CN109234427A - 一种棉花紫化突变体hs2的特异性鉴定引物及其应用 - Google Patents

一种棉花紫化突变体hs2的特异性鉴定引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种棉花紫化突变体HS2的特异性鉴定引物及其应用，所述特异性鉴定引物为HS2A和HS2APF、HS2B和HS2BPR两对引物中的一对或两对；本发明特异性引物HS2A和HS2B是通过PCR技术实现的，与本发明的棉花紫化突变体HS2的紫化突变性状共分离并呈特异带型，不仅能快速有效地区分棉花品种/品系的基因型，而且还能直接鉴定种质资源和育种后代中的紫化性状是否来源于HS2紫化突变体材料或衍生系，可以在育种进程的任何阶段进行，不受任何外界因素的影响，极大地缩短了育种进程，提高了育种效率。

Description

一种棉花紫化突变体HS2的特异性鉴定引物及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种棉花整个植株呈现紫化突变的特异性引物HS2A和HS2B及其检测棉花紫化性状中的应用。
(二)背景技术
棉花是目前世界上附加值最高的天然纺织纤维，其经济价值的90％来自于棉纤维。棉花作为我国重要的农产品和纺织工业原料，对农业、农村乃至国民经济的发展均有重要意义。虽然多个棉种全基因组测序已完成，基因组序列信息中积累了大量有用的信息，但是许多新基因的功能仍然不清楚，挖掘一些有意义的新基因和功能基因已经成为目前基因组学研究的最为紧迫的任务。而棉花作为对国民经济中起重要作用的经济作物，随着棉花基因组序列的公布，棉花的功能基因组研究必将再次成为国际植物研究热点。但陆地棉是异源四倍体，基因组结构非常复杂，棉花基因组学的研究也非常缓慢，而通过T-DNA插入突变研究棉花的功能基因尚未报道。
植物自发突变通常是在自然条件下，无人为因素介入的情况下发生的变异。王学德2002年报道发现了一棵无纤维棉花突变体，为棉花纤维发生机理研究及棉纤维相关基因的克隆提供了材料(蒋淑丽，王学德，5个棉花纤维突变体胚珠和纤维的离体诱导，棉花学报,2002,14(2):71-75,2002)。陈旭升等从陆地棉中分离出自然突变的具有高光合效率的亚红株突变体，随后又发现了自发突变矮化株(陈旭升，棉花矮秆突变体，中国棉花,2004,31(1):26-26；陈旭升，陆地棉亚红株新突变体；中国棉花，2004,31(12):19-19)。由于自发突变的低概率事件，加上棉花遗传背景的复杂性，有些即使发现一些表型变异，也很难用分子机理验证，而最终导致自发突变体库资源流失。物理和化学方法创造突变体是在基因水平上创造突变体的一种方法，在棉花上也有相应的研究。如1955年Maluszyns利用γ射线辐照得到了耐热和早熟的棉花杂交后代突变体(Maluszynskl,Application of in vivo andin vitro mutation techniques for crop improvement.Euphytica,1995,85:303-315)。山东省农科院利用γ射线处理得到的中棉所2号和1195系的杂交组合突变体，表现出结铃性强、成熟早、抗抗逆性强的的特性。在1987年，化学诱变就已经成为植物诱变育种的一种重要方法(Mike,Donini,Maluszynski.Induced mutations for crop improvement.TropAgric,1987,64:259-278)。沈法富曾将叠氮化钠(NaN3)在棉花合子期导入鲁棉6号，获得早熟突变体(沈法富,棉花合子期化学诱变获得的早熟品系及其RAPD分析.遗传学报,1999,26(2):174-187)。对于背景比较复杂的棉花，和自发突变一样，往往很难分析突变点，加上诱变时嵌合株产生率高，容易导致细胞死亡、恶性转化等(Hagen.Radiation biology inspace.A Critical Review Adv Space Research,1989,9(10):3-8)，因此由于其难控制性，目前在棉花育种中应用受到一定限制。在棉花组织培养的基础上，创制一些有意义的突变体，Trolinder等1991年利用高温诱导棉花愈伤组织，获得棉花不育耐旱突变体(Trolinder,Shang.In vitro selection and regeneration of cotton resistant tohigh temperature stress.Plan Cell Rep,1991,10:448-452)。1998年通过在愈伤组织培养基中添加根腐病毒素获得该抗性植株。Jin等在G.hirsutum体细胞胚胎发生的不同时期添加2,4-D和KT成功诱导体细胞无性系变异再生植株(Jin et al.Detection ofsomaclonal variation of cotton(Gossypium hirsutum)using cytogenetics,flowcytometry and molecular markers.Plant Cell Rep,2008,27(8):1303-1316)。祝水金等利用无性系细胞培养液获得了抗除草剂草甘膦突变体(祝水金等,棉花抗草甘膦突变体筛选及其在杂种优势利用中的应用.棉花学报,2003,15(4):227-230)。棉花组织和细胞培养产生的体细胞无性系变异在抗逆、抗病方面有一定的进展，但是由于突变的不确定性，需要庞大的突变体系才能得到一些有意义的突变体，而且在棉花高产、优质方面研究甚少，同时通过组织培养获得突变体效率较低。植物突变群体的构建方法中，插入突变是一种重要的方法。插入突变是将外源的已知插入元件随机插入植物基因组中，引起插入位点基因的变化，影响其正常表达，进而导致植株在表型上的变化，产生插入突变体，并以此插入元件为标记来分离和克隆因插入而失活的基因(Krysan et al.,T-DNA as an insertionalmutagen in Arabidopsis.Plant cell,1999,11:2283-2290)。目前常用的插入元件有T-DNA、转座子等，而T-DNA插入是构建突变体库的主要方法，广泛应用于大规模植物基因功能分析，是用来研究新基因功能的有效工具。T-DNA插入技术在农杆菌和基因枪介导的基础上已被广泛应用于拟南芥、水稻等植物大量突变体库构建中(Azpiroz et al.,T-DNAinsertion mutagenesis in Arabidopsis:going back and forth.Trends Genet,1997,13(4):152-156；Bouche et al.,Arabidopsis gene knockout phenotypes wanted.CuurOpin Plant Biol,2001,4:111-117)。T-DNA插入不但可以获得大量突变体，而且转化载体所携带的报告基因还可作为基因诱捕，克隆整合位点处内源基因的标签，分离和鉴定与突变体相关的基因。到目前为止在拟南芥有40％的新基因是通过T-DNA介导的基因诱捕技术分离的(Meinke et al.,The preservation of plant genetic resources experienceswith Arabidopsis.Plant Physiology,2003,133:1046-1050)。如今至少有225,000多个拟南芥T-DNA插入突变体被构建，其中360,000个T-DNA插入位点序列被分析捕获，这几乎可以代表拟南芥的整个基因组(Li et al.,Gene traping techniques and currentprogress.Yi Chuan Xue Bao,2006,33:189-198)。然而，棉花的生物技术相对于其它作物落后，规模化的转基因比较困难，表现在基因型依赖性，转基因周期长，再生、移栽困难，可重复性差等，利用转基因技术构建T-DNA插入突变体库十分困难。
棉花花器官的颜色问题，已被当作研究棉花遗传和分类学方面的重要材料(Fryxell et al.,Phenetic analysis and the phylogeny of the diploid species ofGossypium L.(Malvaceae).Evolution,1971,554–562；Parks et al.,The applicationof flavonoid distribution to taxonomic problems in the genusGossypium.Bulletin of the Torrey Botanical Club,1975,350–361.；Liang et al.,New red flower germplasm lines of cotton selected from hybrid of Gossypiumhirsutum X G.bickii.Science in China Series C:Life Sciences,1997,40:284–292.)。尽管棉纤维是棉花的主要产品，但是对棉花花器官基因改造，也能提高棉花的经济价值。棉花花器官的生命历程极短暂，在正常生长环境下，一般早上开放，下午开始枯萎，至第二天正午凋零，并且其花色在这短短的时间内会发生巨大的变化(Neelakantam et al.,Pigments of cotton flowers.Part I.Cambodia(G.hirsutum).Proc Indian Acad Sci-Section A,1935,1:887–890.；Chhabra et al.,Factors affecting anthocyaninsynthesis in cotton flowers.Physiology of sexual reproduction in floweringplants,Kalyani Publishers,New Delhi,1978,136–141)。通过表达分析发现，花器官中的类黄酮与基因和光线有复杂的关联，并且花色的改变主要与花青素合成基因表达有关，而pH等外界环境因素带来的影响极小；其中PAL,CHS,F3H,DFR,FLS,ANR,ANS以及UFGT这些基因与花器官中的花青素积累有紧密联系，而与FLS1基因相关的黄酮醇合成受光照影响大(Tan et al.,The Flavonoid Pathway Regulates the Petal Colors of CottonFlower.PLoS ONE,2013,8(8):e72364)。Parks等发现环境因素对棉花花色的影响远比对棉花叶片的影响要小得多(Parks et al.,Floral pigmentation studies in the genusGossypium.IV.Effects of differentgrowing environments on flavonoidpigmentation.Am J Bot,1972,158–164.)；棉花花色主要是由遗传决定的(Parks et al.,Floral Pigmentation Studies in the Genus Gossypium.II.Chemotaxonomic Analysisof Diploid Gossypium Species.Am J Bot,1965,849–856)。红叶棉(Empire Red LeafCotton，ERLC)是一个重要的遗传资源。在营养器官积累大量花青素能够抵御棉铃虫、粉虱、棉铃象甲等害虫的侵蚀(Zafar et al.,Development of genetic linkage map of leafred colour in cotton(Gossypiumhirsutum)using DNAmarkers.Pak J Bot,2009,41:1127–1136.；Fitt,Cotton pest management:part 3.An Australian perspective.AnnuRev Entomol,1994,39:543–562.)。在棉花育种中，红叶棉可以在形态学研究上有重要利用价值，这个品种的表型是在光照下除了棉纤维之外，其他组织中有明显的花青素积累，呈现红色。Gao等通过瞬时表达，在ERLC启动子区两个串联重复的228bp片段，是RLC1基因(属于R2R3-MYB型)光依赖性表达和叶片等组织中花青素积累的关键所在，这也使得R2R3-MYB转录因子在光诱导下调控ERLC叶片花青素积累上的重要性更加明了，MYB调控RLC1基因表达，并能在金鱼草和棉花中增强花青素代谢通路中结构基因的表达(Gao et al.,ThePromoter Structure Differentiation of a MYB Transcription Factor RLC1CausesRed Leaf Coloration in Empire Red Leaf Cotton under Light.PLoS ONE,2013,8(10):e77891)。
形态标记对于棉花育种具有重要的作用，比如棉花芽黄突变体，该突变体叶片黄化一般在苗期表现，随着植株的生长，叶绿素含量的增加，黄化的叶片逐渐变绿，达到野生型水平。芽黄突变体不仅是研究光合作用、叶绿素合成途径、基因表达调控的理想材料(刘朝辉等，一个新的水稻叶绿素缺失黄叶突变体的特征及基因分子定位.遗传，2012，34(2)：223--229)，而且在育种上芽黄突变体可以作为一种新的种质资源培育新品种(Gan etal.Inhibition of leaf senescence by autoregulated production ofcytokinin.Science，1995，270(5244)：l986-1988)。利用叶色突变这一容易识别的特点，将控制芽黄突变体的基因转到杂交亲本中，作为指示性状鉴定种子纯度，节约时间和成本(Zhao et a1.A chlorophyll-reduced seeding mutant in oilseed rape，Brassicanapu,for utilization in Fl hybrid production.Plant Breeding,2000,119(2):131-135)。另外可以将叶色突变的形态标记用于QTL(Quantitative trait locus)连锁分析，定位控制数量性状的基因，加快分子标记辅助育种的进程(苗晗等.黄瓜黄绿叶突变体光合色素变化及相关基因差异表达.中国农业科学,2010，43(19)：4027-4035)。1933年killough等首次报道陆地棉芽黄突变体材料v1，目前在四倍体棉种中已经发现22个芽黄突变体(宋美珍等.一个短季棉芽黄基因型的鉴定及生理生化分析.中国农业科学,2011,44(18):3709-3720)，涉及到26个芽黄基因。研究发现v1是v7的部分同源基因(Turcotte andFeaster.The interaction of two genes for yellow foliage in cotton.Journal ofHeredity,1973,64(4):23l-232)，v2和v14之间具有部分同源关系(Kohel et al.Geneticanalysis of virescent mutants and the identification of virescents vl2，vl3，v14，v15and vl6vl7in upland cotton.Crop Science,1983,23(2):289-291)，且在已知的芽黄突变体中.存在着重叠芽黄基因和部分同源的芽黄基因对，例如v5v6,vl6vl7、yglyg2分别位于同一对同源转化群的两条染色体上(肖松华等.陆地棉芽黄基因的互作效应研究.江苏农业学报,1996,12(2):11-16)。
随着现代分子生物学的不断发展，特别是分子标记的出现，为传统育种注入了新的活力。传统育种过程中的表型选择，与基因型的偏差，会造成选择的不准确性和效率低下。而应用分子标记辅助选择，可有效的检测基因型，有许多传统选择方法无可比拟的优势：其一，分子标记是一种中性标记，不会带来任何有害的表型；其二，分子标记大多为显性或共显性标记，便于识别；其三，分子标记是基于DNA水平上的选择，可在作物的任何生育阶段进行。
因此，为了提高棉花紫化突变体紫化性状的利用和选择的效率，有必要发展一种和紫化性状和外源基因插入位点相关联的分子标记。近年来，针对特定基因发展了一种功能型分子标记，广泛用于高密度图谱构建、基因定位、图位克隆及分子标记辅助育种等(Andersen and Lübberstedt.Functional markers in plants.Trends in PlantScience.2000,8:554–560)。功能型分子标记是一个分子标记位点代表一个特定的基因，甚至与某种性状联系起来，因此通过对某个分子标记的筛选即能对性状进行准确筛选。功能型分子标记的优点包括：(1)是一类显性或共显性分子标记；(2)不依赖于分子遗传作图；(3)辅助选择性高，理论上选择效率可达100％。
获得棉花T-DNA插入突变体后，插入突变体在基因序列水平上的变化与表型变化的关系，必须通过序列分析来进一步确定外源T-DNA插入位点和侧翼序列分析。通过对T-DNA插入位点侧翼序列的生物信息学分析，可以预测整合位点的基因功能，获知该基因控制的表型信息。本申请中的棉花紫化突变体侧翼序列，分离T-DNA插入侧翼序列的方法是热不对称交错PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR，TAIL-PCR)技术(Liu YG,MitsukawaN,Oosumi T,Whittier RF(1995)Efficient isolation and mapping of Arabidopsisthaliana T-DNA insert junctions by thermal asymmetric interlaced PCR.Plant J8:457–463)。利用插入位点特定的侧翼序列和外源基因的特异序列组合设计检测引物，可以保证棉花紫化性状和基因有效选择，从而加快该紫化突变体和相关基因在棉花育种上的应用，使其选择和鉴定效率在理论上达到100％。本领域迫切需要针对该紫化性状和目的基因开发更有效功能型分子标记并应用于分子育种中。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种用于鉴定棉花紫化突变体HS2的特异性鉴定引物及其在制备棉花紫化性状筛选和PCR试剂盒检测中的应用，也可在大量的棉花种质资源和杂交育种中筛选、鉴定该突变体功能性紫化性状和外源基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中的得到应用。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种棉花紫化突变体HS2的特异性鉴定引物，所述特异性鉴定引物为HS2APF和HS2A、HS2B和HS2BPR两对引物中的一对或两对；
HS2APF：GTCCGCAATGTGTTATTAAG(SEQ ID NO.1)；
HS2A：AGTCATTTGCAGTACCACCT(SEQ ID NO.2)；
HS2B：TCATCATTTTGGCTCCGTAA(SEQ ID NO.3)；
HS2BPR：TTGACAGGATATATTGGCGG(SEQ ID NO.4)。
本发明还提供一种所述棉花紫化突变体HS2的特异性鉴定引物在棉花紫化性状PCR检测和筛选的应用，所述紫化性状包括叶，叶柄，茎，花器官，棉铃等呈紫色或紫红色。所述棉花紫化性状筛选包括在棉花种质资源中快速、直接地鉴定该紫化突变性状是否来源于紫化突变体HS2，以及利用所述特异性鉴定引物进行紫化性状辅助育种和基因聚合育种。
进一步，所述PCR检测以待测棉花基因组DNA为模板，以HS2APF和HS2A、HS2B和HS2BPR中一对或两对为引物进行PCR扩增，若HS2APF和HS2A引物的PCR扩增产物为520bp，和/或HS2B和HS2BPR引物的PCR扩增产物为560bp，则待测棉花含紫化突变体HS2。即这两组引物单独或同时应用，扩增出两条特征性产物(HS2APF和HS2A引物的PCR扩增产物为520bp，HS2B和HS2BPR引物的PCR扩增产物为560bp)，则表明检测棉花来源于紫化突变体HS2或其衍生系，并呈现紫色、紫红性状；检测植株未出现特征扩增产物，为非此紫化突变体或其衍生系。
进一步，所述PCR扩增体系为：50ng/μl模板DNA1微升、10mM dNTP 0.5微升、20μM上游引物0.25微升、20μM下游引物0.25微升、10×缓冲液2微升、Taq酶1U，总反应体积20微升。
进一步，所述PCR扩增条件为：95℃，3分；94℃，30秒，58℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸5分钟。
本发明所述的待测棉花包含棉花紫化突变体HS2及其衍生系，优选的棉花品系或品种为Coker312(C312)、豫早1号(YZ1)、彩色棉棕絮1号(ZX1)、棕絮1-52(ZX1-52)，棕絮1-61(ZX1-61)、彩色棉新彩7号(XC7)、新彩5号(XC5)、新彩1号(XC1)和绿絮1号(LX1)及其杂交组合和后代，当前主栽品种中棉41(ZM41)和国抗44(GK44)。
本发明相对于现有技术具有如下优点：
本发明特异性引物HS2A和HS2B是通过PCR技术实现的，与本发明的棉花紫化突变体HS2的紫化突变性状共分离并呈特异带型，不仅能快速有效地区分棉花品种/品系的基因型，而且还能直接鉴定种质资源和育种后代中的紫化性状是否来源于HS2紫化突变体材料或衍生系，可以在育种进程的任何阶段进行，不受任何外界因素的影响，极大地缩短了育种进程，提高了育种效率。
(四)附图说明
图1紫化突变性状的特异性引物HS2A和HS2B鉴定HS2紫化突变体和其它棉花品种品系及其杂交种的琼脂糖凝胶电泳图；
A：特异性引物HS2A鉴定HS2突变体和陆地棉不同品种品系(C312,YZ1,XC7,ZX1,LX1,XC5,XC1,ZX1-61,ZX1-52和ZM41,GK44)；B：特异性引物HS2B鉴定HS2突变体和陆地棉不同品种品系(C312,YZ1,XC7,ZX1,LX1,XC5,XC1,ZX1-61,ZX1-52和ZM41,GK44)；C：特异性引物HS2A鉴定HS2突变体及其杂交组合(HS2xC312,HS2xYZ1,HS2xXC7,HS2xZX1,HS2xLX1,HS2xXC5,HS2xZX1-52,HS2xZX1-61)；M是DNA标准物DL2000。
图2特异性引物HS2A鉴定HS2紫化突变体和棉花品系C312杂交F2植株的琼脂糖凝胶电泳图。
A：HS2紫化突变体植株；B：棉花C312植株；C、E、F、G：HS2和C312的杂交F2分离群体；H：功能分子标记HS2A鉴定F2群体(P:Purple，紫色性状；G：Green，绿色性状；M：DNAMarker)。
图3：特异性引物HS2B鉴定HS2紫化突变体和棉花品种ZX1杂交衍生系。
A-B：HS2紫化突变体和棉花品种ZX1杂交的F4田间植株；C：特异性引物HS2B鉴定HS2紫化突变体和棉花品种ZX1杂交F4群体植株。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术，在Ausubel编写的由John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in Molecular Biology和J.Sambrook等编写的由Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)出版的MolecularCloning:A Laboratory Mannual,3rd ED.等文献均有详细的说明。以下实施例中所用的实验材料如无特殊说明均为市售购买产品。
实施例1：棉花紫化突变体T-DNA插入位点侧翼序列分离和比对
棉花紫化突变体是由外源T-DNA(pBI121)插入陆地棉C312获得的转基因陆地棉C312突变体，利用农杆菌介导的转基因技术，把外源T-DNA导入陆地棉C312(Coker312)中，从后代的转基因株系中获得紫化突变体，标记为紫化突变体HS2(即植物类黄酮甲基化转移酶(简称GhOMT)基因被沉默不再表达)。在自然培养条件下，紫化突变体HS2从种子萌发开始到植株死亡，其整个生长发育过程，所有的组织器官都呈现紫色性状，并稳定遗传。
根据TAIL-PCR技术(Liu YG,Mitsukawa N,Oosumi T,Whittier RF(1995)Efficient isolation and mapping of Arabidopsis thaliana T-DNAinsert junctionsby thermal asymmetric interlaced PCR.Plant Journal,8:457–463)，利用外源载体左边界序列和右边界序列设计特异引物左边界引物(GSP1L，GSP2L)和右边界引物(GSP1R，GSP2R)，结合简并引物(简并引物为Liu YG,Mitsukawa N,Oosumi T,Whittier RF(1995)Efficient isolation and mapping of Arabidopsis thaliana T-DNAinsert junctionsby thermal asymmetric interlaced PCR.Plant J 8:457–463)，进行TAIL-PCR扩增HS2突变体外源基因插入位点两边的侧翼序列，然后克隆测序。根据T-DNA插入位点侧翼序列和外源T-DNA载体左右边界序列，利用在线引物设计软件(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)设计2对特异引物HS2A(HS2APF+HS2A)和HS2B(HS2B+HS2BPR)(见表1)。PCR扩增体系和反应程序如下：
PCR反应成分：
反应参数：
95℃，3分；94℃，30秒，58℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸5分钟。
表1.侧翼序列和载体边界序列的扩增特异引物
实施例2：棉花紫化突变性状的功能型特异分子标记的设计与验证
1、利用实施例1的棉花紫化突变体HS2作为亲本之一，分别与新彩1号(XC1)、新彩5号(XC5)、新彩7号(XC7)、绿絮1号(LX1)、棕絮1号(ZX1)、棕絮1-61(ZX1-61)、棕絮1-52(ZX1-52)杂交得到杂交组合F1。
2、采用PCR方法，用表1中的两对引物(HS2APF和HS2A、HS2B和HS2BPR)分别扩增棉花紫化突变体HS2植株、棉花不同品系植株(LX1、ZX1、ZX1-61、ZX1-52、XC7、XC5、XC1、C312、YZ1、ZM41和GK44)、杂交组合F1株系(HS2x XC1、HS2xXC5、HS2xXC7、HS2xZX1、HS2xLX1、HS2xZX1-52、HS2xZX1-61)或杂交组合的F2分离群体(紫化突变体HS2和棉花品系C312杂交F2植株、紫化突变体HS2和棉花品种ZX1杂交的F4田间植株)的基因组DNA(见表2)。PCR扩增体系和反应程序如实施例1。
利用PCR扩增技术，PCR产物经琼脂糖胶确定显示，仅能从棉花紫化突变体HS2及其杂交植株中扩增特定大小的特异片段，HS2APF和HS2A引物的PCR扩增产物为520bp，HS2B和HS2BPR引物的PCR扩增产物为560bp，这两对引物可以单独应用，也可以同时应用(见图1中A、B)。而供测的棉花不同品系，陆地棉和彩色棉品种/品系(C312,YZ1,XC7,ZX1,LX1,XC5,XC1,ZX1-61,ZX1-52和ZM41,GK44)中，不能扩增出特定大小的特异片段(见图1中A、B)，从而说明标记的特异性及可靠性。
图1中C表明，利用HS2APF和HS2A引物组合在棉花紫化突变体HS2和其所有杂交组合能扩增出特定大小的目标条带，从而说明标记的特异性及可靠性。
3、利用特异性引物HS2A(HS2APF+HS2A)鉴定HS2紫化突变体和棉花品系C312杂交F2分离群体(性状见图2中A、B、C、E、F、G)，PCR检测分析表明(见图2中H)分子标记鉴定结果与紫化性状观察结果完全吻合，说明这些功能型分子标记可以应用到紫化突变等育种应用辅助选择上，该功能分子标记能够准确鉴定紫化突变性状。
4、利用特异性引物HS2B(HS2B+HS2BPR)鉴定HS2紫化突变体和棉花品种ZX1杂交衍生系(性状见图3中A、B)，PCR检测分析表明(见图3中C)。
表2.杂交后代的紫化性状和功能分子标记鉴定结果
备注：“√”为功能标记条带；“P”为具有紫化性状，整株呈现紫色性状；“×”为没有功能标记；“G”：植株为绿色。
实验结果表明，分子鉴定结果与所有后代呈现紫化性状完全吻合，这两对分子标记与棉花紫化性状共分离并呈特异带型，说明这些功能型分子标记可以应用到紫化突变性状等杂交、聚合等育种应用辅助选择上。
序列表
<110> 浙江理工大学
<120> 一种棉花紫化突变体HS2的特异性鉴定引物及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
gtccgcaatg tgttattaag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
agtcatttgc agtaccacct 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
tcatcatttt ggctccgtaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
ttgacaggat atattggcgg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
aactggaaca acactcaacc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 6
gcttgctgca actctctcag 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 7
tccgctcatg atcagattgt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 8
gttgcggttc tgtcagttcc 20

Claims (5)

1.一种棉花紫化突变体HS2的特异性鉴定引物，其特征在于所述特异性鉴定引物为HS2A和HS2APF、HS2B和HS2BPR两对引物中的一对或两对；
HS2APF：GTCCGCAATGTGTTATTAAG；
HS2A：AGTCATTTGCAGTACCACCT；
HS2B：TCATCATTTTGGCTCCGTAA；
HS2BPR：TTGACAGGATATATTGGCGG。
2.一种权利要求1所述棉花紫化突变HS2的特异性鉴定引物在棉花紫化性状PCR检测和筛选中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述PCR检测以待测棉花的基因组DNA为模板，分别以HS2APF和HS2A、HS2B和HS2BPR中的一对或两对为引物进行PCR扩增，若HS2APF和HS2A引物对的PCR扩增产物大小为520bp，和/或HS2B和HS2BPR引物对的PCR扩增产物大小为560bp，则待测棉花含紫化突变体HS2。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述PCR扩增体系为：50ng/μl模板DNA1微升、10mM dNTP 0.5微升、20μM上游引物0.25微升、20μM下游引物0.25微升、10×缓冲液2微升、Taq酶1U，总反应体积20微升。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述PCR扩增条件为：95℃，3分；94℃，30秒，58℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸5分钟。
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