份证构建、品种鉴定及遗传多样性分析等，应用前景十分广阔。
(2)本发明利用SSR分子标记组合和对应的引物组合发现了紫斑牡丹品种同物异名的问题，如京都红与京世博红、京芳粉与京粉玉珠、京龙望月与京砚辉、京醉美与京冠红、京地红与京延紫、京粉玉合与京玉晚香、紫墨玉红与京城紫、面红耳赤与京焰为同一品种，解决了部分紫斑牡丹品种名称混乱、不准确的问题。
附图说明
图1为本发明实施例1中提取的紫斑牡丹基因组DNA的电泳结果，其中，M：标准DNA(DL2000)；泳道1-6分别为随机选取的6个紫斑牡丹品种的基因组DNA。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 SSR分子标记和引物组合的筛选
首先，本发明从牡丹的第一张高密度遗传图谱的5个连锁群上选取全部的72对EST-SSR(Cai，2015；吴静，2016)，合成对应的引物，以随机选取的6个紫斑牡丹的基因组DNA作为模板DNA采用这72对EST-SSR引物进行扩增，扩增产物再使用6％变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合银染方法进行检测，最终筛选出多态性丰富的34个EST-SSR，34个EST-SSR及其引物信息具体如表2所示。
表2 34个EST-SSR分子标记及对应的引物信息
F＝forward primer；R＝reverse primer。
以现有技术中的264个紫斑牡丹品种为供试材料，在上述34个EST-SSR中进一步筛选能够实现264个紫斑牡丹不同品种准确鉴定的最少数量、最优的EST-SSR分子标记组合，具体方法如下：
1、紫斑牡丹品种鳞芽采集与DNA提取
264个紫斑牡丹品种供试材料于2017年11月15日-2017年11月18日取自于北京延庆区北京国色牡丹科技有限公司基地。每个品种选取鳞芽，挂好标签装入自封袋后带回，置于-20℃冰箱保存。用刀片剥开芽的鳞片，取出幼嫩的芽原基，然后用TIANGEN(DP121221)试剂盒按照说明书进行DNA的提取。将获得的DNA原液先在1.0％琼脂糖凝胶电泳中检测是否具有清晰、明亮的条带，再用NanoDrop分光光度计检测DNA浓度，然后用ddH2O将基因组DNA稀释到20-30ng/μL，置于-20℃冰箱保存。部分品种的基因组DNA电泳结果如图1所示，结果表明，提取的基因组DNA条带清晰、明亮、没有弥散，可以用作后续PCR实验。
2、SSR分子标记的鉴别效率评价以及最佳引物组合的确定
将表2所示的34个EST-SSR扩增引物对根据其扩增片段大小差异进行分组，每4～5个扩增片段大小差异较大的引物对作为一组，每组引物对的上游引物分别采用不同颜色的荧光素进行标记，具体如下：
第一组：PS159、PS187、PS265、PS345、PS323，上游引物依次分别采用荧光素FAM、HEX、TAMRA、ROX、FAM标记；
第二组：PS047、PS074、PS221、PS335、PS139，上游引物依次分别采用荧光素FAM、HEX、TAMRA、ROX、FAM标记；
第三组：PS061、PS030、PS144、PS271，上游引物依次分别采用荧光素FAM、HEX、TAMRA、ROX标记。
第四组：PS149、PS309、PS157、PS296，上游引物依次分别采用荧光素FAM、HEX、TAMRA、ROX标记。
第五组：PS068、PS367、PS166、PS158，上游引物依次分别采用荧光素FAM、HEX、TAMRA、ROX标记。
第六组：PS339、PS073、PS260、PS276，上游引物依次分别采用荧光素FAM、HEX、TAMRA、ROX标记。
第七组：PS180、PS311、PS356、PS337，上游引物依次分别采用荧光素FAM、HEX、TAMRA、ROX标记。
第八组：PS026、PS119、PS095、PS004，上游引物依次分别采用荧光素FAM、HEX、TAMRA、FAM标记。
分别以上述1中制备的264个紫斑牡丹品种的基因组DNA为模板，利用上述荧光标记的34对SSR引物进行PCR扩增，PCR扩增采用10μL反应体系：5μL无色的2×Power Taq PCRMaster MIX(北京艾德莱生物科技有限公司)，0.5μL的上下游引物(10μmol/L)，1μL DNA模板，ddH2O补齐至10μL。PCR扩增程序：94℃4min；94℃30s，50-60℃30s，72℃50s，35个循环；72℃min；4℃保存。将扩增后的产物送到北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序分析，获得264个品种在34个SSR位点的扩增产物的毛细管电泳图结果。采用软件GeneMarkerV2.2.0对毛细管电泳图结果进行数据分析，将每对SSR引物扩增出的所有带型按照片段从小到大的顺序排序(以两个等位基因的扩增片段大小相等且最小为最小值，其中一个等位基因片段大小不变，另一个等位基因片段大小依次增加，依次排在其后，再向后排列之前定为不变的等位基因片段大小增加的片段，以此类推)，并依次在1～9和A～Z范围内进行赋值编号(1、2、3、4、5、6、7、8、9、A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V、W、X、Y、Z)，未获得扩增片段的赋值为0。
分析34对SSR引物的PCR扩增结果表明，有53个品种具有特有等位基因型，其中，品种粉妆楼具有8个特有基因型，京玉美(延庆)具有6个特有基因型，京阳紫、京艳具有5个特有基因型。根据34对SSR引物的PCR扩增结果，分析各引物对的品种鉴别效率，结果表明，其中28对引物均能实现1对引物即可区分紫斑牡丹品种(如表3所示)，其中，引物PS159的鉴别效率最高，单个引物对即可以鉴别9个品种；其次是引物对PS074单独使用可以区别8个品种。
表3利用1对SSR引物就能区分的品种以及SSR引物对的鉴别效率
表3中的品种序号对应的品种名称见表1
根据34对SSR引物对的紫斑牡丹品种鉴别效率以及在264个紫斑牡丹品种中的扩增产物带型结果，基于最少引物对鉴定最多品种的原则，从一对引物的赋值结果开始不断加入其余引物的赋值结果来看是否能将264个紫斑牡丹品种全部区分开，最终发现将PS095、PS356、PS166、PS119、PS271、PS068、PS367、PS074、PS157、PS221、PS159和PS187这12对引物在264个紫斑牡丹品种中的赋值结果组合起来就能区分所有品种个体。最终确定用于264个紫斑牡丹品种鉴定的最优引物组合为PS095、PS356、PS166、PS119、PS271、PS068、PS367、PS074、PS157、PS221、PS159和PS187，共12对引物，对应EST-SSR分子标记GBGY01000096、GBGY01000354、GBGY01000168、GBGY01000120、GBGY01000272、GBGY01000068、GBGY01000365、GBGY01000074、GBGY01000160、GBGY01000223、GBGY01000161、GBGY01000189。利用由这12对SSR引物组成的引物组合可以完全区分开264个品种，实现264个紫斑牡丹品种的准确鉴定。
实施例2利用SSR分子标记最佳组合建立264个紫斑牡丹品种的分子身份证
本实施例提供利用实施例1筛选得到的由12个SSR分子标记及其对应的引物组合组成的最优组合建立264个紫斑牡丹品种的分子身份证。
将实施例1获得的PS095、PS356、PS166、PS119、PS271、PS068、PS367、PS074、PS157、PS221、PS159、PS187这12对引物中每对引物的在264个紫斑牡丹品种中的所有带型按从小到大的顺序排列(以两个等位基因的扩增片段大小相等且最小为最小值，其中一个等位基因片段大小不变，另一个等位基因片段大小依次增加，依次排在其后，再向后排列之前定为不变的等位基因片段大小增加的片段，以此类推)，并依次在1～9和A～Z范围内进行赋值编号(1、2、3、4、5、6、7、8、9、A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V、W、X、Y、Z)，未获得扩增片段的赋值为0。
上述12个SSR引物对在264个紫斑牡丹品种中扩增得到的所有带型及其对应的赋值编号分别如表4～15所示。
表4引物PS095所有带型及其对应的编码
表5引物PS356所有带型及其对应的编码
表6引物PS166所有带型及其对应的编码
表7引物PS119所有带型及其对应的编码
表8引物PS271所有带型及其对应的编码
表9引物PS068所有带型及其对应的编码
表10引物PS367所有带型及其对应的编码
表11引物PS074所有带型及其对应的编码
表12引物PS157所有带型及其对应的编码
表13引物PS221所有带型及其对应的编码
表14引物PS159所有带型及其对应的编码
表15引物PS187所有带型及其对应的编码
按照引物的PIC值从高到低依次对最优引物组合中的引物进行排序：PS095、PS356、PS166、PS119、PS271、PS068、PS367、PS074、PS157、PS221、PS159、PS187(对应GBGY01000096、GBGY01000354、GBGY01000168、GBGY01000120、GBGY01000272、GBGY01000068、GBGY01000365、GBGY01000074、GBGY01000160、GBGY01000223、GBGY01000161、GBGY01000189)。
按照GBGY01000096、GBGY01000354、GBGY01000168、GBGY01000120、GBGY01000272、GBGY01000068、GBGY01000365、GBGY01000074、GBGY01000160、GBGY01000223、GBGY01000161、GBGY01000189的顺序将每个SSR位点的赋值按从前至后的顺序依次串联，得到紫斑牡丹种质资源的分子身份证。分子身份证共由12位数字或字母组成，每个数字或字母就是相对应的SSR引物对扩增出的带型的赋值编号。本实施例建立的264个紫斑牡丹品种的分子身份证如表1所示，通过表1所示的分子身份证能够将264个紫斑牡丹品种完全区分开，准确鉴定紫斑牡丹的品种。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京林业大学
<120> 鉴定紫斑牡丹品种的SSR分子标记及应用
<130> KHP191111084.6
<160> 68
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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tactccatct cgtgaccc 18
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ctcctccaac attgaccc 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
caacaggcag aagaaagg 18
Claims (4)
1.紫斑牡丹种质资源的分子身份证，其特征在于，利用SEQ ID NO.1~24所示的引物对，对表16中264个紫斑牡丹种质资源的12个SSR位点进行PCR扩增，分析PCR扩增产物的带型；将所述牡丹种质资源在每个SSR位点的PCR扩增产物片段按从小到大的顺序依次在1~9和A~Z范围内进行赋值，赋值原则为: 以两个等位基因的扩增片段大小相等且最小为最小值，其中一个等位基因片段大小不变，另一个等位基因片段大小依次增加，依次排在其后，再向后排列之前定为不变的等位基因片段大小增加的片段，以此类推；赋值顺序从小到大为1、2、3、4、5、6、7、8、9、A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V、W、X、Y、Z，没有检测到扩增产物的位点赋值为0；将GBGY01000096、GBGY01000354、GBGY01000168、GBGY01000120、GBGY01000272、GBGY01000068、GBGY01000365、GBGY01000074、GBGY01000160、GBGY01000223、GBGY01000161、GBGY01000189每个SSR位点的赋值按从前至后的依次串联，得到紫斑牡丹种质资源的分子身份证，见表16；
表16 264个紫斑牡丹种质资源的分子身份证
2.紫斑牡丹品种的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提取待测紫斑牡丹的基因组DNA；
（2）以所述基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO.1~24所示的引物对进行PCR扩增；
（3）采用毛细管电泳检测PCR扩增产物，将所述牡丹种质资源在每个SSR位点的PCR扩增产物片段按从小到大的顺序依次在1~9和A~Z范围内进行赋值，赋值原则为: 以两个等位基因的扩增片段大小相等且最小为最小值，其中一个等位基因片段大小不变，另一个等位基因片段大小依次增加，依次排在其后，再向后排列之前定为不变的等位基因片段大小增加的片段，以此类推；赋值顺序从小到大为1、2、3、4、5、6、7、8、9、A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V、W、X、Y、Z，没有检测到扩增产物的位点赋值为0；将GBGY01000096、GBGY01000354、GBGY01000168、GBGY01000120、GBGY01000272、GBGY01000068、GBGY01000365、GBGY01000074、GBGY01000160、GBGY01000223、GBGY01000161、GBGY01000189每个SSR位点的赋值按从前至后的依次串联，得到紫斑牡丹种质资源的分子身份证，与表16中所述的紫斑牡丹种质资源的分子身份证进行比对，以确定待测紫斑牡丹品种是否为表16中的品种。
3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序如下：94℃4min；94℃ 30s，50-60℃ 30s，72℃ 50s，35个循环；72℃ min。
4.权利要求1所述的紫斑牡丹种质资源的分子身份证或权利要求2或3所述的鉴定方法在鉴定权利要求1中的表16所述紫斑牡丹品种中的应用。
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