CN102732973A - 一种高通量棉花品种dna指纹库构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高通量棉花品种DNA指纹库构建方法，该方法包括提取棉花品种DNA，使用40对引物(核苷酸序列如SEQ ID No.1-80所示)进行SSR-PCR扩增，将扩增产物进行荧光多重PCR组合，于DNA分析仪上进行毛细管五色荧光电泳检测，根据荧光图谱进行棉花品种DNA指纹库构建。本发明方法相比常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测效率提高了10倍以上，且通过分子量内标的自动比对获得扩增产物片段大小，减少人为读板误差的同时，最大程度地保证了数据结果的准确性与可靠性。

Description

一种高通量棉花品种DNA指纹库构建方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种高通量棉花品种DNA指纹库构建方法。 

背景技术

棉花是我国主要的经济作物，优良新品种的培育与推广对国民经济的发展与人民生活水平的提高具有重要意义。据统计，2000—2009年我国通过国家及省级审定的棉花品种数量700多个。截止到2012年2月29日，已申请植物新品种保护的棉花品种达335个。然而，由于骨干亲本的集中使用与转基因技术在棉花育种中的大规模应用，棉花品种间的遗传差异越来越小，使得完全依赖传统的形态性状进行品种鉴别越来越困难。同时由于形态鉴定的时效性差，容易受到环境与主观因素的影响，品种多乱杂的现象难以得到有效控制。近年来，以微卫星(SSR)标记为基础的玉米、水稻等主要农作物的DNA指纹库构建已逐步开展，基于SSR标记在棉花遗传图谱构建、纯度鉴定与遗传多样性分析等方面的研究也有相关报道。但常规聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染技术的检测方法在分析的材料和位点较多时，检测工作显得费时费力，且不同胶板间数据的整合与统计是一项很繁琐的工作，数据结果的准确性也很难保证。多色荧光检测技术是以不同颜色的荧光染料标记在SSR引物的5’端，荧光检测器对标记有荧光染料的扩增产物进行信号采集，并通过与各泳道的分子量内标进行比对，可自动读取产物片段大小，大大提高检测效率的同时保证了数据的准确性，尤其适用于大规模材料的检测分析。然而，基于棉花SSR的多色荧光标记检测技术构建我国棉花品种DNA指纹库的方法还未见相关报道。 

发明内容

本发明目的是提供一种高通量棉花品种DNA指纹库构建方法，以克服现有技术存在的上述不足。 

本发明提供的一种高通量棉花品种DNA指纹库构建方法，包括以下步骤： 

(1)提取棉花DNA； 

(2)使用分布于棉花全基因组26条染色体上的一套40对核心引物分别对待测品种进行SSR-PCR检测，每对引物标记有荧光染料标记，所述核心引物的核苷酸序列如下表1所示： 

表1 

(3)将步骤(2)每对引物的扩增产物进行荧光多重PCR组合，然后进行毛细管电泳检测。 

其中，步骤(1)所述DNA提取包括以下步骤：将去壳棉种粉碎后，加入SDS提取液，漩涡充分后，65℃水浴；加入体积比依次为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀，离心；取上清，加入浓度为10mg/mlRNase，水浴；抽提后离心取上清，加入异丙醇，待DNA成团析出后，用乙醇洗涤DNA沉淀，加入TE或ddH₂O充分溶解DNA，备用。 

进一步地，所述DNA提取包括以下步骤：将去壳棉种充分粉碎后，加入800μl SDS提取液，漩涡充分后，65℃水浴30min，间隔10min轻摇一次；加入等体积800μl体积比依次为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀至不分层，10000rpm离心10min；取上清，加入浓度为10mg/ml的1μlRNase，37℃水浴30min；重复抽提一次后离心取上清，加入0.7倍体积异丙醇，待DNA成团析出后，70%乙醇洗涤DNA沉淀2次，加入200μlTE或ddH₂O充分溶解DNA，备用。 

本发明依据以下荧光多重PCR组合的基本原则：①组合中各引物的扩增产物片段范围不能交叉；②避开非特异扩增产物峰的相互影响；③采用五色荧光标记系统：其中，ROX红色荧光，TAMAR为黑色荧光，FAM为蓝色荧光、HEX为绿色荧光、分子量内标Liz-500为橙色；④对于扩增效率较低的引物优先使用FAM进行标记。 

本发明提供的棉花品种DNA指纹库构建方法中，每对引物的荧光标记如下表2： 

表2 

本发明提供的棉花品种DNA指纹库构建方法中步骤(2)所述SSR-PCR扩增反应体系，其中20μl反应液中包括：浓度为5m mol/L的上、下游引物各0.5μL、8μL 2.5×Buffer缓冲液、浓度为20ng/μLDNA模板2μL、浓度为5U/μL Taq聚合酶0.16μL、8.84μL ddH₂O。 

其中，步骤(2)所述SSR-PCR扩增反应程序为：94℃预变性4min，1个循环；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共32个循环;60℃延伸30min，1个循环；15℃保存待用。 

本发明提供的棉花品种DNA指纹库构建方法中步骤(3)是将40对引物分别扩增得到的PCR产物稀释5倍后，取1μL稀释液加8.5μL去离子甲酰胺和0.5μL Liz-500分子量内标，按照荧光多重PCR组合方式，于DNA分析仪上进行毛细管五色荧光检测。 

本发明DNA指纹库构建方法的每对引物的SSR-PCR扩增产物的荧光多重PCR组合方式如表3所示： 

表3 

本发明DNA指纹库构建方法的毛细管电泳检测条件为：预电泳13kV，3min；1.5kV进样10s；电泳10kV，40min。用GeneMapper软件对检测结果进行数据采集与分析。 

本发明提供了SEQ ID No.1-80所述的引物在构建高通量棉花品种DNA指纹库中的应用。 

本发明提供了一种高通量棉花品种DNA指纹库构建方法，其使用了40对分布于棉花全基因组的SSR核心引物，依据荧光多重PCR组合基本原则，将40对引物SSR-PCR扩增产物构建成10个4重PCR组合，4重PCR组合中的每对引物分别标记4种不同颜色的荧光染料。本发明通过对荧光多重PCR组合、PCR扩增体系与扩增程序、ABI-3730xl毛细管五色荧光检测法等环节进行系统的研究，建立了一种基于棉花SSR标记的高通量棉花品种DNA指纹库构建方法，相比常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测效率提高了10倍以上，且通过分子量内标的自动比对获得扩增产物片段大小，减少人为读板误差的同时，最大程度的保证了数据结果的准确性与可靠性，具有高通量、高精度、自动化程度高的优点。该方法尤其适用于大批量棉花品种DNA指纹库的构建。 

附图说明

图1为棉花品种中棉所50在五色荧光PCR组合1中的毛细管电泳检测图。图中横坐标为 荧光峰峰值大小(bp)，纵坐标为峰高(代表荧光信号强度)。其中，ROX为红色荧光峰；TAMAR为黑色荧光峰；FAM为蓝色荧光峰；HEX为绿色荧光峰；Liz-500为橙色分子量内标；各目的荧光峰通过与分子量内标Liz-500比对可获得目的扩增产物片段大小，其中2个蓝色荧光峰为FAM标记引物BNL3442的扩增产物，其片段大小分别为112bp与127bp；2个红色荧光峰为ROX标记引物MUCS101的扩增产物，其片段大小分别为154bp与166bp；2个黑色荧光峰为TAMAR标记引物NAU3110的扩增产物，其片段大小分别为214bp与223bp；2个绿色荧光峰为HEX标记引物NAU3254的扩增产物，其片段分别大小为276bp与291bp。 

图2为棉花品种国欣棉3号在五色荧光PCR组合2中的毛细管电泳检测图；其中2个黑色荧光峰为TAMAR标记引物NAU874的扩增产物，其片段大小分别为148bp与169bp；2个绿色荧光峰为HEX标记引物NAU905的扩增产物，其片段大小分别为161bp与167bp；2个蓝色荧光峰为FAM标记引物NAU934的扩增产物，其片段大小分别为195与214bp；2个红色荧光峰为ROX标记引物NAU1028的扩增产物，其片段大小为231bp与246bp。 

图3为棉花品种新陆中28号在五色荧光PCR组合3中的毛细管电泳检测图；其中绿色荧光峰为HEX标记引物BNL830的扩增产物，其片段大小为110bp；红色荧光峰为ROX标记引物BNL2449的扩增产物，其片段大小为165bp；黑色荧光峰为TAMAR标记引物BNL1231的扩增产物，其片段大小为196bp；蓝色荧光峰为FAM标记引物BNL3171的扩增产物，片段大小为232bp。 

图4为棉花品种山农圣棉1号在五色荧光PCR组合8中的毛细管电泳检测图；其中黑色荧光峰为TAMAR标记引物BNL4030的扩增产物，其片段大小为112bp；绿色荧光峰为HEX标记引物CIR246的扩增产物，其片段大小为166bp；2个蓝色荧光峰为FAM标记引物NAU1167的扩增产物，其片段大小为189bp与201bp；2个红色荧光峰为ROX标记引物NAU1190的扩增产物，其片段大小为218bp与228bp。 

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。 

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 

实施例1构建96个棉花品种的DNA指纹库 

本实施例中96个棉花品种来源于河北众信种业科技有限公司、河北创世纪科技股份有限公司、河北农华种业有限公司、河间市国欣农村技术服务总会等。96个棉花品种名称见表4。 

表4 

1、DNA提取 

(1)将单粒棉花种子去壳，充分粉碎后转入2ml的离心管中。 

(2)加入800ul DNA提取液(1%SDS，0.01mol/L EDTA 8.0，0.7mol/LNaCl，0.05mol/L Tris-HCl，0.5%山梨醇，1%PVP，1%β-巯基乙醇)，漩涡至充分混匀后，65℃水浴30min，间隔10min左右轻摇一下。 

(3)水浴结束后，加入等体积800μl苯酚、氯仿和异戊醇的混合液(其体积比依次为25：24：1)，上下颠倒混匀至不分层，10000rpm离心10min。 

(4)吸取上清液转移到另一2ml离心管中，加入1uL RNase酶(10mg/ml)，混匀后37℃水浴30min。 

(5)加入等体积800ul的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，上下颠倒混匀至不分层，10000rpm离心10min。 

(6)将上清液转移到另一2ml离心管中，加入0.7倍体积异丙醇缓慢摇动几次，静置30min，絮状DNA成团析出。 

(7)用剪口枪头吸取DNA转移至盛有70%乙醇的离心管中，浸泡两次，第一次约2小时，第二次浸泡过夜。 

(8)倒掉乙醇，自然通风干燥DNA，加入200ul TE(pH 8.0)或ddH₂O，充分溶解备用。 

(9)紫外检测DNA浓度，用ddH₂O将DNA原液稀释至使用浓度20ng/μl，4℃保存备用。 

2、SSR-PCR扩增 

采用40对核心引物(引物核苷酸序列如SEQ ID No.1-80所示)进行PCR扩增，每对引物的荧光标记情况见表2，PCR反应体系如下表5： 

表5 

所述PCR扩增程序：94℃预变性4min，1个循环；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共32个循环;60℃延伸30min，1个循环；15℃保存待用。 

3、毛细管五色荧光检测 

用ddH₂O将40份PCR产物稀释5倍后，分别取1μLPCR产物稀释液加8.5μL去离子甲酰胺、0.5μL Liz-500分子量内标，按照表3所记载的荧光多重PCR组合方式，于ABI3730xlDNA分析仪上进行毛细管电泳检测，检测条件为预电泳13kV，3min；1.5kV进样10s；电泳10kV，40min。荧光检测器对标记有荧光染料的扩增产物进行信号采集，通过与各泳道的分子量内标进行比对，可自动读取产物片段大小。用GeneMapper软件对检测结果进行数据采集与分析。96个样品4个位点1组的电泳检测与数据分析可在1小时内完成，完成40个位点10组的检测即可获得各样品在40个位点的指纹数据库。 

通过上述方法得到96个棉花品种的指纹信息，即构建了这些棉花品种的指纹数据库(简称指纹库)。品种邯棉802、冀创棉1号、石抗126、国欣棉3号、鲁棉研30号、鲁棉研28号、山农圣棉1号、仁和39号、豫杂37、中棉所63等10个品种的指纹信息见表6~表15。不同棉花品种的毛细管电泳检测图见图1~图4。 

表6邯棉802指纹信息表 

表7冀创棉1号指纹信息表 

表8石抗126指纹信息表 

表9国欣棉3号指纹信息表 

表10鲁棉研30号指纹信息表 

表11鲁棉研28号指纹信息表 

表12山农圣棉1号指纹信息表 

表13仁和39号指纹信息表 

表14豫杂37指纹信息表 

表15中棉所63指纹信息表 

注：表中size为每对引物PCR扩增产物的片段大小，同一引物在不同品种间扩增产生的片段按从小到大的顺序排列，即size1—size7。 

结果分析：对常规PAGE电泳银染检测结果进行分析时，各泳道样品扩增产物片段的大小需要与分子量Marker对比获得，当样品泳道离Marker泳道相距较远或片段相差较小时，实验数据会产生一定的误差，尤其在分析的材料和位点较多时，不同胶板间数据的整合与统一是一项很繁琐的工作，数据结果的准确性也很难保证。而在毛细管五色荧光检测系统中，各毛细管泳道均含有分子量内标，具有荧光信号的扩增产物片段大小通过与其所在泳道分子量内标比对即可准确地获得其分子量大小，最大程度地保证了数据结果的准确性，且数据的读取均是通过仪器自动采集，大大减少了读板时人为造成的误差。采用本发明构建96个棉花品种的指纹数据库只需毛细管电泳检测10块96孔板，每次电泳检测时间不足1小时，一天之内可以完成所有样品的检测与分析，而使用常规聚丙烯酰胺凝胶电泳共需检测60块板，每人每天只能完成4块板，共需约15天的时间。总之，本发明所提供的这种高通量DNA指纹库构建方法相比常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳大大提高检测效率的同时保证了数据的准确性，尤其适用于大规模材料的检测与分析。 

Claims (10)

1.一种高通量棉花品种DNA指纹库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取棉花DNA；

2)使用分布于棉花全基因组26条染色体上的一套40对核心引物分别对待测品种进行SSR-PCR检测，每对引物标记有荧光染料，所述核心引物的核苷酸序列如下所示：

  引物名称   上游序列5′-3′   下游序列5′-3′   NAU3254   GCTTTGCTTTGGAATGAGAT   TTGGTGCAGATAGCAAGAAA   NAU2277   GAACTAGCCACATGATGCAC   TTGTTGAGGCATTAGTTTGC   NAU1190   CCATGTCCGTATCCATGTTA   TAAGGCAAGATAGGGTCAGG   NAU1071   ACCAACAATGGTGACCTCTT   CCCTCCATAACCAAAAGTTG   MUCS101   AGCCTCTCTCTCCTTCAGGC   GAGTCATATCGCTTGGGAGC   NAU934   TGCTTTCGTATCCTTTTTCC   ATTAGAGAAGCCAGGGAGGT   NAU1200   CAACAGCAACAACCACAA   CTGCCTCGAGGACAAATAGT   NAU874   AAATGGCGTGCTTGAAATAC   TGTGATGAAGAACCCTCTCA   NAU905   TGGCTGAACTTTGCAATTTA   AAGCAAGGGAGGTAATCCTT   NAU1362   TCTGATTTGCTGATTGGAAA   CTTATTCGGACTTGGTTGCT   BNL1317   AAAAATCAGCCAAATTGGGA   CGTCAACAATTGTCCCAAGA   BNL2960   TAAGCTCTGGAGGCCAAAAA   CCATTTCAATTTCAAGCATACG   BNL1231   TAATAAAAGGGAAAGGAAAGAGTT   TATGGCTCTAGAATATTCCCTCG   BNL3442   CATTAGCGGATTTGTCGTGA   AACGAACAAAGCAAAGCGAT   BNL3261   AAACGGAAACGAAGAAGGGT   CCCAAACCTGTCTCACCAAC   BNL1421   TGAAGATTTGGAGGCAATTG   GAAATCAAGCCTCAATTCGG   BNL2449   ATCTTTCAAACAACGGCAGC   CGATTCCGGACTCTTGATGT   CIR246   TTAGGGTTTAGTTGAATGG   ATGAACACACGCACG   NAU2437   CTTGGAAAAAGGAAGAGCAG   TTAAAAGACCAAAGGCAAGG   BNL830   TTCCGGGTTTTCAATAAACG   GTTAATACTTTTTTTCTTTTGTGTGTG   JESPR292   GCTTGCAATCTCCTACACC   GAATATGTTTCATAGAATGGC   NAU1167   CTGACTTGGACCGAGAACTT   AAGAGCCCTGGACAATGATA   NAU1028   CCGCCTAAGACTAATTGGAA   CAAATTGTAAGTGGCTGAGA   CIR216   ATCTGAACCATCATCCTC   TTCTGATTGGCACTTTC   NAU3110   CCAAGGATATGAACCAAAGG   CGTGAACACCATGTCAGTCT   BNL3646   CCCAATACGAGGAGAGCACA   TCGAAAATGGGGGAGAGAG   BNL3171   GAAAAATTGAGGAAGGACATACG   GGCCACAACCGAATTTACTG

  NAU1103   GGAGCCAGAAGTTGAGAAAA   TTCGGCTTCTGCTTTTACTT   BNL4030   CCTCCCTCACTTAAGGTGCA   ATGTTGTAAGGGTGCAAGGC   BNL3140   CACCATTGTGGCAACTGAGT   GGAAAAGGGAAAGCCATTGT   JESPR110   GGCGAAGAGCTACCTGTGAATGGC   CCAATGGGGACTCTACATGTGGC   NAU1125   AAGAAGCCACTGAAGCAGAG   GTAGAACAGCTCCATTGCTG   BNL827   AAGCTCCACGTGCTCAAGTT   CTCATGTTGTCGGTGGTGTT   NAU3588   CCCCATAGGGCATACTTCTA   GCCAACAAGAACAACAACAC   CIR170   TCGGTAAAGATGGGTG   ATTGGTGCTGGTTGAG   NAU1369   TGGCAGAGATGAATGTAAGC   GGTAACGGATGGAAAATCAC   NAU859   CAGGCTTCATCTTTTTGGAC   CATTGGATCCTAGTGGGAAG   NAU3778   GAGAAGCAGCCACTCATGTA   CCCCACCCTATGATGAATAA   DPL0442   TTACGGTGGCTAATGTAATATCCC   ATTCTTGAGAGTTCACCAGGAAAG   NAU5099   GCTGTGAGTTTGTGCTTTCC   GACAGAACTCTGGAGCGAAT    ；

3)将步骤2)每对引物的扩增产物进行荧光多重PCR组合，然后进行毛细管电泳检测与数据分析。

2.根据权利要求1所述的DNA指纹库构建方法，其特征在于，步骤1)所述DNA提取包括以下步骤：将去壳棉种粉碎后，加入SDS提取液，漩涡充分后，65℃水浴；加入体积比依次为25∶24∶1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀，离心；取上清，加入浓度为10mg/mlRNase，水浴；抽提后离心取上清，加入异丙醇，待DNA成团析出后，用乙醇洗涤DNA沉淀，加入TE或ddH₂O充分溶解DNA，备用。

3.根据权利要求2所述的DNA指纹库构建方法，其特征在于，所述DNA提取包括以下步骤：将去壳棉种充分粉碎后，加入800μl SDS提取液，漩涡充分后，65℃水浴30min，间隔10min轻摇一次；加入等体积800μl体积比依次为25∶24∶1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀至不分层，10000rpm离心10min；取上清，加入浓度为10mg/ml的1μl RNase，37℃水浴30min；重复抽提一次后离心取上清，加入0.7倍体积异丙醇，待DNA成团析出后，70％乙醇洗涤DNA沉淀2次，加入200μlTE或ddH₂O充分溶解DNA，备用。

4.根据权利要求1所述的DNA指纹库构建方法，其特征在于，步骤2)每对引物的荧光标记如下：

  引物名称   荧光标记   引物名称   荧光标记   BNL3442   FAM   JESPR110   FAM   NAU3254   HEX   NAU1200   HEX   BNL1231   TAMAR   JESPR292   TAMAR   MUCS101   ROX   NAU2277   ROX

    NAU934     FAM     NAU1071     FAM     NAU905     HEX     BNL1421     HEX     NAU874   TAMAR     BNL3646   TAMAR     NAU1028     ROX     BNL2960     ROX     BNL3171     FAM     NAU1167     FAM     BNL830     HEX     CIR246     HEX     NAU3110   TAMAR     BNL4030   TAMAR     BNL2449     ROX     NAU1190     ROX     CIR216     FAM     CIR170     FAM     NAU1125     HEX     BNL3261     HEX     NAU859   TAMAR     NAU1369   TAMAR     NAU3588     ROX     NAU1362     ROX     BNL3140     FAM     NAU3778     FAM     NAU1103     HEX     DPL0442     HEX     BNL1317   TAMAR     NAU2437   TAMAR     BNL827     ROX     NAU5099     ROX

5.根据权利要求1所述的DNA指纹库构建方法，其特征在于，步骤2)所述SSR-PCR扩增反应体系，其中20μL反应液中包括：浓度为5m mol／L的上、下游引物各0.5μL、8μL2.5×Buffer缓冲液、浓度为20ng/μL DNA模板2μL、浓度为5U/μL Tag聚合酶0.16μL、8.84μLddH₂O。

6.根据权利要求1所述的DNA指纹库构建方法，其特征在于，步骤2)所述SSR-PCR扩增反应程序为：94℃预变性4min，1个循环；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共32个循环；60℃延伸30min，1个循环；15℃保存待用。

7.根据权利要求1所述的DNA指纹库构建方法，其特征在于，步骤3)是将40对引物分别扩增得到的PCR产物稀释5倍后，取1μL稀释液加8.5μL去离子甲酰胺和0.5μLLiz-500分子量内标，按照荧光多重PCR组合方式，于DNA分析仪上进行毛细管电泳检测。

8.根据权利要求1所述的DNA指纹库构建方法，其特征在于，所述每对引物的扩增产物的荧光多重PCR组合方式为：

9.根据权利要求1所述的DNA指纹库构建方法，其特征在于，步骤3)所述毛细管电泳检测条件为：预电泳13kV，3min；1.5kV进样10s；电泳10kV，40min。

10.SEQ ID No.1-80所述的引物在构建高通量棉花品种DNA指纹库中的应用。

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