CN104004845A - 鉴定待测品种是否为中棉所63的方法及其专用引物组 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定待测品种是否为中棉所63的方法及其专用引物组。本发明提供的方法，包括如下步骤：以待测棉花的基因组DNA为模板，分别采用CIR62、CS62、NAU1070、NAU1102、NAU1186、NAU2026、NAU2173、NAU2277、NAU2343、NAU1196、NAU1085、NAU1255、NAU1369、NAU1233、NAU1269、NAU2272、NAU1187、NAU1375、CS51、NAU1028、NAU2342、NAU868、HAU1300、NAU6094、DPL0238、NAU1362、NAU859、HAU2786、CGR6410和NAU0478引物对进行PCR扩增，如果PCR扩增产物满足标准1)至30)中的28条以上，待测棉花为中棉所63。本发明可应用于监控制种的质量，保证销售的中棉所63种子的质量，同时打击假冒的中棉所63种子。

Description

鉴定待测品种是否为中棉所63的方法及其专用引物组
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定待测品种是否为中棉所63的方法及其专用引物组。
背景技术
棉花的杂种优势明显，杂交棉品种已应用多年，增产效果明显，已得到大面积的推广应用。目前棉花的杂交制种仍以人工制种为主，不育系制种还没有得到推广，随着用工成本的不断上涨，杂交制种成本越来越高，种子质量越来越差，市场上销售的杂交棉种子做假严重，有F2替代F1，有常规棉替代F1，有母本掺杂等现象，使杂交种在推广中达不到应有的增产效果，影响杂交棉的推广效果。常规的田间鉴定时间长，会影响当年的种子销售，而且在海南加代鉴定时由于受环境影响，鉴定效果也不很理想。
中棉所63为中国农业科学院棉花研究所育成的转基因抗虫杂交棉，于2004-2005年参加长江流域国家棉花品种区域试验，35点次汇总结果如下：平均子棉产量3567.30kg/公顷，比对照种(湘杂棉2号F1)增产10.1％；平均皮棉产量1478.55kg/公顷，比对照种增产10.0％，居第1位，增产极显著；霜前皮棉产量1310.40kg/公顷，比对照种增产10.2％。2006年长江流域棉区10个点生产试验结果：子棉、皮棉产量分别为3876.00kg/公顷、1585.50kg/公顷，分别比对照种(湘杂棉8号F1)增产0.4％和增产2.3％。纤维品质农业部棉花品质监督检验测试中心检测，2004--2005年长江流域区域试验35点次棉样汇总(HVICC校准值)：上半部平均长度30.0mm，断裂比强度29.1cN/tex，麦克隆值4.8，断裂伸长率7.0％，反射率76.1％，黄度深度8.2，整齐度指数84.2％，纺纱均匀性指数139。
2007年中棉所63通过了国家审定，2012年长江流域累计推广种植55万亩。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定待测品种是否为中棉所63的方法及其专用引物组。
本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定待测棉花是否为中棉所63的方法，包括如下步骤：
以待测棉花的基因组DNA为模板，分别采用CIR62引物对、CS62引物对、NAU1070引物对、NAU1102引物对、NAU1186引物对、NAU2026引物对、NAU2173引物对、NAU2277引物对、NAU2343引物对、NAU1196引物对、NAU1085引物对、NAU1255引物对、NAU1369引物对、NAU1233引物对、NAU1269引物对、NAU2272引物对、NAU1187引物对、NAU1375引物对、CS51引物对、NAU1028引物对、NAU2342引物对、NAU868引物对、HAU1300引物对、NAU6094引物对、DPL0238引物对、NAU1362引物对、NAU859引物对、HAU2786引物对、CGR6410引物对和NAU0478引物对进行PCR扩增，如果PCR扩增产物满足标准1)至标准30)中的28条以上，待测棉花为中棉所63或待测棉花为候选的中棉所63；
所述CIR62引物对由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成；所述CS62引物对由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成；所述NAU1070引物对由序列表的序列5所示的单链DNA分子和序列表的序列6所示的单链DNA分子组成；所述NAU1102引物对由序列表的序列7所示的单链DNA分子和序列表的序列8所示的单链DNA分子组成；所述NAU1186引物对由序列表的序列9所示的单链DNA分子和序列表的序列10所示的单链DNA分子组成；所述NAU2026引物对由序列表的序列11所示的单链DNA分子和序列表的序列12所示的单链DNA分子组成；所述NAU2173引物对由序列表的序列13所示的单链DNA分子和序列表的序列14所示的单链DNA分子组成；所述NAU2277引物对由序列表的序列15所示的单链DNA分子和序列表的序列16所示的单链DNA分子组成；所述NAU2343引物对由序列表的序列17所示的单链DNA分子和序列表的序列18所示的单链DNA分子组成；所述NAU1196引物对由序列表的序列19所示的单链DNA分子和序列表的序列20所示的单链DNA分子组成；所述NAU1085引物对由序列表的序列21所示的单链DNA分子和序列表的序列22所示的单链DNA分子组成；所述NAU1255引物对由序列表的序列23所示的单链DNA分子和序列表的序列24所示的单链DNA分子组成；所述NAU1369引物对由序列表的序列25所示的单链DNA分子和序列表的序列26所示的单链DNA分子组成；所述NAU1233引物对由序列表的序列27所示的单链DNA分子和序列表的序列28所示的单链DNA分子组成；所述NAU1269引物对由序列表的序列29所示的单链DNA分子和序列表的序列30所示的单链DNA分子组成；所述NAU2272引物对由序列表的序列31所示的单链DNA分子和序列表的序列32所示的单链DNA分子组成；所述NAU1187引物对由序列表的序列33所示的单链DNA分子和序列表的序列34所示的单链DNA分子组成；所述NAU1375引物对由序列表的序列35所示的单链DNA分子和序列表的序列36所示的单链DNA分子组成；所述CS51引物对由序列表的序列37所示的单链DNA分子和序列表的序列38所示的单链DNA分子组成；所述NAU1028引物对由序列表的序列39所示的单链DNA分子和序列表的序列40所示的单链DNA分子组成；所述NAU2342引物对由序列表的序列41所示的单链DNA分子和序列表的序列42所示的单链DNA分子组成；所述NAU868引物对由序列表的序列43所示的单链DNA分子和序列表的序列44所示的单链DNA分子组成；所述HAU1300引物对由序列表的序列45所示的单链DNA分子和序列表的序列46所示的单链DNA分子组成；所述NAU6094引物对由序列表的序列47所示的单链DNA分子和序列表的序列48所示的单链DNA分子组成；所述DPL0238引物对由序列表的序列49所示的单链DNA分子和序列表的序列50所示的单链DNA分子组成；所述NAU1362引物对由序列表的序列51所示的单链DNA分子和序列表的序列52所示的单链DNA分子组成；所述NAU859引物对由序列表的序列53所示的单链DNA分子和序列表的序列54所示的单链DNA分子组成；所述HAU2786引物对由序列表的序列55所示的单链DNA分子和序列表的序列56所示的单链DNA分子组成；所述CGR6410引物对由序列表的序列57所示的单链DNA分子和序列表的序列58所示的单链DNA分子组成；所述NAU0478引物对由序列表的序列59所示的单链DNA分子和序列表的序列60所示的单链DNA分子组成；
标准1)：采用所述CIR062引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有2条带、在200bp和150bp之间具有2条带；标准2)：采用所述CS62引物对时，满足如下带型：大于500bp具有2条带、在500bp和400bp之间具有2条带、在150-250bp之间具有3条带；标准3)：采用所述NAU1070引物对时，满足如下带型：在250bp和200bp之间具有2条带、在200bp和150bp之间具有1条带；标准4)：采用所述NAU1102引物对时，满足如下带型：大于500bp具有2条带、在250bp和200bp之间具有2条带；标准5)：采用所述NAU1186引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有2条带、在200bp和150bp之间具有2条带；标准6)：采用所述NAU2026引物对时，满足如下带型：在400bp以上具有5条带、在400bp和300bp之间具有1条带、在200bp和150bp之间具有3条带；标准7)：采用所述NAU2173引物对时，满足如下带型：在250bp和200bp之间具有3条带；标准8)：采用所述NAU2277引物对时，满足如下带型：在250bp和200bp之间具有1条带、在150bp和100bp之间具有1条带；标准9)：采用所述NAU2343引物对时，满足如下带型：在400bp和300bp之间具有1条带、在250bp和200bp之间具有2条带；标准10)：采用所述NAU1196引物对时，满足如下带型：在400bp和250bp之间具有4条带、在200bp和150bp之间具有2条带；标准11)：采用所述NAU1085引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有2条带、在250bp和200bp之间具有2条带；标准12)：采用所述NAU1255引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有1条带、在250bp和200bp之间具有2条带；标准13)：采用所述NAU1369引物对时，满足如下带型：在400bp以上具有5条带、在250bp和200bp之间具有2条带；标准14)：采用所述NAU1233引物对时，满足如下带型：大于500bp具有2条带、在300bp和250bp之间具有2条带；标准15)：采用所述NAU1269引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有1条带、在150bp以下具有2条带；标准16)：采用所述NAU2272引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带、在500bp和400bp之间具有1条带、在200bp和150bp之间具有1条带；标准17)：采用所述NAU1187引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带、在200bp和150bp之间具有2条带；标准18)：采用所述NAU1375引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带、在250bp和200bp之间具有2条带；标准19)：采用所述CS51引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带、在200bp和150bp之间具有2条带；标准20)：采用所述NAU1028引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有2条带、在250bp和200bp之间具有2条带；标准21)：采用所述NAU2342引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有1条带、在300bp和250bp之间具有1条带、在200bp和150bp之间具有2条带；标准22)：采用所述NAU868引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带、在500bp和400bp之间具有1条带、在250bp和200bp之间具有1条带、在200bp和150bp之间具有上1条带；标准23)：采用所述HAU1300引物对时，满足如下带型：在400bp以上具有4条带、在250bp和200bp之间具有3条带；标准24)：采用所述NAU6094引物对时，满足如下带型：在400bp以上具有4条带、在250bp和200bp之间具有2条带、在200bp和150bp之间具有2条带；标准25)：采用所述DPL0238引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有4条带、在500bp和400bp之间具有2条带、在250bp和200bp之间具有2条带；标准26)：采用所述NAU1362引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有2条带、在250bp和200bp之间具有2条带；标准27)：采用所述NAU859引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有2条带、在400bp和300bp之间具有2条带、在250bp和200bp之间具有2条带；标准28)：采用所述HAU2786引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有2条带、在500bp和400bp之间具有1条带、在400bp和300bp之间具有1条带、在250bp和200bp之间具有2条带；标准29)：采用所述CGR6410引物对时，满足如下带型：在300bp和150bp之间具有5条带、在150bp和100bp之间具有3条带；标准30)：采用所述NAU0478引物对时，满足如下带型：在250bp和150bp之间具有4条带、在150bp和100bp之间具有3条带。
上述带型具体均为主带带型。
所述PCR扩增的反应程序具体可为：94℃预变性3min；94℃变性30s、56℃退火45s、72℃延伸45s，共30个循环；94℃变性1min、56℃退火45s、72℃延伸2min；4℃保存。
所述待测棉花具体可为中植棉2号、瑞杂816、邯8266或中棉所63。
本发明还保护用于鉴定或辅助鉴定待测棉花是否为中棉所63的引物组(引物组甲)，由所述CIR62引物对、所述CS62引物对、所述NAU1070引物对、所述NAU1102引物对、所述NAU1186引物对、所述NAU2026引物对、所述NAU2173引物对、所述NAU2277引物对、所述NAU2343引物对、所述NAU1196引物对、所述NAU1085引物对、所述NAU1255引物对、所述NAU1369引物对、所述NAU1233引物对、所述NAU1269引物对、所述NAU2272引物对、所述NAU1187引物对、所述NAU1375引物对、所述CS51引物对、所述NAU1028引物对、所述NAU2342引物对、所述NAU868引物对、所述HAU1300引物对、所述NAU6094引物对、所述DPL0238引物对、所述NAU1362引物对、所述NAU859引物对、所述HAU2786引物对、所述CGR6410引物对和所述NAU0478引物对组成。所述待测棉花具体可为中植棉2号、瑞杂816、邯8266或中棉所63。
本发明还保护所述引物组甲在制备用于鉴定或辅助鉴定待测棉花是否为中棉所63的试剂盒中的应用。所述待测棉花具体可为中植棉2号、瑞杂816、邯8266或中棉所63。
本发明还保护一种用于鉴定或辅助鉴定待测棉花是否为中棉所63的试剂盒，含有所述引物组甲。所述待测棉花具体可为中植棉2号、瑞杂816、邯8266或中棉所63。
本发明还保护一种检测一批待测种子的纯度的方法，包括如下步骤：
从待测种子中随机抽取具有统计学意义的待测样本，以待测样本的种仁的基因组DNA为模板，分别采用所述CIR62引物对、所述CS62引物对、所述NAU1070引物对、所述NAU1186引物对、所述NAU2026引物对、所述NAU2173引物对、所述NAU2277引物对、所述NAU2343引物对、所述NAU1085引物对、所述NAU1255引物对、所述NAU1369引物对、所述NAU1233引物对、所述NAU1269引物对、所述NAU2272引物对、所述NAU1187引物对、所述NAU1375引物对、所述CS51引物对、所述NAU1028引物对、所述NAU2342引物对和所述NAU868引物对组进行PCR扩增，如果PCR扩增产物满足标准(1)至标准(20)中的18条以上，待测种子为中棉所63，判断为中棉所63的种子数量占待测样本总数的百分比为待测种子的纯度；所述待测种子为由制种公司或制种农户提供标识为中棉所63的种子；
标准(1)：采用所述CIR062引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有2条带、在200bp和150bp之间具有2条带；标准(2)：采用所述CS62引物对时，满足如下带型：大于500bp具有2条带、在500bp和400bp之间具有2条带、在150-250bp之间具有3条带；标准(3)：采用所述NAU1070引物对时，满足如下带型：在250bp和200bp之间具有2条带、在200bp和150bp之间具有1条带；标准(4)：采用所述NAU1186引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有2条带、在200bp和150bp之间具有2条带；标准(5)：采用所述NAU2026引物对时，满足如下带型：在400bp以上具有5条带、在400bp和300bp之间具有1条带、在200bp和150bp之间具有3条带；标准(6)：采用所述NAU2173引物对时，满足如下带型：在250bp和200bp之间具有3条带；标准(7)：采用所述NAU2277引物对时，满足如下带型：在250bp和200bp之间具有1条带、在150bp和100bp之间具有1条带；标准(8)：采用所述NAU2343引物对时，满足如下带型：在400bp和300bp之间具有1条带、在250bp和200bp之间具有2条带；标准(9)：采用所述NAU1085引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有2条带、在250bp和200bp之间具有2条带；标准(10)：采用所述NAU1255引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有1条带、在250bp和200bp之间具有2条带；标准(11)：采用所述NAU1369引物对时，满足如下带型：在400bp以上具有5条带、在250bp和200bp之间具有2条带；标准(12)：采用所述NAU1233引物对时，满足如下带型：大于500bp具有2条带、在300bp和250bp之间具有2条带；标准(13)：采用所述NAU1269引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有1条带、在150bp以下具有2条带；标准(14)：采用所述NAU2272引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带、在500bp和400bp之间具有1条带、在200bp和150bp之间具有1条带；标准(15)：采用所述NAU1187引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带、在200bp和150bp之间具有2条带；标准(16)：采用所述NAU1375引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带、在250bp和200bp之间具有2条带；标准(17)：采用所述CS51引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带、在200bp和150bp之间具有2条带；标准(18)：采用所述NAU1028引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有2条带、在250bp和200bp之间具有2条带；标准(19)：采用所述NAU2342引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有1条带、在300bp和250bp之间具有1条带、在200bp和150bp之间具有2条带；标准(20)：采用所述NAU868引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带、在500bp和400bp之间具有1条带、在250bp和200bp之间具有1条带、在200bp和150bp之间具有上1条带。
上述带型具体均为主带带型。
所述PCR扩增的反应程序具体可为：94℃预变性3min；94℃变性30s、56℃退火45s、72℃延伸45s，共30个循环；94℃变性1min、56℃退火45s、72℃延伸2min；4℃保存。
本发明还保护一种用于检测一批待测种子的纯度的引物组(引物组乙)，由所述CIR62引物对、所述CS62引物对、所述NAU1070引物对、所述NAU1186引物对、所述NAU2026引物对、所述NAU2173引物对、所述NAU2277引物对、所述NAU2343引物对、所述NAU1085引物对、所述NAU1255引物对、所述NAU1369引物对、所述NAU1233引物对、所述NAU1269引物对、所述NAU2272引物对、所述NAU1187引物对、所述NAU1375引物对、所述CS51引物对、所述NAU1028引物对、所述NAU2342引物对和所述NAU868引物对组成；所述待测种子为由制种公司或制种农户提供标识为中棉所63的种子。
本发明还保护所述引物组乙在制备用于鉴定一批待测种子的纯度的试剂盒中的应用；所述待测种子为由制种公司或制种农户提供标识为中棉所63的种子。
本发明还保护一种鉴定一批待测种子的纯度的试剂盒，含有所述引物组乙；所述待测种子为由制种公司或制种农户提供标识为中棉所63的种子。
本发明中应用SSR分子标记室内鉴定棉花品种的真实性和纯度，图谱清晰、鉴定速度快，且不受环境的影响，能快速鉴定种子的真实性及纯度，正确快速判断种子能否应用，能否收购加工。本发明可应用于监控制种的质量，保证销售的中棉所63种子的质量，同时打击假冒的中棉所63种子，保护育种人的知识产权，保护品种权，保护棉农的利益。
附图说明
图1至图30为实施例1的结果。
图31为实施例2的结果。
图32至图51为实施例3的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1、中棉所63的DNA指纹图谱的构建
一、SSR引物对的筛选
经过大量的棉花SSR引物筛选，发现30个SSR引物对(核苷酸序列见表1)可以用于制作中棉所63的DNA指纹图谱。
表130个引物对的核苷酸序列
序号 引物名称 正向引物(5’→3’) 反向引物(5’→3’)
1 CIR62 TTTAGAGGAGAAGTTTAGG(序列1) CAGTCTCTTGTAGTTTCATT(序列2)
2 CS62 GATGGCTACCTCCCTTTGTA(序列3) CGTAAGGAAGCCTAGCAAAA(序列4)
3 NAU1070 ACCAACAATGGTGACCTCTT(序列5) CCCTCCATAACCAAAAGTTG(序列6)
4 NAU1102 ATCTCTCTGTCTCCCCCTTC(序列7) GCATATCTGGCGGGTATAAT(序列8)
5 NAU1186 AATGGTCCTGCTCCAGATT(序列9) AATCGTCGTCGTCGAATTAT(序列10)
6 NAU2026 GAATCTCGAAAACCCCATCT(序列11) ATTTGGAAGCGAAGTACCAG(序列12)
7 NAU2173 GCCAAATAGGTCACACACAA(序列13) AGCGAGAAGGAGACAGAAAA(序列14)
8 NAU2277 GAACTAGCCACATGATGCAC(序列15) TTGTTGAGGCATTAGTTTGC(序列16)
9 NAU2343 GCTTTGCTTTGGAATGAGAT(序列17) ATACTGCAACCCCTCACACT(序列18)
10 NAU1196 ATCTGTTTCCGTACCCTCAA(序列19) ATGGTTGCCCAAACAATACT(序列20)
11 NAU1085 AGTCGCCCCTTCTCTAATTT(序列21) TGTAAACCGAACTCGTTGTG(序列22)
12 NAU1255 CATGCAAATCCATGCTAGAG(序列23) GGTTTCTTTGGTGGTGAAAC(序列24)
13 NAU1369 TGGCAGAGATGAATGTAAGC(序列25) GGTAACGGATGGAAAATCAC(序列26)
14 NAU1233 TTCGGGAAAGTTAGAGGAGA(序列27) TCCTCAGAGCTCGGAATAGT(序列28)
15 NAU1269 TACCTGAAACCCAAAATGGT(序列29) ACGCTGTTATAGGGCTCATC(序列30)
16 NAU2272 AAAGGAAGCAGGAGAGACAA(序列31) CTTCTTCATTCATGGCCTTC(序列32)
17 NAU1187 AACAAGAGCCAAGGTTCATC(序列33) GGATGCTGTATAGGGCTCAT(序列34)
18 NAU1375 CTTCATTGCTCTTCCACCTC(序列35) GATGGGATAATGGCAACTTC(序列36)
19 CS51 AGAGAGCAAAAGCACGAGAC(序列37) CTAACAGGGGTGACATAGGG(序列38)
20 NAU1028 CCGCCTAAGACTAATTGGAA(序列39) CAAATTGTAAGTGGCTGAGA(序列40)
21 NAU2342 TGTGGGTGCTTGTTACATTC(序列41) CAAGGATGAGGAATCTCAGG(序列42)
22 NAU868 GGCAAAACCATAAGGGTAAC(序列43) TAGCGTGAGATTGTGGCTTA(序列44)
23 HAU1300 GGGAGGCAAGTTTGATTAGA(序列45) TCGAAATGATCAAGTGTTGG(序列46)
24 NAU6094 ACTGCCTTCTGAACATAGCC(序列47) ATCTTGAGTGCAAGGGAAAC(序列48)
25 DPL0238 GTGGAGGTGTATTTCTATCGATCC(序列49) GTTGCTAACAGGCGAGACATAAA(序列50)
26 NAU1362 TCTGATTTGCTGATTGGAAA(序列51) CTTATTCGGACTTGGTTGCT(序列52)
27 NAU859 CAGGCTTCATCTTTTTGGAC(序列53) CATTGGATCCTAGTGGGAAG(序列54)
28 HAU2786 AGAATGGCATCTGAAGGCGAGA(序列55) GGGTCGTTTTGTGCCACTGC(序列56)
29 CGR6410 GAGTTCGGACCTCAATCGAC(序列57) AAGCCGTCATCCAACAACAG(序列58)
30 NAU0478 TGCATCTGATCTAATTGTTGGTG(序列59) TGTTCCTCACAGCAAGAGCA(序列60)
二、DNA指纹图谱的制作
以中棉所63的父本的基因组DNA为模板，分别用30个SSR引物对进行PCR扩增，然后进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染显色。以中棉所63的母本的基因组DNA为模板，分别用30个SSR引物对进行PCR扩增，然后进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染显色。以中棉所63的基因组DNA为模板，分别用30个SSR引物对进行PCR扩增，然后进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染显色。
PCR体系(10.0μL)：基因组DNA1μL、ddH2O6.5μL、Buffer(含MgCl2)1μL、dNTP(10mM)0.3μL、正向引物(10μM)0.5μL、反向引物(10μM)0.5μL、Taq酶(2.5U/μL)0.2μL。
PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s、56℃退火45s、72℃延伸45s，共30个循环；94℃变性1min、56℃退火45s、72℃延伸2min；4℃保存。
聚丙烯酰胺凝胶电泳的参数：每孔的点样量为1.8μL；200v电压、50min。
采用CIR62引物对的图谱见图1。中棉所63的父本、中棉所63的母本和中棉所63的带型均一致，用“2”表示。
采用CS62引物对的图谱见图2。中棉所63的父本的带型用“1”表示。中棉所63的母本的带型用“2”表示。中棉所63为父本和母本的共显性带型，用“3”表示。
采用NAU1070引物对的图谱见图3。中棉所63的父本、中棉所63的母本和中棉所63的带型均一致，用“1”表示。
采用NAU1102引物对的图谱见图4。中棉所63的父本、中棉所63的母本和中棉所63的带型均一致，用“1”表示。
采用NAU1186引物对的图谱见图5。中棉所63的父本、中棉所63的母本和中棉所63的带型均一致，用“2”表示。
采用NAU2026引物对的图谱见图6。中棉所63的父本的带型用“2”表示。中棉所63的母本的带型用“1”表示。中棉所63为父本和母本的共显性带型，用“3”表示。
采用NAU2173引物对的图谱见图7。中棉所63的父本、中棉所63的母本和中棉所63的带型均一致，用“1”表示。
采用NAU2277引物对的图谱见图8。中棉所63的父本、中棉所63的母本和中棉所63的带型均一致，用“2”表示。
采用NAU2343引物对的图谱见图9。中棉所63的父本、中棉所63的母本和中棉所63的带型均一致，用“1”表示。
采用NAU1196引物对的图谱见图10。中棉所63的父本的带型用“2”表示。中棉所63的母本的带型用“1”表示。中棉所63为父本和母本的共显性带型，用“3”表示。
采用NAU1085引物对的图谱见图11。中棉所63的父本的带型用“1”表示。中棉所63的母本的带型用“2”表示。中棉所63为父本和母本的共显性带型，用“3”表示。
采用NAU1255引物对的图谱见图12。中棉所63的父本、中棉所63的母本和中棉所63的带型均一致，用“1”表示。
采用NAU1369引物对的图谱见图13。中棉所63的父本的带型用“2”表示。中棉所63的母本的带型用“1”表示。中棉所63为父本和母本的共显性带型，用“3”表示。
采用NAU1233引物对的图谱见图14。中棉所63的父本、中棉所63的母本和中棉所63的带型均一致，用“2”表示。
采用NAU1269引物对的图谱见图15。中棉所63的父本、中棉所63的母本和中棉所63的带型均一致，用“1”表示。
采用NAU2272引物对的图谱见图16。中棉所63的父本、中棉所63的母本和中棉所63的带型均一致，用“1”表示。
采用NAU1187引物对的图谱见图17。中棉所63的父本、中棉所63的母本和中棉所63的带型均一致，用“1”表示。
采用NAU1375引物对的图谱见图18。中棉所63的父本、中棉所63的母本和中棉所63的带型均一致，用“2”表示。
采用CS51引物对的图谱见图19。中棉所63的父本、中棉所63的母本和中棉所63的带型均一致，用“1”表示。
采用NAU1028引物对的图谱见图20。中棉所63的父本、中棉所63的母本和中棉所63的带型均一致，用“1”表示。
采用NAU2342引物对的图谱见图21。中棉所63的父本、中棉所63的母本和中棉所63的带型均一致，用“2”表示。
采用NAU868引物对的图谱见图22。中棉所63的父本、中棉所63的母本和中棉所63的带型均一致，用“1”表示。
采用HAU1300引物对的图谱见图23。中棉所63的父本的带型用“2”表示。中棉所63的母本的带型用“1”表示。中棉所63为父本和母本的共显性带型，用“3”表示。
采用NAU6094引物对的图谱见图24。中棉所63的父本的带型用“1”表示。中棉所63的母本的带型用“2”表示。中棉所63为父本和母本的共显性带型，用“3”表示。
采用DPL0238引物对的图谱见图25。中棉所63的父本的带型用“1”表示。中棉所63的母本的带型用“2”表示。中棉所63为父本和母本的共显性带型，用“3”表示。
采用NAU1362引物对的图谱见图26。中棉所63的父本的带型用“1”表示。中棉所63的母本的带型用“2”表示。中棉所63为父本和母本的共显性带型，用“3”表示。
采用NAU859引物对的图谱见图27。中棉所63的父本的带型用“2”表示。中棉所63的母本的带型用“1”表示。中棉所63为父本和母本的共显性带型，用“3”表示。
采用HAU2786引物对的图谱见图28。中棉所63的父本的带型用“2”表示。中棉所63的母本的带型用“1”表示。中棉所63为父本和母本的共显性带型，用“3”表示。
采用CGR6410引物对的图谱见图29。中棉所63的父本的带型用“2”表示。中棉所63的母本的带型用“1”表示。中棉所63为父本和母本的共显性带型，用“3”表示。
采用NAU0478引物对的图谱见图30。中棉所63的父本的带型用“2”表示。中棉所63的母本的带型用“1”表示。中棉所63为父本和母本的共显性带型，用“3”表示。
具体见表2。
表2采用各个引物对的带型
中棉所63的父本 中棉所63的母本 中棉所63
CIR62 2 2 2
CS62 1 2 3
NAU1070 1 1 1
NAU1102 1 1 1
NAU1186 2 2 2
NAU2026 2 1 3
NAU2173 1 1 1
NAU2277 2 2 2
NAU2343 1 1 1
NAU1196 2 1 3
NAU1085 1 2 3
NAU1255 1 1 1
NAU1369 2 1 3
NAU1233 2 2 2
NAU1269 1 1 1
NAU2272 1 1 1
NAU1187 1 1 1
NAU1375 2 2 2
CS51 1 1 1
NAU1028 1 1 1
NAU2342 2 2 2
NAU868 1 1 1
HAU1300 2 1 3
NAU6094 1 2 3
DPL0238 1 2 3
NAU1362 1 2 3
NAU859 2 1 3
HAU2786 2 1 3
CGR6410 2 1 3
NAU0478 2 1 3
实施例2、应用30个SSR引物对辅助鉴定中棉所63
分别对如下几个棉花品种进行检测：中植棉2号(中国农业科学院植物保护所)、瑞杂816(济南鑫瑞种业)、邯8266(邯郸市农科院)、中棉所63(中棉种业)。
检测方法：提取棉花叶片的基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别用所述30个SSR引物对进行PCR扩增，然后进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染显色。
PCR体系和PCR反应程序均同实施例1。
电泳图见图31(1、2、3、4分别表示中棉所63、中植棉2号、瑞杂816和邯8266)。带型结果见表3。
表3采用30对引物对不同棉花品种的基因组DNA扩增后的带型
建立具体评判标准如下：
1)采用CIR062引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有2条带、在200bp和150bp之间具有2条带；
2)采用CS62引物对时，满足如下带型：大于500bp具有2条带、在500bp和400bp之间具有2条带、在150-250bp之间具有3条带；
3)采用NAU1070引物对时，满足如下带型：在250bp和200bp之间具有2条带、在200bp和150bp之间具有1条带；
4)采用NAU1102引物对时，满足如下带型：大于500bp具有2条带、在250bp和200bp之间具有2条带；
5)采用NAU1186引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有2条带、在200bp和150bp之间具有2条带；
6)采用NAU2026引物对时，满足如下带型：在400bp以上具有5条带、在400bp和300bp之间具有1条带、在200bp和150bp之间具有3条带；
7)采用NAU2173引物对时，满足如下带型：在250bp和200bp之间具有3条带；
8)采用NAU2277引物对时，满足如下带型：在250bp和200bp之间具有1条带、在150bp和100bp之间具有1条带；
9)采用NAU2343引物对时，满足如下带型：在400bp和300bp之间具有1条带、在250bp和200bp之间具有2条带；
10)采用NAU1196引物对时，满足如下带型：在400bp和250bp之间具有4条带、在200bp和150bp之间具有2条带；
11)采用NAU1085引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有2条带、在250bp和200bp之间具有2条带；
12)采用NAU1255引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有1条带、在250bp和200bp之间具有2条带；
13)采用NAU1369引物对时，满足如下带型：在400bp以上具有5条带、在250bp和200bp之间具有2条带；
14)采用NAU1233引物对时，满足如下带型：大于500bp具有2条带，在300bp和250bp之间具有2条带；
15)采用NAU1269引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有1条带、在150bp以下具有2条带；
16)采用NAU2272引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带，在500bp和400bp之间具有1条带、在200bp和150bp之间具有1条带；
17)采用NAU1187引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带、在200bp和150bp之间具有2条带；
18)采用NAU1375引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带、在250bp和200bp之间具有2条带；
19)采用CS51引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带、在200bp和150bp之间具有2条带；
20)采用NAU1028引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有2条带、在250bp和200bp之间具有2条带；
21)采用NAU2342引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有1条带、在300bp和250bp之间具有1条带、在200bp和150bp之间具有2条带；
22)采用NAU868引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带，在500bp和400bp之间具有1条带、在250bp和200bp之间具有1条带、在200bp和150bp之间具有上1条带；
23)采用HAU1300引物对时，满足如下带型：在400bp以上具有4条带、在250bp和200bp之间具有3条带；
24)采用NAU6094引物对时，满足如下带型：在400bp以上具有4条带、在250bp和200bp之间具有2条带、在200bp和150bp之间具有2条带；
25)采用DPL0238引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有4条带、在500bp和400bp之间具有2条带、在250bp和200bp之间具有2条带；
26)采用NAU1362引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有2条带、在250bp和200bp之间具有2条带；
27)采用NAU859引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有2条带、在400bp和300bp之间具有2条带、在250bp和200bp之间具有2条带；
28)采用HAU2786引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有2条带、在500bp和400bp之间具有1条带、在400bp和300bp之间具有1条带、在250bp和200bp之间具有2条带；
29)采用CGR6410引物对时，满足如下带型：在300bp和150bp之间具有5条带、在150bp和100bp之间具有3条带；
30)采用NAU0478引物对时，满足如下带型：在250bp和150bp之间具有4条带、在150bp和100bp之间具有3条带；
以待测棉花的基因组DNA为模板，分别采用上述30对引物进行PCR扩增，如果PCR扩增产物满足标准(1)至标准(30)中的28条以上，待测棉花为中棉所63或待测棉花为候选的中棉所63。
实施例3、应用30个SSR引物对中的20个引物对鉴定种子纯度
从制种公司收取一批中棉所63(种子形式，共200粒；种子理论上为中棉所63，但通常由于制种过程中的操作水平所限，较难实现100％的纯度，存在母本植株现象或其它掺杂现象)，从200粒种子中随机抽取26粒，分别提取种仁的基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别用20个SSR引物对(具体的SSR引物对见表4)进行PCR扩增，然后进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染显色。分别以中棉所63的父本(2个重复样本)的基因组DNA为模板，分别用20个SSR引物对进行PCR扩增，然后进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染显色。分别以中棉所63的母本(2个重复样本)的基因组DNA为模板，分别用20个SSR引物对进行PCR扩增，然后进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染显色。
PCR体系和PCR反应程序均同实施例1。
PCR体系(10.0μL)：基因组DNA1μL、ddH2O6.5μL、Buffer(含MgCl2)1μL、dNTP(10mM)0.3μL、正向引物(10μM)0.5μL、反向引物(10μM)0.5μL、Taq酶(2.5U/μL)0.2μL。
PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s、56℃退火45s、72℃延伸45s，共30个循环；94℃变性1min、56℃退火45s、72℃延伸2min；4℃保存。
聚丙烯酰胺凝胶电泳的参数：每孔的点样量为1.8μL；200v电压、50min。
结果见表4和表5。
采用CIR62引物对的图谱见图32。采用CS62引物对的图谱见图33。采用NAU1070引物对的图谱见图34。采用NAU1186引物对的图谱见图35。采用NAU2026引物对的图谱见图36。采用NAU2173引物对的图谱见图37。采用NAU2277引物对的图谱见图38。采用NAU2343引物对的图谱见图39。采用NAU1085引物对的图谱见图40。采用NAU1255引物对的图谱见图41。采用NAU1369引物对的图谱见图42。采用NAU1233引物对的图谱见图43。采用NAU1269引物对的图谱见图44。采用NAU2272引物对的图谱见图45。采用NAU1187引物对的图谱见图46。采用NAU1375引物对的图谱见图47。采用CS51引物对的图谱见图48。采用NAU1028引物对的图谱见图49。采用NAU2342引物对的图谱见图50。采用NAU868引物对的图谱见图51。
表4采用20对引物对不同单株的基因组DNA扩增后的带型(10对引物)(带型描述同实施例1)
表5采用20对引物对不同单株的基因组DNA扩增后的带型(另10对引物)(带型描述同实施例1)
采用如下标准进行评判：
(1)采用CIR062引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有2条带、在200bp和150bp之间具有2条带；(2)采用CS62引物对时，满足如下带型：大于500bp具有2条带、在500bp和400bp之间具有2条带、在150-250bp之间具有3条带；(3)采用NAU1070引物对时，满足如下带型：在250bp和200bp之间具有2条带、在200bp和150bp之间具有1条带；(4)采用NAU1186引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有2条带、在200bp和150bp之间具有2条带；(5)采用NAU2026引物对时，满足如下带型：在400bp以上具有5条带、在400bp和300bp之间具有1条带、在200bp和150bp之间具有3条带；(6)采用NAU2173引物对时，满足如下带型：在250bp和200bp之间具有3条带；(7)采用NAU2277引物对时，满足如下带型：在250bp和200bp之间具有1条带、在150bp和100bp之间具有1条带；(8)采用NAU2343引物对时，满足如下带型：在400bp和300bp之间具有1条带、在250bp和200bp之间具有2条带；(9)采用NAU1085引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有2条带、在250bp和200bp之间具有2条带；(10)采用NAU1255引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有1条带、在250bp和200bp之间具有2条带；(11)采用NAU1369引物对时，满足如下带型：在400bp以上具有5条带、在250bp和200bp之间具有2条带；(12)采用NAU1233引物对时，满足如下带型：大于500bp具有2条带，在300bp和250bp之间具有2条带；(13)采用NAU1269引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有1条带、在150bp以下具有2条带；(14)采用NAU2272引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带，在500bp和400bp之间具有1条带、在200bp和150bp之间具有1条带；
(15)采用NAU1187引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带、在200bp和150bp之间具有2条带；(16)采用NAU1375引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带、在250bp和200bp之间具有2条带；(17)采用CS51引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带、在200bp和150bp之间具有2条带；(18)采用NAU1028引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有2条带、在250bp和200bp之间具有2条带；(19)采用NAU2342引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有1条带、在300bp和250bp之间具有1条带、在200bp和150bp之间具有2条带；(20)采用NAU868引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带，在500bp和400bp之间具有1条带、在250bp和200bp之间具有1条带、在200bp和150bp之间具有上1条带；
待测种子为由制种公司或制种农户提供标识为中棉所63的种子，从待测种子中随机抽取具有统计学意义的待测样本，以待测样本的种仁的基因组DNA为模板，分别采用上述20对引物进行PCR扩增，如果PCR扩增产物满足标准(1)至标准(20)中的18条以上，待测种子为中棉所63，判断为中棉所63的种子数量占待测样本总数的百分比为待测种子的纯度(又称待测种子的SSR标记纯度)。
上述26粒种子中，种子13的图谱与中棉所63杂交种不一致(20个SSR位点中有4个SSR位点不一致，为杂交杂株，这个杂株的形成有可能是天然杂交，有可能是亲本不纯造成的)。种子6、种子15、种子20、种子23和种子26与中棉所63的母本图谱一致，其存在原因有如下几种可能性：剥花时漏去雄，早晨剥大花，收获时掺入母本。其余20粒种子均为中棉所63。这批待测种子的纯度为76.9％。

Claims (8)

1.一种鉴定或辅助鉴定待测棉花是否为中棉所63的方法，包括如下步骤：
以待测棉花的基因组DNA为模板，分别采用CIR62引物对、CS62引物对、NAU1070引物对、NAU1102引物对、NAU1186引物对、NAU2026引物对、NAU2173引物对、NAU2277引物对、NAU2343引物对、NAU1196引物对、NAU1085引物对、NAU1255引物对、NAU1369引物对、NAU1233引物对、NAU1269引物对、NAU2272引物对、NAU1187引物对、NAU1375引物对、CS51引物对、NAU1028引物对、NAU2342引物对、NAU868引物对、HAU1300引物对、NAU6094引物对、DPL0238引物对、NAU1362引物对、NAU859引物对、HAU2786引物对、CGR6410引物对和NAU0478引物对进行PCR扩增，如果PCR扩增产物满足标准1)至标准30)中的28条以上，待测棉花为中棉所63或待测棉花为候选的中棉所63；
所述CIR62引物对由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成；所述CS62引物对由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成；所述NAU1070引物对由序列表的序列5所示的单链DNA分子和序列表的序列6所示的单链DNA分子组成；所述NAU1102引物对由序列表的序列7所示的单链DNA分子和序列表的序列8所示的单链DNA分子组成；所述NAU1186引物对由序列表的序列9所示的单链DNA分子和序列表的序列10所示的单链DNA分子组成；所述NAU2026引物对由序列表的序列11所示的单链DNA分子和序列表的序列12所示的单链DNA分子组成；所述NAU2173引物对由序列表的序列13所示的单链DNA分子和序列表的序列14所示的单链DNA分子组成；所述NAU2277引物对由序列表的序列15所示的单链DNA分子和序列表的序列16所示的单链DNA分子组成；所述NAU2343引物对由序列表的序列17所示的单链DNA分子和序列表的序列18所示的单链DNA分子组成；所述NAU1196引物对由序列表的序列19所示的单链DNA分子和序列表的序列20所示的单链DNA分子组成；所述NAU1085引物对由序列表的序列21所示的单链DNA分子和序列表的序列22所示的单链DNA分子组成；所述NAU1255引物对由序列表的序列23所示的单链DNA分子和序列表的序列24所示的单链DNA分子组成；所述NAU1369引物对由序列表的序列25所示的单链DNA分子和序列表的序列26所示的单链DNA分子组成；所述NAU1233引物对由序列表的序列27所示的单链DNA分子和序列表的序列28所示的单链DNA分子组成；所述NAU1269引物对由序列表的序列29所示的单链DNA分子和序列表的序列30所示的单链DNA分子组成；所述NAU2272引物对由序列表的序列31所示的单链DNA分子和序列表的序列32所示的单链DNA分子组成；所述NAU1187引物对由序列表的序列33所示的单链DNA分子和序列表的序列34所示的单链DNA分子组成；所述NAU1375引物对由序列表的序列35所示的单链DNA分子和序列表的序列36所示的单链DNA分子组成；所述CS51引物对由序列表的序列37所示的单链DNA分子和序列表的序列38所示的单链DNA分子组成；所述NAU1028引物对由序列表的序列39所示的单链DNA分子和序列表的序列40所示的单链DNA分子组成；所述NAU2342引物对由序列表的序列41所示的单链DNA分子和序列表的序列42所示的单链DNA分子组成；所述NAU868引物对由序列表的序列43所示的单链DNA分子和序列表的序列44所示的单链DNA分子组成；所述HAU1300引物对由序列表的序列45所示的单链DNA分子和序列表的序列46所示的单链DNA分子组成；所述NAU6094引物对由序列表的序列47所示的单链DNA分子和序列表的序列48所示的单链DNA分子组成；所述DPL0238引物对由序列表的序列49所示的单链DNA分子和序列表的序列50所示的单链DNA分子组成；所述NAU1362引物对由序列表的序列51所示的单链DNA分子和序列表的序列52所示的单链DNA分子组成；所述NAU859引物对由序列表的序列53所示的单链DNA分子和序列表的序列54所示的单链DNA分子组成；所述HAU2786引物对由序列表的序列55所示的单链DNA分子和序列表的序列56所示的单链DNA分子组成；所述CGR6410引物对由序列表的序列57所示的单链DNA分子和序列表的序列58所示的单链DNA分子组成；所述NAU0478引物对由序列表的序列59所示的单链DNA分子和序列表的序列60所示的单链DNA分子组成；
标准1)：采用所述CIR062引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有2条带、在200bp和150bp之间具有2条带；
标准2)：采用所述CS62引物对时，满足如下带型：大于500bp具有2条带、在500bp和400bp之间具有2条带、在150-250bp之间具有3条带；
标准3)：采用所述NAU1070引物对时，满足如下带型：在250bp和200bp之间具有2条带、在200bp和150bp之间具有1条带；
标准4)：采用所述NAU1102引物对时，满足如下带型：大于500bp具有2条带、在250bp和200bp之间具有2条带；
标准5)：采用所述NAU1186引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有2条带、在200bp和150bp之间具有2条带；
标准6)：采用所述NAU2026引物对时，满足如下带型：在400bp以上具有5条带、在400bp和300bp之间具有1条带、在200bp和150bp之间具有3条带；
标准7)：采用所述NAU2173引物对时，满足如下带型：在250bp和200bp之间具有3条带；
标准8)：采用所述NAU2277引物对时，满足如下带型：在250bp和200bp之间具有1条带、在150bp和100bp之间具有1条带；
标准9)：采用所述NAU2343引物对时，满足如下带型：在400bp和300bp之间具有1条带、在250bp和200bp之间具有2条带；
标准10)：采用所述NAU1196引物对时，满足如下带型：在400bp和250bp之间具有4条带、在200bp和150bp之间具有2条带；
标准11)：采用所述NAU1085引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有2条带、在250bp和200bp之间具有2条带；
标准12)：采用所述NAU1255引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有1条带、在250bp和200bp之间具有2条带；
标准13)：采用所述NAU1369引物对时，满足如下带型：在400bp以上具有5条带、在250bp和200bp之间具有2条带；
标准14)：采用所述NAU1233引物对时，满足如下带型：大于500bp具有2条带、在300bp和250bp之间具有2条带；
标准15)：采用所述NAU1269引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有1条带、在150bp以下具有2条带；
标准16)：采用所述NAU2272引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带、在500bp和400bp之间具有1条带、在200bp和150bp之间具有1条带；
标准17)：采用所述NAU1187引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带、在200bp和150bp之间具有2条带；
标准18)：采用所述NAU1375引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带、在250bp和200bp之间具有2条带；
标准19)：采用所述CS51引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带、在200bp和150bp之间具有2条带；
标准20)：采用所述NAU1028引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有2条带、在250bp和200bp之间具有2条带；
标准21)：采用所述NAU2342引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有1条带、在300bp和250bp之间具有1条带、在200bp和150bp之间具有2条带；
标准22)：采用所述NAU868引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带、在500bp和400bp之间具有1条带、在250bp和200bp之间具有1条带、在200bp和150bp之间具有上1条带；
标准23)：采用所述HAU1300引物对时，满足如下带型：在400bp以上具有4条带、在250bp和200bp之间具有3条带；
标准24)：采用所述NAU6094引物对时，满足如下带型：在400bp以上具有4条带、在250bp和200bp之间具有2条带、在200bp和150bp之间具有2条带；
标准25)：采用所述DPL0238引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有4条带、在500bp和400bp之间具有2条带、在250bp和200bp之间具有2条带；
标准26)：采用所述NAU1362引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有2条带、在250bp和200bp之间具有2条带；
标准27)：采用所述NAU859引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有2条带、在400bp和300bp之间具有2条带、在250bp和200bp之间具有2条带；
标准28)：采用所述HAU2786引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有2条带、在500bp和400bp之间具有1条带、在400bp和300bp之间具有1条带、在250bp和200bp之间具有2条带；
标准29)：采用所述CGR6410引物对时，满足如下带型：在300bp和150bp之间具有5条带、在150bp和100bp之间具有3条带；
标准30)：采用所述NAU0478引物对时，满足如下带型：在250bp和150bp之间具有4条带、在150bp和100bp之间具有3条带。
2.用于鉴定或辅助鉴定待测棉花是否为中棉所63的引物组，由权利要求1中的所述CIR62引物对、所述CS62引物对、所述NAU1070引物对、所述NAU1102引物对、所述NAU1186引物对、所述NAU2026引物对、所述NAU2173引物对、所述NAU2277引物对、所述NAU2343引物对、所述NAU1196引物对、所述NAU1085引物对、所述NAU1255引物对、所述NAU1369引物对、所述NAU1233引物对、所述NAU1269引物对、所述NAU2272引物对、所述NAU1187引物对、所述NAU1375引物对、所述CS51引物对、所述NAU1028引物对、所述NAU2342引物对、所述NAU868引物对、所述HAU1300引物对、所述NAU6094引物对、所述DPL0238引物对、所述NAU1362引物对、所述NAU859引物对、所述HAU2786引物对、所述CGR6410引物对和所述NAU0478引物对组成。
3.权利要求2所述引物组在制备用于鉴定或辅助鉴定待测棉花是否为中棉所63的试剂盒中的应用。
4.一种用于鉴定或辅助鉴定待测棉花是否为中棉所63的试剂盒，含有权利要求2所述引物组。
5.检测一批待测种子的纯度的方法，包括如下步骤：
从待测种子中随机抽取具有统计学意义的待测样本，以待测样本的种仁的基因组DNA为模板，分别采用CIR62引物对、CS62引物对、NAU1070引物对、NAU1186引物对、NAU2026引物对、NAU2173引物对、NAU2277引物对、NAU2343引物对、NAU1085引物对、NAU1255引物对、NAU1369引物对、NAU1233引物对、NAU1269引物对、NAU2272引物对、NAU1187引物对、NAU1375引物对、CS51引物对、NAU1028引物对、NAU2342引物对和NAU868引物对组进行PCR扩增，如果PCR扩增产物满足标准(1)至标准(20)中的18条以上，待测种子为中棉所63，判断为中棉所63的种子数量占待测样本总数的百分比为待测种子的纯度；所述待测种子为由制种公司或制种农户提供标识为中棉所63的种子；
所述CIR62引物对由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成；所述CS62引物对由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成；所述NAU1070引物对由序列表的序列5所示的单链DNA分子和序列表的序列6所示的单链DNA分子组成；所述NAU1186引物对由序列表的序列9所示的单链DNA分子和序列表的序列10所示的单链DNA分子组成；所述NAU2026引物对由序列表的序列11所示的单链DNA分子和序列表的序列12所示的单链DNA分子组成；所述NAU2173引物对由序列表的序列13所示的单链DNA分子和序列表的序列14所示的单链DNA分子组成；所述NAU2277引物对由序列表的序列15所示的单链DNA分子和序列表的序列16所示的单链DNA分子组成；所述NAU2343引物对由序列表的序列17所示的单链DNA分子和序列表的序列18所示的单链DNA分子组成；所述NAU1085引物对由序列表的序列21所示的单链DNA分子和序列表的序列22所示的单链DNA分子组成；所述NAU1255引物对由序列表的序列23所示的单链DNA分子和序列表的序列24所示的单链DNA分子组成；所述NAU1369引物对由序列表的序列25所示的单链DNA分子和序列表的序列26所示的单链DNA分子组成；所述NAU1233引物对由序列表的序列27所示的单链DNA分子和序列表的序列28所示的单链DNA分子组成；所述NAU1269引物对由序列表的序列29所示的单链DNA分子和序列表的序列30所示的单链DNA分子组成；所述NAU2272引物对由序列表的序列31所示的单链DNA分子和序列表的序列32所示的单链DNA分子组成；所述NAU1187引物对由序列表的序列33所示的单链DNA分子和序列表的序列34所示的单链DNA分子组成；所述NAU1375引物对由序列表的序列35所示的单链DNA分子和序列表的序列36所示的单链DNA分子组成；所述CS51引物对由序列表的序列37所示的单链DNA分子和序列表的序列38所示的单链DNA分子组成；所述NAU1028引物对由序列表的序列39所示的单链DNA分子和序列表的序列40所示的单链DNA分子组成；所述NAU2342引物对由序列表的序列41所示的单链DNA分子和序列表的序列42所示的单链DNA分子组成；所述NAU868引物对由序列表的序列43所示的单链DNA分子和序列表的序列44所示的单链DNA分子组成；
标准(1)：采用所述CIR062引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有2条带、在200bp和150bp之间具有2条带；
标准(2)：采用所述CS62引物对时，满足如下带型：大于500bp具有2条带、在500bp和400bp之间具有2条带、在150-250bp之间具有3条带；
标准(3)：采用所述NAU1070引物对时，满足如下带型：在250bp和200bp之间具有2条带、在200bp和150bp之间具有1条带；
标准(4)：采用所述NAU1186引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有2条带、在200bp和150bp之间具有2条带；
标准(5)：采用所述NAU2026引物对时，满足如下带型：在400bp以上具有5条带、在400bp和300bp之间具有1条带、在200bp和150bp之间具有3条带；
标准(6)：采用所述NAU2173引物对时，满足如下带型：在250bp和200bp之间具有3条带；
标准(7)：采用所述NAU2277引物对时，满足如下带型：在250bp和200bp之间具有1条带、在150bp和100bp之间具有1条带；
标准(8)：采用所述NAU2343引物对时，满足如下带型：在400bp和300bp之间具有1条带、在250bp和200bp之间具有2条带；
标准(9)：采用所述NAU1085引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有2条带、在250bp和200bp之间具有2条带；
标准(10)：采用所述NAU1255引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有1条带、在250bp和200bp之间具有2条带；
标准(11)：采用所述NAU1369引物对时，满足如下带型：在400bp以上具有5条带、在250bp和200bp之间具有2条带；
标准(12)：采用所述NAU1233引物对时，满足如下带型：大于500bp具有2条带、在300bp和250bp之间具有2条带；
标准(13)：采用所述NAU1269引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有1条带、在150bp以下具有2条带；
标准(14)：采用所述NAU2272引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带、在500bp和400bp之间具有1条带、在200bp和150bp之间具有1条带；
标准(15)：采用所述NAU1187引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带、在200bp和150bp之间具有2条带；
标准(16)：采用所述NAU1375引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带、在250bp和200bp之间具有2条带；
标准(17)：采用所述CS51引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带、在200bp和150bp之间具有2条带；
标准(18)：采用所述NAU1028引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有2条带、在250bp和200bp之间具有2条带；
标准(19)：采用所述NAU2342引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有1条带、在300bp和250bp之间具有1条带、在200bp和150bp之间具有2条带；
标准(20)：采用所述NAU868引物对时，满足如下带型：在500bp以上具有1条带、在500bp和400bp之间具有1条带、在250bp和200bp之间具有1条带、在200bp和150bp之间具有上1条带。
6.用于检测一批待测种子的纯度的引物组，由权利要求5中的所述CIR62引物对、所述CS62引物对、所述NAU1070引物对、所述NAU1186引物对、所述NAU2026引物对、所述NAU2173引物对、所述NAU2277引物对、所述NAU2343引物对、所述NAU1085引物对、所述NAU1255引物对、所述NAU1369引物对、所述NAU1233引物对、所述NAU1269引物对、所述NAU2272引物对、所述NAU1187引物对、所述NAU1375引物对、所述CS51引物对、所述NAU1028引物对、所述NAU2342引物对和所述NAU868引物对组成；所述待测种子为由制种公司或制种农户提供标识为中棉所63的种子。
7.权利要求6所述引物组在制备用于鉴定一批待测种子的纯度的试剂盒中的应用；所述待测种子为由制种公司或制种农户提供标识为中棉所63的种子。
8.一种鉴定一批待测种子的纯度的试剂盒，含有权利要求6所述引物组；所述待测种子为由制种公司或制种农户提供标识为中棉所63的种子。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104962640A (zh) * 2015-07-14 2015-10-07 山东棉花研究中心 一种利用ssr标记快速鉴定常规棉花品种真实性的方法
CN107142308A (zh) * 2017-05-10 2017-09-08 中国农业科学院棉花研究所 鉴定棉花闭花授粉材料的引物对、试剂盒以及方法
CN109880932A (zh) * 2019-04-25 2019-06-14 中国农业科学院棉花研究所 用于鉴别杂交棉品种中棉1279的ssr引物对及其产品以及鉴别方法
CN110055349A (zh) * 2019-05-24 2019-07-26 中国农业科学院棉花研究所 用于鉴定常规棉中棉所99001的引物组及其产品和检测方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101696450A (zh) * 2009-09-29 2010-04-21 中国农业科学院棉花研究所 辅助鉴别常规棉和杂交棉的方法及其专用试剂盒
US20100279282A1 (en) * 2008-11-12 2010-11-04 Ming-Hwa Liang Methods for genotyping mature cotton fibers and textiles
CN102732973A (zh) * 2012-05-28 2012-10-17 中国农业科学院棉花研究所 一种高通量棉花品种dna指纹库构建方法
CN103555836A (zh) * 2013-10-25 2014-02-05 中国农业科学院棉花研究所 鉴定待测品种是否为瑞杂816的方法及其专用引物组
CN103589799A (zh) * 2013-11-15 2014-02-19 中国农业科学院棉花研究所 一种检测待测制种农户制备的棉花杂交种中是否有自交种的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100279282A1 (en) * 2008-11-12 2010-11-04 Ming-Hwa Liang Methods for genotyping mature cotton fibers and textiles
CN101696450A (zh) * 2009-09-29 2010-04-21 中国农业科学院棉花研究所 辅助鉴别常规棉和杂交棉的方法及其专用试剂盒
CN102732973A (zh) * 2012-05-28 2012-10-17 中国农业科学院棉花研究所 一种高通量棉花品种dna指纹库构建方法
CN103555836A (zh) * 2013-10-25 2014-02-05 中国农业科学院棉花研究所 鉴定待测品种是否为瑞杂816的方法及其专用引物组
CN103589799A (zh) * 2013-11-15 2014-02-19 中国农业科学院棉花研究所 一种检测待测制种农户制备的棉花杂交种中是否有自交种的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
付小琼，叶武威: "亲本未知的棉花F1杂种及其F2单株的SSR分子鉴定", 《分子植物育种》 *
王飞: "SSR分子标记在棉种真实性和纯度中的应用研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104962640A (zh) * 2015-07-14 2015-10-07 山东棉花研究中心 一种利用ssr标记快速鉴定常规棉花品种真实性的方法
CN107142308A (zh) * 2017-05-10 2017-09-08 中国农业科学院棉花研究所 鉴定棉花闭花授粉材料的引物对、试剂盒以及方法
CN109880932A (zh) * 2019-04-25 2019-06-14 中国农业科学院棉花研究所 用于鉴别杂交棉品种中棉1279的ssr引物对及其产品以及鉴别方法
CN110055349A (zh) * 2019-05-24 2019-07-26 中国农业科学院棉花研究所 用于鉴定常规棉中棉所99001的引物组及其产品和检测方法

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